不同持續(xù)時(shí)間低氧后訓(xùn)練對(duì)大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響

張沙駱　瞿樹林　陳嘉勤

（1.長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南師范大學(xué)體育學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410012）

摘 要：目的：觀察不同持續(xù)時(shí)間低氧后訓(xùn)練對(duì)大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響，探討低氧訓(xùn)練對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，為科學(xué)地指導(dǎo)運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行低氧訓(xùn)練提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，正常對(duì)照組（A組），低氧8 h組（B組），低氧12h組（C組），訓(xùn)練對(duì)照組（D組），低氧8 h訓(xùn)練組（E組），低氧12 h訓(xùn)練組（F組）。采用零坡度跑臺(tái)的訓(xùn)練方式，對(duì)D、E和F三組以25 m/min的速度在常氧環(huán)境中每天訓(xùn)練1 h。將B、C、E和F組放入低氧艙內(nèi)，氧濃度為12.5%（相當(dāng)于4 000 m海拔高度），過(guò)8 h和12 h后，分別將B、E組和C、F組取出放入正常氧濃度環(huán)境。訓(xùn)練共持續(xù)4周，每周5 d。最后一次訓(xùn)練至力竭后24 h斷頭處死，取大鼠海馬組織，測(cè)定Bax和Bcl2蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)和凋亡指數(shù)。研究結(jié)果顯示：在低氧訓(xùn)練過(guò)程機(jī)體對(duì)低氧刺激的適應(yīng)性改變，使得在停止運(yùn)動(dòng)后，海馬組織的損害減小。隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，低氧訓(xùn)練使大鼠海馬組織CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡有減少的趨勢(shì)，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：不同持續(xù)時(shí)間；低氧訓(xùn)練；海馬；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：G804.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3612(2008)12-1644-05

On the Effect of Different Hypoxic Training Time in Hippocamus Apoptosis of Rats

ZHANG Sha瞝uo1, QU Shu瞝in2, CHEN Jia瞦in2

(1.Rehabilitation Medicine Department, Changsha Social Work College, Changsha 410004, Hunan China；2.Physical Education College, Hunan

Normal University, Changsha 410012, Hunan China)

Abstract:We examine the effect of hypoxic exercise to rats' hippocampus tissue

apoptosis, and the effect to hippocampus nerve apoptosis, which provide an experimental reference to scientific guidance of hypoxic exercise. We take 60 male SD rats, which are randomly distributed to 6 groups, 10 rats each, which are normal contrast group (Group A), hypoxia 8瞙our group (Group B), hypoxia 12瞙our group (Group C), training contrast group (Group D), hypoxia 8瞙our training group (Group E), hypoxia 12瞙our training group (Group F). Group D, E, F take 1 hour treadmill training in the rate of 25m/min in normal oxygen environment. Then we put B, C, E and F group into hypoxia cabin, oxygen concentration is 12.5% (equal to 4000m altitude), 8 and 12 hours later, put group B, E and C, F into normal oxygen concentration environment separately. This training lasts 4 weeks and 5 days each week. 24 hours after the last training to death, we take hippocampus tissue, proceeding with fixing and tissue embedding, using immunohistochemistry and TUNEL to measure its Bax, Bcl2 and apoptosis index. Conclusion: Increasing the duration of hypoxic period, hypoxic exercise training decrease the apoptosis of cells in rat's hippocampus tissue CA1, which protects the nerves. The hypoxic exercise is due to the change of body's adaptability to hypoxic stimulus. After exercise, the damage to hippocampus tissues also decreases.

