中藥治療黃褐斑實驗研究進(jìn)展

黃褐斑（Melasma）是一種獲得性色素沉著性皮膚病，多發(fā)于中青年女性，病程頑固，嚴(yán)重影響患者美觀，給其精神和生活帶來諸多煩惱和痛苦。而中藥治療黃褐斑具有突出整體調(diào)節(jié)、副作用小、療效穩(wěn)定等優(yōu)點，故成為治療黃褐斑的有效理想途徑。從20世紀(jì)90年代開始，我國中醫(yī)藥工作者在中藥治療黃褐斑的實驗研究方面做了大量卓有成效的工作，新技術(shù)、新手段不斷被引入，新思路、新方法大量涌現(xiàn)。本文就近年來中藥治療黃褐斑的實驗研究方法綜述如下。

1臨床實驗研究

臨床為中藥實踐的大舞臺，中藥治療黃褐斑的實驗研究也是從臨床開始的。羅小光等[1]考察了燈盞花素與中藥內(nèi)服外敷聯(lián)合運用對女性黃褐斑患者血清性激素水平的影響，患者血清E2明顯下降，F(xiàn)SH、LH雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但低于對照組，T在療前療后均無顯著性變化，表明此種聯(lián)合治療方法可能是通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、平衡性激素水平而達(dá)到改善黃褐斑的目的。劉冬梅等[2]觀察腎陽不足型黃褐斑患者的發(fā)病機(jī)制并驗證養(yǎng)顏青娥丸的有效性及作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)顏青娥丸能提高腎陽不足型黃褐斑患者血清的超氧化物歧化酶(SOD) 活性并降低丙二醛(MDA)的活性和血清 E2的水平，從而降低酪氨酸酶活性，減少黑素的形成，使黑素的形成受到抑制而對黃褐斑產(chǎn)生療效。張琳等[3]采用雙盲法進(jìn)行沙棘斑婷含片改善黃褐斑的試驗，有效率為69.81%，受試者主觀感覺良好，血液生化指標(biāo)均正常。張紅梅等[4]進(jìn)行了沙棘清妍膠囊祛黃褐斑的實驗研究，總有效率60%，試驗前后受試者血常規(guī)、尿常規(guī)及血生化指標(biāo)均在正常范圍，對試驗者身體健康無明顯影響。

2動物實驗研究

黃褐斑藥理動物模型的研究也正在起步，研究方法有紫外光照射法、雌激素攻擊法等，但仍屬探索階段，至今尚無公認(rèn)可行的造模方法。潘揚等[5]用中波紫外線照射雌性白色豚鼠1個月，豚鼠皮膚黑素沉著增加，皮膚和肝臟的酪氨酸、MDA含量明顯升高，SOD含量降低，表明紫外線攻擊雌性白色豚鼠可作為黃褐斑的實驗動物模型。汪南玥等[6]采用黃體酮+紫外線+束縛復(fù)合法建立肝郁型黃褐斑小鼠模型，給小鼠注射黃體酮，同時進(jìn)行慢性束縛和紫外線局部照射，較其他方法更能導(dǎo)致皮膚MDA升高和 SOD降低以及皮膚黑素細(xì)胞的增加，并且具有肝郁證的行動學(xué)表現(xiàn)，模型獲得成功。王志國等[7]用黃體酮攻擊雌性小鼠復(fù)制黃褐斑實驗動物模型，探討蝴蝶霜治療黃揭斑的作用機(jī)理，證明蝴蝶霜能提高局部皮膚組織中SOD活性和羥脯氨酸含量，降低乳過氧化物酶(LPO)和脂褐質(zhì)含量，消除多余自由基，從而抑制黃褐斑的產(chǎn)生。金道山等[8]采用老年雌性大鼠為實驗動物模型，觀察大豆異黃酮軟膠囊治療黃褐斑與其抗氧化能力間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮軟膠囊能提高大鼠血及肝組織中SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量，提示大豆異黃酮軟膠囊治療黃褐斑與其抗氧化能力間有密切關(guān)系。李洪武等[9]選定體外對酪氨酸酶活性有顯著抑制作用的中藥，應(yīng)用棕黃色豚鼠UVB照射誘導(dǎo)皮膚色素沉著實驗動物模型，觀察外用中藥后黑素細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的改變，結(jié)果白術(shù)、茯苓、山茱萸等中藥組多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)及含黑素顆粒細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少，對UVB誘導(dǎo)的色素沉著具有抑制作用；又選擇對酪氨酸酶活性和皮膚黑素生成均具有顯著抑制作用的中藥制成乙醇提取液，UVB照射后外用于豚鼠背部皮膚，采用半定量RT-PCR檢測藥物干預(yù)前后豚鼠皮膚中酪氨酸酶mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示茯苓、白術(shù)能在基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)酪氨酸酶RNA表達(dá)，抑制酶蛋白的生物合成 [10]。

