脂肪組織工程研究進(jìn)展

每年全世界有數(shù)百萬例因創(chuàng)傷、腫瘤切除術(shù)和先天性缺陷導(dǎo)致的軟組織缺損患者，需要通過手術(shù)進(jìn)行修復(fù)重建。這些缺損常因脂肪組織缺失而導(dǎo)致正常組織形態(tài)改變和功能障礙?；謴?fù)缺損部位組織的功能，通常不是修復(fù)重建的主要目的，手術(shù)治療的主要目的是恢復(fù)局部外形，使毀容所造成的心理創(chuàng)傷降到最低。目前的軟組織重建常用方法包括各種組織瓣移植或人工合成替代物的植入，但目前尚無一種填充材料可以滿足所有的臨床需要。利用自體脂肪組織移植（游離移植或真皮脂肪瓣移植）修復(fù)軟組織缺損的歷史比較久遠(yuǎn)，也有不少臨床應(yīng)用的報告，但因游離移植的脂肪成活率低、容易吸收，真皮脂肪瓣移植操作復(fù)雜、不易塑形，效果并不十分理想。因此，應(yīng)用組織工程學(xué)原理來構(gòu)建脂肪組織已成為組織工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。本文主要回顧脂肪組織工程的研究現(xiàn)狀和新近的研究策略。

1脂肪組織工程的基本原理

脂肪組織工程即應(yīng)用正常脂肪組織的活細(xì)胞，在體外進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，并接種到三維結(jié)構(gòu)的生物相容性支架上，然后將其從體外培養(yǎng)環(huán)境轉(zhuǎn)移至體內(nèi)，并能促進(jìn)與受區(qū)細(xì)胞整合和血管長入；最終，該構(gòu)造在支架降解過程中逐步被宿主的健康軟組織取代。為使組織工程化脂肪成功地應(yīng)用于臨床上的軟組織重建，必須處理好組織工程程序中所有的關(guān)鍵點(diǎn)，包括種子細(xì)胞和支架材料的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境和轉(zhuǎn)移方式。

1.1脂肪組織工程的細(xì)胞來源：成功地構(gòu)建脂肪組織工程的第一步，是搞清楚脂肪形成過程，并確定一種適當(dāng)?shù)姆N子細(xì)胞。已有研究者采用前脂肪細(xì)胞(preadipocyte)和成熟脂肪細(xì)胞（Mature adipocyte）來修復(fù)組織缺損[1]，但通過吸脂獲得的自體脂肪組織，在移植后由于不能盡快地重建血運(yùn)而無法得到充足的血供，使組織難以長期存活，常常導(dǎo)致移植的脂肪組織被吸收。脂肪細(xì)胞胞漿內(nèi)的脂質(zhì)對吸脂操作的損傷十分敏感，大量細(xì)胞遭到破壞而無法保持期望的體積大小。另外，成熟的脂肪細(xì)胞在培養(yǎng)過程中處于分化終末期，其增殖能力有限，不能輕易地擴(kuò)增，因此阻礙了它們在組織工程方法中的進(jìn)一步應(yīng)用[2]。

前脂肪細(xì)胞，是脂肪組織間質(zhì)-血管成分中的前體細(xì)胞，這些細(xì)胞在分化前呈梭狀或成纖維細(xì)胞樣[3]。經(jīng)分化后發(fā)生形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)改變，變?yōu)閳A形，并開始蓄積三?；视?，形成脂質(zhì)空泡[4]。前脂肪細(xì)胞被認(rèn)為是一種比成熟脂肪細(xì)胞更好的種子細(xì)胞，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀着囵B(yǎng)、擴(kuò)增，而且容易獲得，不僅能擴(kuò)大增殖到更多的細(xì)胞數(shù)，而且能分化為成熟的脂肪細(xì)胞[5]。然而，前脂肪細(xì)胞經(jīng)多次傳代后，也會喪失分化能力[6]。

干細(xì)胞生物學(xué)的研究及應(yīng)用也許能為脂肪組織工程提供一種理想的自體細(xì)胞來源。干細(xì)胞是一類具有自我更新與增殖分化能力的細(xì)胞，能產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型和自己完全相同的子細(xì)胞，同時還能分化為祖細(xì)胞。干細(xì)胞按其分化階段的不同，可以分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell）和成體干細(xì)胞（adult stem cell）兩類[7]。干細(xì)胞的應(yīng)用能供給大量的細(xì)胞，如果成體干細(xì)胞的應(yīng)用得以成功，那么就能利用患者自己的細(xì)胞構(gòu)建組織，由此消除了其他來源細(xì)胞的排斥反應(yīng)[2]。目前，利用干細(xì)胞產(chǎn)生脂肪組織的研究已經(jīng)愈來愈受矚目，來源于骨髓和脂肪組織的干細(xì)胞極有希望成為可供脂肪組織工程選擇的種子細(xì)胞來源。

