蜂膠對(duì)力竭游泳運(yùn)動(dòng)小鼠的免疫功能的影響

龐陽(yáng)康

摘要：目的：探討蜂膠對(duì)力竭游泳運(yùn)動(dòng)小鼠免疫功能的影響。 方法:38只小鼠隨機(jī)分為兩組蜂膠組和對(duì)照組，都進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練，蜂膠組采用0.1 mL／lOg·bw劑量的蜂膠給小鼠經(jīng)口灌胃30 d，分別測(cè)定免疫器官臟器／體重比值，進(jìn)行外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、外周血T細(xì)胞亞群（CD₈+%、CD₄+%、CD₄+/CD₈+）的測(cè)定。結(jié)果與對(duì)照組比較，蜂膠能明顯提高小鼠的CD₄+%、CD₄+/CD₈+、胸腺體重比值。 結(jié)論：蜂膠具有增強(qiáng)力竭游泳小鼠免疫力的作用。

關(guān)鍵詞：蜂膠; 力竭游泳運(yùn)動(dòng);免疫

中圖分類號(hào)：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3612(2008)03-0353-03

免疫功能與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系越來(lái)越引起人們的重視，普遍認(rèn)為體育鍛煉可以提高機(jī)體的抗氧化能力提高免疫參數(shù)，增強(qiáng)機(jī)體吞噬細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞的活性，防止感染的發(fā)生［1］。但大量研究表明過(guò)度訓(xùn)練或運(yùn)動(dòng)會(huì)引起機(jī)體免疫功能下降。過(guò)度運(yùn)動(dòng)包含兩方面的意義：一是運(yùn)動(dòng)負(fù)荷超過(guò)機(jī)體的承受能力，機(jī)體在精神、能量方面的過(guò)度消耗，導(dǎo)致免疫機(jī)能下降；二是指機(jī)體在身體機(jī)能正常情況時(shí)所承受的運(yùn)動(dòng)量和強(qiáng)度，當(dāng)機(jī)體的某些機(jī)能發(fā)生改變時(shí)，如連續(xù)大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練時(shí)恢復(fù)手段無(wú)效、營(yíng)養(yǎng)不良、情緒突變和思想波動(dòng)等，使正常的負(fù)荷變成超量負(fù)荷，主動(dòng)運(yùn)動(dòng)變?yōu)楸粍?dòng)運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能下降［2］。因此，不同運(yùn)動(dòng)量對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響。因此尋找有效的方法防治過(guò)度訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫功能下降, 意義重大。

蜂膠是蜜蜂采集植物樹(shù)脂，并混入蜜蜂唾腺分泌物及蜂蠟、花粉等經(jīng)加工而成的一種粘稠物質(zhì)［3］。從藥學(xué)角度看，蜂膠是一味動(dòng)、植物雙性的中藥，芳香，味苦，酸、甘、平，含有蛋白質(zhì)、糖類、酶類、花粉、無(wú)機(jī)鹽類等。從化學(xué)結(jié)構(gòu)和成分來(lái)看，蜂膠含有20余類、300多種天然成份，其中包括30多種人體必需的微量元素、20種氨基酸、數(shù)埂種芳香化合物70多種黃酮類物質(zhì)，還有豐富的有機(jī)酸、菇烯類物質(zhì)、維生素、木脂體、酶類多糖等具有生物活性的天然成份［4］。近年來(lái)研究表明，盡管不同地區(qū)蜂膠化學(xué)成分相差很大，但是它們具有相似的生物學(xué)活性［5］。從生物學(xué)活性角度看蜂膠具有抗菌消炎、抗病毒、抗真菌、排除毒素、增強(qiáng)免疫力、軟化血管降低血脂、凈化血液、改善微循環(huán)、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能［6］。本文從生物學(xué)的角度研究了蜂膠對(duì)小鼠的免疫功能的影響。我們以小鼠游泳訓(xùn)練模型研究蜂膠對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠免疫器官、和相關(guān)免疫指標(biāo)的影響, 為蜂膠的研制、開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用50只體重(17.85±2.25)g，鼠齡8周，健康雄性昆明種小鼠（由廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），在安靜、室溫條件下喂養(yǎng)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，每天定時(shí)通風(fēng)。分籠飼養(yǎng)，鼠籠規(guī)格25 cm×15 cm×18 cm，每籠5 只，分組前進(jìn)行一次性游泳訓(xùn)練1 h，出現(xiàn)溺水或運(yùn)動(dòng)能力不足者予以剔除。篩選出的38只適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為兩組進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器小鼠恒溫游泳缸，超凈工作臺(tái)，電子分析天平（型號(hào)GS223，日本SHINKO新電子天平）流式細(xì)胞儀(Beckman coulter cell 型號(hào) Cell Lab Quanta SC)光學(xué)顯微鏡，恒溫箱，離心機(jī)，血紅蛋白吸管，眼科剪，普通剪刀等。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑及方法受試的蜂膠樣品來(lái)源于北京某蜂產(chǎn)品企業(yè)，其性狀為棕褐色油性膏狀物。試驗(yàn)時(shí)按所設(shè)劑量取樣品加植物油配制所需濃度，分別給受試動(dòng)物灌胃，灌胃體積為0.1 mL／lOg·bw，溶劑對(duì)照組給予等體積植物油，每天灌胃1次,一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束共60 d。其他還有三氯乙醛，肝素，生理鹽水等。