3酪氨酸酶抑制實驗

通過研究中藥對黑素生物合成過程中的關(guān)鍵酶—酪氨酸酶的激活或抑制作用，為中藥治療黃褐斑提供選擇。酪氨酸酶(TYR)是皮膚黑素生物合成的主要限速酶，控制其活力即可控制黑素生成量。李艷莉等[11]測定6種中藥對酪氨酸酶活性的抑制率，白芷、白附子、當(dāng)歸、云苓、蒺藜、銀杏葉對酪氨酸酶活性的抑制率分別為35.14%、55.86%、30.63%、21.62%、54.46%、39.29%，白附子對酪氨酸酶活性抑制作用最強。夏蕾等[12]用電腦篩選出高頻次治療色素增加性皮膚病的中藥，研究其對酪氨酸酶的活性影響，發(fā)現(xiàn)白術(shù)、白僵蠶、藁本、白芨、白附子等15味中藥有使酪氨酸酶活性增加的作用；治療色素性皮膚病最常用的復(fù)方中藥中，六味地黃丸、補中益氣湯、復(fù)方金匾腎氣丸及茯苓、山藥、山茱萸能使酪氨酸酶活性降低，柴胡舒肝湯、白蝕丸復(fù)方及熟地黃、牡丹皮能使得酪氨酸酶活性增加；單體18-甘草酸雙氨鹽、蘆薈素、肉桂酸、苦參堿對酪氨酸酶活性和黑素形成有抑制作用。雷鐵池等[13]對中醫(yī)治療色素增加性皮膚病方劑69首進(jìn)行計算機(jī)拆方排序，選出高頻次出現(xiàn)中藥82味，觀察這些中藥乙醇提取物對蘑菇酪氨酸酶和無細(xì)胞系統(tǒng)多巴色素自動氧化生成黑素量的影響；結(jié)果顯示11味中藥乙醇提取物在3個不同濃度對酪氨酸酶活性和黑素生成量呈劑量依賴性抑制，其中白術(shù)、白僵蠶、藁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿葉對酪氨酸酶活性抑制率與單體化合物熊果苷無統(tǒng)計學(xué)差異；進(jìn)一步研究這些中藥的皮膚脫色機(jī)制及評估其臨床應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)白術(shù)、茯苓等體外可顯著抑制蘑菇酪氨酸酶活性。還有學(xué)者認(rèn)為部分中藥對酪氨酸酶（TYR）有雙向調(diào)節(jié)作用，許振毅等[14]發(fā)現(xiàn)高濃度蘆薈大黃素和低濃度大黃次酸對TYR的抑制率分別為54%和55%，低濃度的蘆薈大黃素和高濃度的大黃次酸對TYR活性可提高至70%和81%。

4對黑素細(xì)胞影響的研究

黑素細(xì)胞是一種腺細(xì)胞，黑素是其分泌產(chǎn)物，為吲哚和醌與蛋白質(zhì)結(jié)合的高分子聚合物。

4.1 對小鼠黑素瘤細(xì)胞影響的研究：B-16黑素瘤細(xì)胞株的基本結(jié)構(gòu)，特別是黑素合成功能與人正常的皮膚黑素細(xì)胞基本一致，在人體原代皮膚黑素細(xì)胞培養(yǎng)非常困難的情況下，國外化妝品生產(chǎn)企業(yè)的科研單位，在篩選美白祛斑劑的過程中，廣泛采用該細(xì)胞株作為美白化學(xué)物功效測定的受試細(xì)胞。雷鐵池等[15]通過B-16小鼠黑素瘤細(xì)胞對幾種美白化學(xué)物進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)，熊果苷可明顯抑制黑素合成。李玲等[16]利用B-16小鼠黑素瘤細(xì)胞研究顯示，熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氫醌酯均可抑制黑素細(xì)胞的生長和黑素合成，具有一定的美白效果，其機(jī)制可能不僅僅與酪氨酸酶活性有關(guān)。周婧等[17]研究表明，小鼠B-16 黑素瘤細(xì)胞經(jīng)槲皮素作用后，細(xì)胞內(nèi)TYR mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，活性增強，進(jìn)而黑素合成增多；槲皮素濃度＜60μmol/L時，無細(xì)胞毒性，且有輕度的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。陳氏等[18]研究表明，養(yǎng)顏青娥丸能明顯抑制小鼠B-16黑素瘤細(xì)胞的增殖，并降低酪氨酸酶的活性、減少黑素的合成，證實了其對腎虛型黃褐斑的治療作用。