Key words: different endurance time; hypoxic exercise; hippocampus; cell apoptosis

自“低氧訓(xùn)練”被提出至今，這種訓(xùn)練方法在競(jìng)技體育中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。低氧訓(xùn)練的研究始于血液成分^[1]的研究，之后關(guān)于心臟功能^[2]、肺通氣量^[3]、骨骼肌代謝^[4]等的研究都證明，低氧訓(xùn)練即利用低氧刺激，提高機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)氧的能力。目前，許多研究者力圖從細(xì)胞和分子水平闡述低氧訓(xùn)練對(duì)機(jī)體的影響，并逐步使之成為一個(gè)新的研究方向。

由于腦所需能量的85％～95％來(lái)自葡萄糖的有氧代謝，而氧氣和葡萄糖在腦內(nèi)的貯存幾乎為零，所以腦對(duì)缺氧缺血的耐受性很差。其中，對(duì)缺血缺氧最為敏感的海馬神經(jīng)細(xì)胞，會(huì)受到更大的影響。海馬是一個(gè)補(bǔ)充性運(yùn)動(dòng)區(qū)，有著軀體定位關(guān)系。海馬還可通過(guò)下丘腦調(diào)控垂體的內(nèi)分泌功能。海馬在學(xué)習(xí)和近期記憶過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，刺激海馬還可引起某些行為改變，如好靜，冷漠及主動(dòng)性喪失等^[5]。

在運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體各部分組織血液供應(yīng)會(huì)重新分配，大量的血液會(huì)供給骨骼肌，以維持運(yùn)動(dòng)時(shí)的供血。在這種情況下，腦組織不可避免地受到缺血缺氧的刺激。當(dāng)運(yùn)動(dòng)停止后，腦組織恢復(fù)供血，這從形式上類似于缺血再灌注的過(guò)程。已有大量文獻(xiàn)證明，缺血再灌注對(duì)海馬組織細(xì)胞凋亡產(chǎn)生很大的影響，甚至?xí)鸸δ芷茐?，組織壞死等^[6]。在低氧訓(xùn)練時(shí)，機(jī)體還要承受外界的低氧環(huán)境，那么，腦組織又將如何適應(yīng)其變化？低氧訓(xùn)練是會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)還是抑制腦組織的細(xì)胞凋亡？腦組織細(xì)胞凋亡與不同低氧訓(xùn)練刺激時(shí)間的關(guān)系是怎樣？對(duì)于這些問(wèn)題，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

8周齡雄性SD大鼠，體重（200±10）g，共60只（許可證號(hào)：scxk(湘)2003-0003），為Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)（大鼠及喂養(yǎng)的飼料均購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部）。實(shí)驗(yàn)條件：室溫20～24℃，相對(duì)濕度45%～55%，每天光照12 h，自由飲食、飲水。大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分組情況見(jiàn)表1。

本實(shí)驗(yàn)以黃麗英等^[7]低氧訓(xùn)練模型為依據(jù)，采用零坡度跑臺(tái)的訓(xùn)練方式，對(duì)D、E和F三組以25 m/min的速度在常氧環(huán)境中每天訓(xùn)練1 h。將B、C、E和F組放入低氧艙內(nèi)，氧濃度為12.5%（相當(dāng)于4 000 m海拔高度），過(guò)8 h和12 h后，分別將B、E組和C、F組取出放入正常氧濃度環(huán)境。訓(xùn)練共持續(xù)4周，每周5 d。最后一次訓(xùn)練至力竭后24 h處死（力竭評(píng)判方法：連續(xù)予大鼠施加聲、光、機(jī)械刺激后，大鼠不能繼續(xù)跑動(dòng)，下跑臺(tái)后伏地喘息，暫時(shí)無(wú)逃避反應(yīng)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

速眠新Ⅱ?yàn)檐娛箩t(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，Bcl-2、Bax和TUNEL試劑盒由Santa Cruz

Biotechnology，INC.研制生產(chǎn)，二抗檢測(cè)試劑、血清和DAB顯色劑由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 標(biāo)本制備

4周后處死A組；B組和C組最后一次低氧后24 h即刻分別處死；最后一次訓(xùn)練至力竭后24 h即刻處死D組、E組和F組。采用速眠新Ⅱ（0.8～1.2 mL/kg）腹腔注射，麻醉至理想斷頭處死，取出前囪后3 mm至上丘平面間包含海馬的腦組織塊，用生理鹽水組織漂洗一下，置入4％多聚甲醛中固定，24 h后常規(guī)石蠟包埋待測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