1．4實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?/p>

1.4.1動(dòng)物分組篩選后的動(dòng)物（38只小鼠）按體重隨機(jī)分為2組，常規(guī)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)時(shí)間為8 周，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練1 周，Ⅱ組即蜂膠組小鼠灌胃（ig）8周。Ⅰ組：對(duì)照組：選20 只小鼠，以生理鹽水0.1 mL/10 g/日灌胃。

1.4.2運(yùn)動(dòng)條件游泳缸直徑70 cm，水深40 cm，水溫30℃左右，密度50 cm2/只。

1.4.3運(yùn)動(dòng)方式Ⅰ、Ⅱ組均進(jìn)行負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使每只小鼠四肢不停運(yùn)動(dòng)，如果小鼠漂浮在水面停止活動(dòng)，可用木棒在其附近輕輕攪動(dòng)使之繼續(xù)活動(dòng)。負(fù)重方式：在小鼠尾部系上施加相當(dāng)于自身體重4%的負(fù)荷的鐵片。

1．4．4運(yùn)動(dòng)方案以1 周為1 單元，每只小鼠每周訓(xùn)練5 次，周末休息。Ⅰ、Ⅱ組：第1～3 d適應(yīng)性游泳30 min，第4～6 d每天遞增10 min 逐漸延長(zhǎng)至60 min，第7 d休息，然后每天以60 min 游泳1 次。適應(yīng)性訓(xùn)練1周后，對(duì)小鼠進(jìn)行力竭性游泳訓(xùn)練（在小鼠尾部附加相當(dāng)于自身體重4％的負(fù)荷），每天1次， 每周5次，持續(xù)8周。

1.4.5力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)按Dawson 法［7］1) 小鼠游泳動(dòng)作明顯失調(diào)（劃水頻率極其緩慢，連續(xù)下沉），不能再堅(jiān)持；

2) 沉入水底8 s不能回到水面；

1.5樣本采集于運(yùn)動(dòng)后即刻,用三氯乙醛腹腔麻醉,腹主動(dòng)脈取血3 mL,肝抗凝。靜置30 min后2 500轉(zhuǎn)/min離心10 min,取上清液體保存于小試管中, -20℃凍存待測(cè)。然后稱重后處死小鼠,取出胸腺和脾臟。

1.6指標(biāo)的測(cè)試和方法脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的測(cè)定:

分別采用稱重法, 測(cè)量?jī)x器為日本SHINKO新電子天平，型號(hào)GS223。具體方法: 稱量小鼠體重(g) 后處死小鼠,取出并稱量脾臟(mg) , 胸腺(mg) , 分別計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù), 脾指數(shù)= 脾重/體重(mg/ g) , 胸腺指數(shù)= 胸腺重/體重(mg/g)。

外周血WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定：

取20 μL全血，放入事先加好血細(xì)胞稀釋液試管（1∶200 稀釋），用Culltae MEK-6318K 血細(xì)胞分析儀（日本光電公司制造）測(cè)定WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)量。

T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定：

取25 μL肝素抗凝血，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠CD4或CDsMcAb(購(gòu)自美國(guó)Pharmingen公司)33 μL(pH7．2的PBS對(duì)倍稀釋)，混勻，事溫孵育30 min，加入750 μL雙蒸水于抗凝血中溶血，混勻后再加入750 μLpH7．2的PBS稀釋血液，流式細(xì)胞儀(Beckman coulter cell 型號(hào) Cell Lab Quanta SC)檢測(cè)小鼠外周血CD₄+T、CD₈+T淋巴細(xì)胞的百分率(各檢測(cè)5 000個(gè)細(xì)胞)，測(cè)定結(jié)果采用Cell Quest功能軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示,采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2．1蜂膠對(duì)小鼠外周血WBC 和淋巴細(xì)胞的影響由表1可見(jiàn)，單純訓(xùn)練組即對(duì)照組的大鼠外周血WBC和淋巴細(xì)胞數(shù)值與文獻(xiàn)參考值［7，8］相比較低，提示大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)可能造成免疫功能下降。補(bǔ)充蜂膠組的WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)值均接近文獻(xiàn)中的正常小鼠數(shù)值，但各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2蜂膠對(duì)小鼠外周血T細(xì)胞亞群的影響表2顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血CD₄+百分比、CD₄+/CD₈+與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著性差（P<0.05），而CD₈+百分比未出現(xiàn)明顯變化,提示長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷游泳訓(xùn)練能降低小鼠外周血CD₄+百分比和CD₄+/CD₈+比值, 從而抑制小鼠T細(xì)胞免疫功能, 蜂膠能提高運(yùn)動(dòng)小鼠外周血D4+百分比、CD₄+/CD₈+比值, 從而具有抵抗力竭游泳訓(xùn)練對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的抑制作用。