4.2 對melan-a細(xì)胞影響的研究：Melan-a鼠黑素細(xì)胞株系來源于新生C57BL鼠皮膚的永生化二倍體黑素細(xì)胞，基因型為agouti/agouti（純合子，顯性），該細(xì)胞保留了正常黑素細(xì)胞的特征；Melan-a鼠黑素細(xì)胞株接種到同種系小鼠或裸鼠身上，不能誘發(fā)黑素瘤的發(fā)生，該細(xì)胞株廣泛應(yīng)用于黑素轉(zhuǎn)運、藥物對黑素合成的影響等方面研究[19-20]。Me1an-a鼠黑素細(xì)胞株細(xì)胞比B16、S91等黑素瘤細(xì)胞株更接近于普通黑素細(xì)胞，成為人們研究體外黑素細(xì)胞生物學(xué)特性的合適媒介。魯嚴(yán)等[21]研究蘆薈素對Melan-a鼠黑素細(xì)胞株的黑素生成及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，表明蘆薈素能夠顯著抑制Melan-a鼠黑素細(xì)胞株的TYR活性、黑素量和TRP-1/TRP-2 mRNA的表達(dá)水平，直接測定黑素細(xì)胞TYR濃度和黑素量比檢測TRP-1/TRP-2 mRNA更能確切地反映蘆薈素對黑素細(xì)胞的影響。又觀察了苦參堿和肉桂酸對melan-a小鼠黑素細(xì)胞黑素生成的影響，表明苦參堿和肉桂酸均有抑制melan-a小鼠黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的作用及使黑素合成量減少的作用，且苦參堿作用強于肉桂酸，而肉桂酸有促進(jìn)黑素細(xì)胞樹突形成的作用[22]。

4.3對正常人黑素細(xì)胞影響的研究：體外培養(yǎng)的哺乳動物或人的黑素瘤細(xì)胞的增殖潛能及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制均與正常黑素細(xì)胞不同。體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞，更為接近在體環(huán)境。丁國斌等[23]利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子為主要有絲分裂原建立正常人表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)系， 研究發(fā)現(xiàn)熊果苷對體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性呈濃度依賴性抑制，可顯著減少黑素生成量，對黑素細(xì)胞活力影響很小，表明熊果苷對體外培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性及黑素生成有顯著抑制作用，且細(xì)胞毒性很低。楊壯群等[24]研究蘆薈苦素對體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞的作用效應(yīng)，蘆薈苦素對體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性呈濃度依賴性抑制，可顯著減少黑素生成量，對黑素細(xì)胞活力影響很小。雷水生等[25]研究了六味地黃丸對體外培養(yǎng)正常人黑素細(xì)胞的抑制作用，顯示六味地黃丸對黑素細(xì)胞增殖有抑制作用，能使細(xì)胞數(shù)明顯減少、黑素合成顯著下降、酪氨酸酶活性減弱， 六味地黃丸可通過阻止和清除活性氧基的作用使酪氨酸酶生成多巴、多巴生成多巴醌兩個步驟受到阻礙，使黑素生成稀少，酪氨酸酶活性下降，為六味地黃丸治療黃褐斑提供了實驗依據(jù)。

5對黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞復(fù)合模型影響的研究

黑素細(xì)胞與鄰近細(xì)胞間的相互作用不容忽視，故黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)提供了一種更好的檢測模型。