1.4.1 蘇木精-伊紅染色（haematein, HE）

將5 μm海馬組織切片經(jīng)二甲苯浸泡，5 min×3次；入100％、95％、85％乙醇梯度復(fù)水，各級(jí)2 min；蒸餾水沖洗2 min；放入蘇木精染液染色15 min；自來(lái)水沖洗15 min；放入1%鹽酸乙醇液中分化；自來(lái)水流水中沖洗約15 min；放入蒸餾水中漂洗一次；用0.5％伊紅染液染色5 min；再依次經(jīng)70％、85％、95％、100％酒精脫水，各級(jí)為2 min；再經(jīng)二甲苯浸泡，5 min×2次；烤片；封片。

用Motic B5顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行拍照(40×10倍)，記錄病理變化情況并計(jì)分。擬定炎細(xì)胞浸潤(rùn)或者脂肪變性為一級(jí)，計(jì)1分；發(fā)現(xiàn)有灶性壞死為二級(jí)，計(jì)2分；肉芽組織增生為三級(jí)，計(jì)3分，相加每組各樣本分?jǐn)?shù)，進(jìn)行比較分析。

1.4.2 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotydyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)

將5 μm海馬組織切片于二甲苯中浸泡2次，5 min/次；置于100%、95%、85%乙醇溶液中各2

min復(fù)水；自來(lái)水沖洗；蒸餾水沖洗2次，每次間隔5 min；PBS沖洗3次，每次間隔5 min；檸檬酸pH6.0先預(yù)熱3 min（350 w），放入切片（350 w），5 min到溫度80℃，加溫到95℃后維持5 min；3％H2O2室溫孵育10 min；蒸餾水沖洗2次，每次間隔5 min；PBS沖洗2次，每次間隔5 min；試劑準(zhǔn)備：從2號(hào)瓶中取出100 μL至兩個(gè)陰性對(duì)照組，將1號(hào)瓶中取出50

μL加入到2號(hào)瓶中，混合后正好是500 μL并蓋上蓋玻片，放入滴加甘油的濕盒中，37℃孵育1

h；PBS沖洗3次，每次間隔5 min；加入轉(zhuǎn)化劑POD試劑37℃30 min并蓋上蓋玻片，37℃孵育30 min；PBS沖洗3次，每次間隔5 min；DAB顯色5 min；自來(lái)水沖洗；蘇木素復(fù)染4 min；自來(lái)水沖洗；1%鹽酸酒精分色梯度酒精脫水：自來(lái)水沖洗；烤片；封片。

在普通光學(xué)顯微鏡觀察，陽(yáng)性凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕色或棕褐色著染，部分胞漿也可因胞核DNA碎片溢出而呈陽(yáng)性著染;正常非凋亡細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成藍(lán)色，核相對(duì)較大，形態(tài)大小一致。每張切片光鏡(40×10倍)觀察10×500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中的平均陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)，即凋亡指數(shù)。用Motic B5顯微攝像系統(tǒng)和MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像計(jì)數(shù)。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色

將5 μm海馬組織切片于二甲苯5 min×2次；置于100%、95%、85%乙醇中各2 min復(fù)水；自來(lái)水沖洗；3%H2O2室溫孵育10 min；蒸餾水沖洗；PBS浸泡5 min；將切片浸入檸檬酸酸鹽抗原修復(fù)液（pH6.0）后放入微波爐中加熱15 min，間斷2 min后，再加熱5 min；室溫冷卻后經(jīng)PBS沖洗，5 min×3次；正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去；滴加一抗（Bcl-2和Bax均為1∶50）；4℃濕盒過(guò)夜；次日取出恢復(fù)室溫后，PBS沖洗5 min×3次；滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次；DAB顯色5 min；自來(lái)水沖洗；蘇木素復(fù)染4 min；自來(lái)水沖洗；1%鹽酸酒精分色：自來(lái)水沖洗；烤片；封片。

在光學(xué)顯微鏡(40×10倍)下每張切片隨機(jī)觀察6個(gè)視野，用Motic B5顯微攝像系統(tǒng)和MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像分析，統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積均為15 554 584.02 μm²。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用析因設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平取α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色。A組SD大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)數(shù)層錐體神經(jīng)元，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊緊密；其它各組中，從形態(tài)學(xué)觀察有不同程度的病理改變，如海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞體急劇變小等現(xiàn)象，以此判斷可能有細(xì)胞凋亡的發(fā)生。D組的病理改變最為明顯其排列散亂，層次不完整，稀疏分布不均勻，其細(xì)胞腫脹，核染色體染成很淡的藍(lán)色甚至有些細(xì)胞消失（圖1）。大鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色結(jié)果采用分級(jí)計(jì)分的方式進(jìn)行了比較分析(表2)。