2．3蜂膠對(duì)小鼠的臟器/ 體重比值的影響

表3顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的脾臟/ 體重百分比無(wú)顯著差異。胸腺/ 體重百分比試驗(yàn)組出現(xiàn)了顯著增加，提示蜂膠可抵抗長(zhǎng)時(shí)間力竭游泳訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫器官的損傷。

3討論

現(xiàn)有大量研究已證實(shí)不同的運(yùn)動(dòng)對(duì)免疫系統(tǒng)的影響并不一致。反應(yīng)免疫系統(tǒng)變化的方法和指標(biāo)很多，主要免疫指標(biāo)包括免疫細(xì)胞、白介素、免疫球蛋白、細(xì)胞因子等［9］。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)和免疫的關(guān)系，目前的研究很多，得出的結(jié)論也各有不同，目前達(dá)成共識(shí)的是：適度的運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)機(jī)體免疫力,而過(guò)度或激烈運(yùn)動(dòng)則會(huì)產(chǎn)生較多自由基，進(jìn)一步降低機(jī)體免疫力。因此,如何減輕過(guò)度訓(xùn)練引致的機(jī)體免疫力下降、提高機(jī)體抗氧化的免疫功能成了研究熱點(diǎn)［10］。

胸腺和脾臟屬于機(jī)體免疫器官, 在T 細(xì)胞發(fā)育、成熟和T、B 細(xì)胞發(fā)揮免疫監(jiān)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明過(guò)量運(yùn)動(dòng)會(huì)損傷機(jī)體免疫器官, 導(dǎo)致脾臟和胸腺重量降低,并發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化, 使器官的免疫反應(yīng)降低。［11］本研究結(jié)果亦提示長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練會(huì)降低胸腺、脾臟重量, 而蜂膠可抵抗長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫器官的損傷。但我們的研究結(jié)果顯示蜂膠組的胸腺/體重比之增大，而脾臟/體重比值無(wú)明顯變化，相關(guān)機(jī)制尚不清楚?？紤]可能原因是8周月齡小鼠胸腺組織尚未退化，對(duì)蜂膠的刺激反應(yīng)強(qiáng)烈 ，而脾臟組織屬外周淋巴器官，其變化需要較長(zhǎng)時(shí)間用藥才能表現(xiàn)出來(lái)。

T 淋巴細(xì)胞按表型不同分為CD₄⁺ 、CD₈⁺兩大亞群, 根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同又分為I 型T 細(xì)胞(Thl 和Tcl ) 和Ⅱ型T 細(xì)胞(TH₂和Tc2) 兩大亞群［12］。大量研究表明過(guò)量運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致外周血CD₄⁺百分比和CD₄⁺ /CD₈⁺比值降低,從而抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)［13～15］。本研究結(jié)果亦提示長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練會(huì)降低機(jī)體外周血CD₄⁺百分比和CD₄⁺/CD₈+比值而對(duì)CD₈⁺百分比影響不大,可能與過(guò)量運(yùn)動(dòng)引起血漿皮質(zhì)醇和細(xì)胞因子IL-6的升高,從而刺激CD₄⁺細(xì)胞等有關(guān),我們的研究顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血CD₄⁺百分比、CD₄⁺/CD₈⁺與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著性差（P<0.05），而CD₈+百分比未出現(xiàn)明顯變化,提示長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷游泳訓(xùn)練能降低小鼠外周血CD₄⁺百分比和CD₄+/CD₈⁺比值,從而抑制小鼠T細(xì)胞免疫功能,蜂膠能提高運(yùn)動(dòng)小鼠外周血D₄⁺百分比、CD₄+/CD₈⁺比值,從而具有抵抗力竭游泳訓(xùn)練對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的抑制作用，需要指出的是。胸腺是產(chǎn)生免疫的中樞淋巴器官，使免疫細(xì)胞法分化的場(chǎng)所，主要功能是產(chǎn)生T細(xì)胞和分泌胸腺因子，發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，所以，蜂膠能提高運(yùn)動(dòng)小鼠外周血CD₄+百分比、CD₄⁺/CD₈⁺比值也和蜂膠可抵抗長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫器官的損傷，增加胸腺的百分比有關(guān)［16］。