5.1 對鼠黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)：Lei等[26]使用小鼠永生化黑素細(xì)胞(Melan-a)和角質(zhì)形成細(xì)胞(SP-1)建立了一個靈敏、可信、可重復(fù)的檢測色素合成調(diào)節(jié)劑的共培養(yǎng)模型。Yoon等[27]優(yōu)化了這種測試系統(tǒng)，使用這一模型能大規(guī)模地篩選色素調(diào)節(jié)劑，并能在一個類似生理環(huán)境的系統(tǒng)中研究黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的相互作用及闡明色素調(diào)節(jié)劑的作用機(jī)制。仲少敏等[28]選取中藥在 melan-a與SP-1共培養(yǎng)體系做實驗研究，結(jié)果五倍子、威靈仙、白果、川芎在細(xì)胞培養(yǎng)水平對黑素生成有顯著抑制作用。

5.2 對人黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)：蘭海龍等[29]以包皮組織作為細(xì)胞來源，體外構(gòu)建黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直接接觸的混合培養(yǎng)模型，檢測蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性及黑素合成的影響，發(fā)現(xiàn)三種褪色劑均對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性及黑素合成產(chǎn)生濃度依賴性抑制，以茶多酚作用最強，蘆薈苦素次之。解士海等[30]成功建立黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)的體外模型，共聚焦顯微鏡下直接觀察到黑素向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運。

6對體外重建皮膚類似物的影響

皮膚類似物是應(yīng)用組織工程技術(shù)將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的大量具有增殖能力的皮膚細(xì)胞，種植在具有生物相容性的生物材料上，在體外持續(xù)培養(yǎng)以獲得與正常在體皮膚相似的人工皮膚[31]。參考正常皮膚中黑素細(xì)胞的數(shù)量，將黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞按適當(dāng)?shù)谋壤旌?，可進(jìn)一步構(gòu)建能夠調(diào)節(jié)皮膚色素生成的色素化皮膚類似物。劉源等[32]以包皮組織作為細(xì)胞來源，采用消化法獲得角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和黑素細(xì)胞，在自行設(shè)計的組織工程皮膚培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建皮膚類似物，獲得的皮膚類似物結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞狀態(tài)良好，Dopa染色、透射電鏡和S-100免疫組織化學(xué)檢測均顯示含有大量黑素細(xì)胞并處于良好狀，成功構(gòu)建了含黑素細(xì)胞的色素化皮膚類似物。商品化皮膚類似物更為哺乳動物黑素生成因子的調(diào)控及作用機(jī)制解釋的研究，提供了一個更方便、有效的選擇[33]。

7小結(jié)

尋找組方合理、高效安全的中藥美白祛斑制劑，一直是藥學(xué)和化妝品領(lǐng)域的一個研究熱點。近年來，新技術(shù)和新方法不斷引入，但仍然存在很多問題?；A(chǔ)理論研究非常薄弱、滯后，臨床療效觀察多，實驗研究與臨床研究文獻(xiàn)的比例很低。國內(nèi)對中藥祛斑成分的篩選研究多集中于酪氨酸酶的抑制作用上，以及在此基礎(chǔ)上以黑素瘤細(xì)胞和動物模型進(jìn)行的實驗，肯定了一些中藥對黑素代謝的作用，但是酪氨酸酶抑制實驗結(jié)果不是很一致，甚至有的互相矛盾。細(xì)胞水平的研究更接近于體內(nèi)狀態(tài)，在研究藥物對黑素細(xì)胞的作用時，角質(zhì)形成細(xì)胞是不能忽略的因素。黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型用于黑素代謝的研究，一方面使實驗更接近體內(nèi)環(huán)境，另一方面可以發(fā)現(xiàn)通過角質(zhì)形成細(xì)胞而間接抑制黑素合成的藥物。以色素化皮膚類似物為模型來篩選祛斑藥物，不僅同時考慮到了黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的交互作用，而且還考慮到了空間因素的影響，黑素細(xì)胞所處的環(huán)境更接近體內(nèi)，是一種更好的模型。但是，構(gòu)建色素化皮膚類似物操作復(fù)雜，所需時間長(至少培養(yǎng)4周)，適合于藥物的精確篩選[34]?？梢?，采用黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型作為初步篩選平臺，采用色素化皮膚類似物對重點成分的作用及機(jī)理進(jìn)行深入的研究，將成為中藥治療黃褐斑實驗研究的新模式。

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[收稿日期]2008-04-05[修回日期]2008-06-12

編輯/李陽利