2.2 海馬組織CA1區(qū)TUNEL結(jié)果

運(yùn)用TUNEL進(jìn)行標(biāo)記，凋亡細(xì)胞形態(tài)呈圓形或橢圓形。凋亡細(xì)胞核呈棕色或棕褐色著染，形態(tài)呈碎點(diǎn)狀，不規(guī)整，大小不一致。正常非凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染呈藍(lán)色，核相對(duì)較大，形態(tài)大小較為一致(圖2)。

通過(guò)計(jì)算凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，A組的凋亡指數(shù)極低為1％。B組和C組的凋亡指數(shù)依次增高，分別為18％和25％。D組的凋亡指數(shù)最高，高達(dá)32％。E組和F組的凋亡指數(shù)又依次降低，分別為20％和15％。

2.3 海馬組織CA1區(qū)免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.3.1 海馬組織CA1區(qū)Bax免疫組織化學(xué)結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，Bax的表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，胞漿和胞核均有著色。A組僅有少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。在B組和C組中，陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)和排列緊密程度隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐一增高，而E組和F組的變化規(guī)律與之相反。D組的陽(yáng)性細(xì)胞最為集中密集分布(圖3)。

訓(xùn)練組與不訓(xùn)練組的大鼠海馬組織CA1區(qū)Bax陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.696，P<0.01），訓(xùn)練組高于不訓(xùn)練組；不同持續(xù)時(shí)間低氧組的Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.888，P<0.01），經(jīng)兩兩比較，低氧12 h組高于低氧0 h組和低氧8 h組；不同持續(xù)時(shí)間低氧后訓(xùn)練組的Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=209.975，P<0.01），隨著低氧持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，Bax的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有下降趨勢(shì)，訓(xùn)練和低氧兩因素間存在交互作用(表3、4、5)。

2.3.2 大鼠海馬組織CA1區(qū)Bcl-2免疫組織化學(xué)結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，Bcl-2的表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，胞漿和胞核均有著色。A組表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和顏色相對(duì)其他組而言都比較多。在B組和C組中，陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)和排列緊密程度隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐一降低，而E組和F組的變化規(guī)律與之相反。D組的陽(yáng)性細(xì)胞最為稀疏分布(圖4)。

訓(xùn)練組與不訓(xùn)練組的大鼠海馬組織CA1區(qū)的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.916，P<0.05），不訓(xùn)練組高于訓(xùn)練組；不同持續(xù)時(shí)間低氧組的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.892，P<0.05），經(jīng)兩兩比較，低氧12 h組低于低氧0 h組；不同持續(xù)時(shí)間低氧后訓(xùn)練組的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.398，P<0.01），隨著低氧持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，Bcl-2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有上升趨勢(shì)，訓(xùn)練和低氧兩因素間存在交互作用(表6、7、8)。

2.3.3 大鼠海馬組織CA1區(qū)Bcl-2/Bax結(jié)果

訓(xùn)練組與不訓(xùn)練組的大鼠海馬組織CA1區(qū)的Bcl-2/Bax陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)比值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=112.050，P<0.01），不訓(xùn)練組高于訓(xùn)練組；不同持續(xù)時(shí)間低氧組的Bcl-2/Bax陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)比值之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=115.535，P<0.01），經(jīng)兩兩比較，低氧8 h組和低氧12 h組低于低氧0 h組；不同持續(xù)時(shí)間低氧后訓(xùn)練組的Bcl-2/Bax陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)比值之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=366.727，P<0.01），隨著低氧作用的時(shí)間延長(zhǎng)，Bcl-2/Bax陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)比值有上升趨勢(shì)，訓(xùn)練和低氧兩因素間存在交互作用(表9、10、11)。

