甲霜靈和生防菌Ｂ７０２對辣椒疫病聯(lián)合作用機制研究

劉合昌　牛贍光　李忠海　張淑靜　李　光

摘要：辣椒疫病是辣椒上的重要病害，由于辣椒疫病病原菌抗藥性日益嚴重，給我國辣椒生產(chǎn)造成極大影響，尤其是在辣椒老產(chǎn)區(qū)，該病影響造成減產(chǎn)30-50％，甚至絕產(chǎn)。本文就化學殺菌劑甲霜靈與生防菌B702混劑對辣椒疫病作用機制進行了研究，結(jié)果表明，甲霜靈和生防菌B702混劑對辣椒疫病的防治效果明顯優(yōu)于單劑，證明甲霜靈和生防菌B702確實有協(xié)同防治作用。為化學殺菌劑防治與生物農(nóng)藥相結(jié)合防治病害提供理論參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甲霜靈與生防菌B702；辣椒疫病；作用機制；研究

我國是辣椒生產(chǎn)大國，無論是鮮椒還是干椒，產(chǎn)量都位于世界前列。但近年來，由于辣椒疫病病原菌抗藥性日益嚴重，給我國辣椒生產(chǎn)造成極大影響，尤其是在我國辣椒老產(chǎn)區(qū)，因該病影響導致減產(chǎn)30-50％，甚至絕產(chǎn)。Katan等提出用化學藥物弱化病原菌后有利于生防菌的進攻，并以此作為綜合防治的一個重要方法。由于單純使用化學農(nóng)藥防治辣椒疫效病果很不理想，林相璀等便將化學殺菌劑與生防菌混合使用取得滿意效果，為了借鑒該方法防治其它植物病害，我們自對化學殺菌劑和生防微生物對感病植株的作用機理進行了探討，現(xiàn)報告如下。

1、材料與方法

1.1防治辣椒疫病藥效試驗

1.1.1供試材料：病原菌為辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici Leonian)SG-7，自壽光辣椒產(chǎn)區(qū)土壤中分離。芽孢桿菌B702，本所篩選菌株，菌劑由山東泰諾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)并提供。辣椒品種為“益都紅”，由山東省蔬菜研究所提供。

1.1.2供試藥劑：辣椒疫病生防菌劑：芽孢桿菌8702可濕性粉劑?；瘜W殺菌劑：25％甲霜靈(Methomyl，Met)。混劑：生防菌劑加甲霜靈。生防菌劑為50億/g，細度為150—200目，主要添加劑為硅藻土和20％的變形淀粉。當與化學殺菌劑混合制成混劑時，用量減半，另一半以25％的甲霜靈代替。劑型均為可濕性粉劑。

1.1.3培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200g煮沸10min，去渣濾液加入葡萄糖5g，瓊脂17-20g，加水至1000mL，pH為6.5；使用前每100mL培養(yǎng)基加10000單位氯霉素5mL，防止細菌污染。

1.1.4滅菌土：將取自濟南市郊仲宮鎮(zhèn)常年辣椒種植地土壤，一部分在160℃下干熱滅菌2h，另一部分不滅菌。

1.1.5菌土準備：將辣椒疫霉病菌(SG-7)接種于滅菌的PDA中，28℃左右培養(yǎng)3—4天，然后取出摻于土中，摻量為土重的2％，再澆水至相對濕度70％-80％即可播種。

1.1.6處理：試驗設(shè)Met+SG-7、B702+SG-7，Met+B702+SG-7、SG-7和不添加任何菌株或藥物(Health)，共5個處理。

1.1.7處理方法：苗期：先將辣椒種用45℃水浸泡20min，然后在常溫下繼續(xù)浸泡24h，撈出并瀝去多余水分，28℃左右催芽。當種子露白時按種子量的2％用上述藥劑拌種，稍加晾干后播于盆中，每盆25粒。重復4次，對照為變形淀粉和硅藻土拌種。