對(duì)照組的大鼠外周血WBC和淋巴細(xì)胞數(shù)值與文獻(xiàn)參考值相比較低，提示大強(qiáng)度力竭運(yùn)動(dòng)可能造成免疫功能下降。補(bǔ)充蜂膠組的WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)值均接近文獻(xiàn)中的正常小鼠數(shù)值［7，8］，但各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。許多學(xué)者對(duì)不同訓(xùn)練后白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量的改變進(jìn)行了研究。一次急性訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)時(shí)間少于3 h，在中等強(qiáng)度和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中及運(yùn)動(dòng)后即刻，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)10％～20％不同程度的下降［17］，我們的研究也表示蜂膠能夠使WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)值在大強(qiáng)度訓(xùn)練后不至下降得過(guò)低。

目前，已從蜂膠中分離鑒定出的成分有黃酮類、萜烯類、醌類、酯類、醇類、酚類、醚類、有機(jī)酸和大量氨基酸、酶類、維生素B1、維生素H2、維生素B6、維生素E和維生素A以及礦物質(zhì)等。其中分離鑒定的黃酮化合物有30余種，包括白楊素、柚柏楊素、芹菜素、金合歡素、槲皮素、蘆丁、山奈酚等，蜂膠大部分的生理及藥理功能都與此類化合物有密切關(guān)系?；瘜W(xué)研究表明，產(chǎn)地不同的蜂膠盡管化學(xué)成分不同，但都不同程度地含有大量黃酮類化合物［18］。

有研究者用蜂膠乙醇提取液(其主要成分為蜂膠黃酮)給免疫力低下的小鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)能增強(qiáng)小鼠的抗體生成細(xì)胞活性，提高溶血素的含量，增強(qiáng)單核一巨噬細(xì)胞碳廓清能力［19］。由此，我們推測(cè)蜂膠增強(qiáng)小鼠免疫力可能是黃酮類物質(zhì)發(fā)揮了主要作用?？赡苁屈S酮類物質(zhì)作用于機(jī)體免疫器官一胸腺，刺激其產(chǎn)生T細(xì)胞，或是激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞 從而使其發(fā)揮免疫功能。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明蜂膠能增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫能力，和免疫器官所占百分比。李淑華等對(duì)免疫功能低下模型鼠細(xì)胞免疫功能的研究,用單克隆抗體技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠藥物處理前后T細(xì)胞總數(shù)及亞群變化,用MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖,結(jié)果顯示蜂膠能促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖,增加T細(xì)胞總數(shù)并調(diào)整T細(xì)胞亞群紊亂［１９］,證明EEP對(duì)免疫功能低下小鼠細(xì)胞免疫功能具有免疫刺激和調(diào)節(jié)作用。提示,大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練后運(yùn)動(dòng)員可以通過(guò)服用蜂膠來(lái)調(diào)節(jié)其T細(xì)胞亞群和增加T細(xì)胞總數(shù)以改善機(jī)體的免疫功能。

綜上所述 國(guó)內(nèi)外研究證明:蜂膠具有其本身沒(méi)有抗原性,但可起到免疫佐劑作用;可以增高丙種球蛋白的效應(yīng),激活巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力,提高血清溶血素(抗體積數(shù))含量,增加T細(xì)胞總數(shù),調(diào)整T細(xì)胞亞群紊亂;它既能增強(qiáng)抗體形成細(xì)胞的功能活性,促進(jìn)機(jī)體增加抗體產(chǎn)生,又能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力和自然殺傷細(xì)胞活性,具有免疫刺激和調(diào)節(jié)作用,提高機(jī)體的特異性和非特異性的免疫功能［2０］。我們的研究也證明了這一點(diǎn)，因此,在長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度訓(xùn)練或比賽期間運(yùn)動(dòng)員服用蜂膠會(huì)對(duì)改善其運(yùn)動(dòng)疲勞或過(guò)度疲勞后免疫功能有一定的效能或具有一定的輔助治療作用。

本文僅從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的的角度來(lái)探討其提高大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后免疫能力的可能機(jī)理,以起到拋磚引玉的作用。 但蜂膠的組成成分是一個(gè)非常復(fù)雜的復(fù)合體，要明確某種成分起何種生物學(xué)作用，還需要作大量的實(shí)驗(yàn)研究工作。至于其生物學(xué)作用機(jī)理，更是有待于進(jìn)一步探討。

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