3 分析與討論

細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的由基因決定細(xì)胞自我破壞的過(guò)程，并受到嚴(yán)格的由遺傳機(jī)制決定的程序性調(diào)控^[8]。細(xì)胞內(nèi)的基因直接控制著細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，細(xì)胞外部因素通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響這些基因的表達(dá)或其表達(dá)產(chǎn)物的活化，從而間接地調(diào)控細(xì)胞凋亡^[9]。細(xì)胞凋亡是消除體內(nèi)衰老細(xì)胞群的機(jī)制之一，其伴隨著機(jī)體的成熟與衰老。

Bcl-2蛋白家族直接控制著線粒體外膜通透性的改變，是神經(jīng)元死亡調(diào)控機(jī)制中最關(guān)鍵的蛋白家族之一^[10]。但Bcl-2不能單獨(dú)作用抑制細(xì)胞凋亡，其活性受相關(guān)蛋白Bax的調(diào)節(jié)。Bax是Bcl-2家族中最重要的死亡促進(jìn)基因，Bax基因的作用是拮抗Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用必須通過(guò)與Bax形成異源二聚體（Bcl-2- Bax）來(lái)實(shí)現(xiàn)。而Bax形成同源二聚體（Bax-Bax）則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡^[11]。Bcl-2蛋白和Bax的比值決定細(xì)胞是存活還是凋亡，Bcl-2/Bax比值高，細(xì)胞存活率高，反之，細(xì)胞凋亡率高^[12]。

3.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)海馬組織細(xì)胞凋亡的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)4周耐力訓(xùn)練再力竭運(yùn)動(dòng)后，訓(xùn)練組海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)較不訓(xùn)練組高，而Bcl-2的表達(dá)較不訓(xùn)練組低，Bcl-2/Bax比值較不訓(xùn)練組明顯下調(diào)，凋亡細(xì)胞數(shù)增多。在運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體各部分組織血液供應(yīng)會(huì)重新分配，大量的血液會(huì)供給骨骼肌，以維持運(yùn)動(dòng)時(shí)的供血。在這種情況下，對(duì)于腦及其它組織而言，不可避免地遭受缺血缺氧。在運(yùn)動(dòng)停止后，大腦組織再次經(jīng)歷血液重新分配，這從形式上類似于缺血再灌注的過(guò)程。目前研究發(fā)現(xiàn)，缺血腦組織的迅速再灌注對(duì)正常功能的恢復(fù)至關(guān)重要。然而這種血流恢復(fù)反而會(huì)引起可逆受損細(xì)胞的進(jìn)行性破壞，即再灌注損傷問(wèn)題，導(dǎo)致缺血組織損傷惡化，如較缺血組而言，增加了梗死面積和體積^[13]。這種再灌注損傷由多種原因引起，與氧化損害密切相關(guān)，但具體機(jī)制仍不明確。研究表明，再灌注損傷的機(jī)制主要集中于啟動(dòng)自由基連鎖反應(yīng)，氧自由基可通過(guò)引起細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、損傷DNA分子或者調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而過(guò)度形成導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷^[14]。

許多研究證實(shí)神經(jīng)元在經(jīng)歷了缺血再灌注后，在缺血敏感區(qū)會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，如海馬CA1區(qū)出現(xiàn)的延遲性神經(jīng)元死亡，其表現(xiàn)出明顯的凋亡特征，如核固縮，DNA片斷化，膜泡化等，并可檢測(cè)到凋亡特征性DNA梯狀條帶^[15]。腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元凋亡的發(fā)生與缺血的方式、嚴(yán)重程度、再灌注時(shí)間的長(zhǎng)短等因素有關(guān)^[16]。雖然目前對(duì)于細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白出現(xiàn)和消亡的時(shí)間結(jié)果報(bào)道不一，但都基本認(rèn)為，在再灌注24 h后，Bcl-2和Bax的表達(dá)均可達(dá)到高峰，并也伴隨著大量的細(xì)胞凋亡，提示在此時(shí)損傷較為嚴(yán)重^[17]。