1.2菌藥混劑防治辣椒黃萎病機制

1.2.1紫外吸收法測定各處理辣椒可溶性蛋白質(zhì)含量參見周順伍(1989)方法，可溶性蛋白質(zhì)濃度可利用待測溶液在280nm和260nm波長處吸收值的差計算。

蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)=1.45OD₂₈₀-0.74OD₂₆₀

1.2.2過氧化物酶活性測定原理：根據(jù)Kochba方法(1977)，植物過氧化物酶在H₂O₂存在下，能使愈創(chuàng)木酚生成茶色物質(zhì)，該物質(zhì)在470nm波長處有最大吸收峰，此峰具有穩(wěn)定的特征值，所以用來進行定性或定量測定。

過氧化物酶的提?。号渲凭彌_液，0.05MolTris-HC1(pH7.4)然后在0℃預冷48h；各處理的辣椒葉片各取2.000g，加人預冷的上述緩沖液4ml，在冰浴條件下用研缽研磨勻漿，再用14000r/min離心機離心10min，上清液即為過氧化物酶提取液。

過氧化物酶活性分析：根據(jù)Kochba方法(1977)，以每分鐘光密度變化值表示酶的活性大小。單位以△OD47⁰/min.μg.protein表示。

1.2.3 SOD酶活性比較酶液的提取：分別取六個處理的辣椒葉片2.000g，加入預冷(0℃)的50mMol/L的磷酸緩沖液(KH2P04-NaOH pH7.8)2ml，緩沖液內(nèi)含0.1MolEDTA和1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。在冰浴中用研缽研磨勻漿。然后用高速離心機以14000r/min離心10min，上清液即為SOD酶提取液。

酶活性分析：根據(jù)邵從本[3]、StewartandR C，BewtyJ D方法。

配制反應混合液(3ml)：50mMol磷酸緩沖液(KH2P04-NaOH pH7.8)，13mMol甲硫氨酸，75uMolNBT，100nMol EDTA，2uMol核黃素(VB，)。有酶液加樣時，應先加入60ul酶液(不加酶液應加入60ul水)，最后再加入核黃素。搖勻后，先在28℃的恒溫光化反應箱中保溫10min，再用光(2×20W熒光燈，光強為4000lux，高度30cm，反應室用錫箔紙襯里)照射15min停止。拿到752型紫外光柵分光光度計(山東高密分析儀器廠制造)以各處理的沒有照光的反應混合液(含酶液)為參比，在560nm測各處理光照后的消光值，另測沒有加酶液的混合液消光值。

SOD酶活性計算：根據(jù)Giannopolitis等(1977)結(jié)果，在15min內(nèi)SOD酶液的吸光值以5min增加0.100吸光值單位(0.1000D560/5min)，且成線性關(guān)系，因此SOD的活性計算時的測定值也以15min為好。根據(jù)Beauchamp和Fridovich(1971)將抑制50％NBT所需的酶量定為1個SOD活性單位(unit)。由反應被SOD抑制的百分率來計算SOD的酶量。根據(jù)Asada等建立的方程式，則SOD活性可表示為：[SOD](U/mg.protein)=(V-V)/v/C/m V：沒有SOD時混合液的反應速率，v：有SOD時混合液的反應速率；C：每毫升SOD提取液中蛋白質(zhì)含量(mg)；m：反應混合液加入的酶提取液的量(mg/ml)

2、結(jié)果分析

2.1室內(nèi)藥劑及生防菌對辣椒疫病的防治效果盆栽試驗結(jié)果表明(表1)，甲霜靈和生防菌B702的防治效果相當，但兩者都明顯低于兩者混合制劑對辣椒疫病的防治效果，說明甲霜靈和生防菌B702確實有協(xié)同防治作用。