3.2 低氧對(duì)海馬組織細(xì)胞凋亡的影響

在低氧環(huán)境中，機(jī)體乳酸生成增多，使紅細(xì)胞脆性增加，破壞增多；但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，由于機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)低氧環(huán)境產(chǎn)生一系列適應(yīng)，如增加了RBC數(shù)目、Hct和Hb含量等，這些指標(biāo)的上升反映機(jī)體攜氧能力的提高^[18]。由此推測(cè)，在進(jìn)入常氧環(huán)境后的，機(jī)體在安靜狀態(tài)下的攜氧能力提高，進(jìn)入組織的氧增多，這必然導(dǎo)致氧自由基生成增多。由于神經(jīng)元細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)均為脂質(zhì)膜，使得組織細(xì)胞更易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而造成損傷^[19]。

研究證明，高濃度氧導(dǎo)致神經(jīng)元超級(jí)微結(jié)構(gòu)損傷。高氧3 d后，神經(jīng)元的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體開(kāi)始出現(xiàn)損傷性變化，隨著處置次數(shù)增加，損傷逐漸加重，由腫脹到膜結(jié)構(gòu)明顯破壞，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡、脂粒，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒^[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，經(jīng)4周氧濃度為12.5%（相當(dāng)于4 000 m海拔高度）后，低氧0 h組、低氧8 h組和低氧12 h組大鼠海馬CA1區(qū)的Bax之間比較，且隨著低氧持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)越高；Bcl-2的表達(dá)隨著低氧持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比例隨著低氧持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)明顯下調(diào)，凋亡細(xì)胞數(shù)增多。

3.3 低氧訓(xùn)練對(duì)大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響

本研究結(jié)果表明，4周低氧訓(xùn)練后，隨著低氧持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，訓(xùn)練對(duì)照組、低氧8 h訓(xùn)練組和低氧12 h訓(xùn)練組海馬組織CA1區(qū)的Bax表達(dá)依次增高，而Bcl-2表達(dá)和Bcl-2/Bax比值依次降低，凋亡細(xì)胞數(shù)隨低氧持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)有減少的趨勢(shì)，推測(cè)這種現(xiàn)象是由于機(jī)體對(duì)低氧刺激的適應(yīng)性改變，在低氧訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，機(jī)體的攜氧能力較單純運(yùn)動(dòng)組提高，當(dāng)然海馬組織的缺氧情況較運(yùn)動(dòng)組輕。這使得在停止運(yùn)動(dòng)后，再灌注的缺氧再?gòu)?fù)氧的變化幅度也比單純運(yùn)動(dòng)組小得多，海馬組織在這個(gè)過(guò)程的損害也減小，表現(xiàn)為低氧8 h訓(xùn)練組和低氧12 h訓(xùn)練組的細(xì)胞凋亡數(shù)較訓(xùn)練對(duì)照組表達(dá)均有降低，且隨著低氧適應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng)，有減少的趨勢(shì)。

在臨床醫(yī)學(xué)中，這種1次或多次短暫的輕度缺氧后，可觸發(fā)機(jī)體內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，對(duì)隨后發(fā)生的嚴(yán)重缺血缺氧產(chǎn)生耐受性的現(xiàn)象，稱為低氧預(yù)適應(yīng)^[21]。研究表明，將大鼠置于8％O2 3 h后再缺血再灌注組與單純的缺血再灌注組比較發(fā)現(xiàn)，從再灌注后6 h開(kāi)始到48 h，低氧預(yù)適應(yīng)組Bcl-2的表達(dá)顯著高于缺血再灌注組、Bax的表達(dá)顯著低于缺血再灌注組，且Bcl-2/Bax比值在48 h時(shí)，仍然處于較高水平，且Bcl-2/Bax比值的變化與神經(jīng)功能的恢復(fù)及對(duì)凋亡的抑制相關(guān)^[22]。Miller等^[23]報(bào)道，2 h的缺氧預(yù)適應(yīng)，可使其后缺血再灌注48 h的大腦中動(dòng)脈梗死面積減少46%～64%。這些報(bào)道說(shuō)明低氧預(yù)適應(yīng)可有效減少腦缺血再灌注后的腦損傷。低氧預(yù)適應(yīng)從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。這是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑的復(fù)雜過(guò)程，各種可能機(jī)制在神經(jīng)元凋亡中所占的比重及相互關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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