2.2化學藥物和生防菌對辣椒抗逆性生理的影響

2.2.1 B702與化學藥物對辣椒抗過氧化系統(tǒng)的作用

2.2.1.1甲霜靈等對辣椒過氧化物酶的影響

植物葉片中過氧化物酶(peroxidase)是植物中普遍存在的酶類，主要有抗壞血酸過氧化物酶、cyt C過氧化物酶、NADH過氧化物酶、非專一性過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶等(Salin，1988)。其中非專—性過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶存在于大多數(shù)植物中。該酶系主要生理功能是清除H₂O₂和R(HO)₂，以減輕這些物質(zhì)對機體的損害(Salin，1988，方允中等，1989)。

2.2.2.2過氧化物酶酶活性分析

從表2中可以明顯地看出，5個處理的差異非常顯著，健康植株的反應速率都比病株4號的高。用甲霜靈處理的兩個樣本1號和3號酶的活力最高，其酶活速率依次為71.48△POD/min.mg.protein和54.83 APOD/min.mg.protein，分別是4號的5.73倍和4.39倍。而且還可以看出，B702對過氧化物酶的增加沒有明顯作用，因為其反應速率比健康的還要低，但可以說明一點，過氧化物酶對減輕病害是有作用的，這可以從4號純SG-7處理的病株結(jié)果中得出結(jié)論，其反應速率最低僅為L2.48 △ POD/min.mg.protein。另一值得注意的問題是，健康的植株含可溶性蛋白質(zhì)比病株低，而病株可溶性蛋白質(zhì)含量則高達1001.45mg/mL。

2.2.3 B702等對辣椒超氧化物歧化酶的影響

2.2.3.1超氧化物歧化酶活性分析

從表中不難發(fā)現(xiàn)，不同處理間超氧化物歧化酶活性與過氧化物酶的表現(xiàn)是不一樣的。甲霜靈對SOD活性沒有誘導作用。甲霜靈處理的植株其活性反應速率與病株差異不顯著。而B702SOD的活性最強，為359.63。5號最弱，僅為191.82。從1、2、3號的活性數(shù)值可以看出，SOD的活性似乎與病害防治無關(guān)，但仔細分析就會發(fā)現(xiàn)，SOD活性與植株是否為病株有很大關(guān)系。首先，健康植株5號的SOD活性最低，而接種過SG-7經(jīng)過防治的健康植株和病株SOD活性都明顯高于處理5。這說明病害能夠誘導SOD活性增強，而其它非致病菌也可以誘導SOD活性增加，而B702不僅不是致病菌而且還是生防細菌，其對誘導SOD酶的活性增加有著雙重的意義。

3、討論

無論是化學殺菌劑，還是微生物活體殺菌劑，不僅能夠直接殺死或抑制病原菌，同時對植物的生理也有不同程度影響，說明藥物作用機制的復雜性。許多研究都表明，過氧化物酶(peroxidase，簡稱POD)和超氧化物歧化酶(summxide dismutase，簡稱SOD)等是組成防御植物細胞機能受破壞的主要酶系統(tǒng)。該酶系統(tǒng)與非酶類植物內(nèi)源物質(zhì)Vc和Ve等共同起作用來維持生物活性氧的代謝，提高植物的抗逆性。(Halliwell，1987；Wise，1987l Larson，1988)。朱荷琴等(1994)認為，SOD和POD與棉花對黃萎病抗性密切相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)，棉花受病菌危害脅迫而未感病時，感病品種的SOD和POD酶活比耐病品種提高，可溶性蛋白質(zhì)比耐病品種低。通過了解化學殺菌劑和生防微生物對感病植株的抗氧化系統(tǒng)的影響，對解決目前的生產(chǎn)實際問題是極有意義的，同時也為用化學農(nóng)藥結(jié)合生物防治其它植物病害提供了理論參考依據(jù)。

作者單位：山東省濱州市農(nóng)業(yè)局山東省林科院生物藥物研究所山東省農(nóng)科院蔬菜所