骨髓中含有的造血干細(xì)胞是現(xiàn)今被公認(rèn)的間充質(zhì)干細(xì)胞源。來源于骨髓的干細(xì)胞(BMSCs)存在于骨髓間質(zhì)中，它們具有多能性，可分化為以下細(xì)胞譜系：脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞[8]。BMSCs一般是從骨髓移植供者身上抽取的骨髓中獲得的，這種方法難免會給患者帶來痛苦。骨髓干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)會呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。有關(guān)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記已經(jīng)確定，這些標(biāo)記可用于細(xì)胞選擇和測定骨髓干細(xì)胞的數(shù)量[9]。骨髓干細(xì)胞除了具有分化為多重細(xì)胞譜系的能力外，還能為組織工程應(yīng)用提供一個在體外相對容易分離和擴(kuò)增的細(xì)胞源。通過移植一小塊供體組織，就能使細(xì)胞數(shù)顯著增加。Vashi等[10]用BM-MSC和普盧蘭尼克F-127水凝膠制造了一個三維培養(yǎng)系統(tǒng)，試圖在體外構(gòu)建組織工程化脂肪。BM-MSC被分散在普盧蘭尼克F-127水凝膠上，并加入I型膠原。兩周后，在脂肪形成刺激素存在的條件下，BM-MSC分化為脂肪細(xì)胞。BM-MSC分化形成脂肪細(xì)胞，經(jīng)油紅O染色得到證實(shí)。

與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞相比，脂肪組織來源干細(xì)胞（adipose derived stem cell ，ADSC）具有同等的分化為中胚層起源的細(xì)胞和組織的潛力，例如脂肪細(xì)胞、軟骨、骨和骨骼肌[11]。ADSCs還顯示出與骨髓來源干細(xì)胞非常相似的形態(tài)學(xué)表型[12]。除了它們共同的多能性，一些在骨髓干細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的CD抗原標(biāo)記，同樣也能在ADSCs上發(fā)現(xiàn)[13]。 由于脂肪來源干細(xì)胞可從皮下脂肪組織中獲得，并能很容易地被分離出來，在活體外和或體內(nèi)都顯示出快速地增殖并分化為成熟脂肪細(xì)胞的能力，為脂肪組織工程提供了一個光明的應(yīng)用前景。然而，ADSCs的應(yīng)用也有其局限性，目前認(rèn)為ADSCs并不是萬能的，它在體外大規(guī)模培養(yǎng)后也表現(xiàn)出明顯的“衰老”跡象，由此限制了其移種能力。此外，脂肪組織在代謝活動中會發(fā)生改變，它的增殖和分化能力依賴于組織定位和患者的年齡及性別[13]。

近期，美國和日本的科學(xué)家研究出由人類體細(xì)胞誘導(dǎo)得來的多能干細(xì)胞（iPS）。他們的研究表明，用已確定的四種轉(zhuǎn)錄因子（OCT4、SOX2、NANOG和LIN28）能夠?qū)⑷梭w細(xì)胞改變?yōu)槎嗄芨杉?xì)胞，這種細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的基本特征。這些誘導(dǎo)形成的人類多能干細(xì)胞有正常的核型，表達(dá)端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性，表達(dá)人體胚胎干細(xì)胞的特征性細(xì)胞表面標(biāo)記物和基因，并保持著內(nèi)、中、外三個胚層所有的進(jìn)一步分化衍生的發(fā)育潛能[14]。由于人體胚胎干細(xì)胞的來源牽涉到人類植入前胚胎的破壞，目前對胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用仍有倫理方面的爭議；iPS不是來源于胚胎的細(xì)胞，因此消除了這一疑慮。這種人類誘導(dǎo)的多潛能細(xì)胞系將會對人體組織功能的研究和發(fā)展起到重要作用，同樣也有可能應(yīng)用到組織工程領(lǐng)域。但必須清楚地意識到，還需要進(jìn)一步的研究以克服技術(shù)上的局限性（例如病毒整合引起的基因突變）。

1.2脂肪形成的分子調(diào)控：現(xiàn)已鑒定出一些在控制脂肪形成中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，它們是CCAAT/強(qiáng)化因子結(jié)合蛋白基因家族和過氧化物酶活性增殖子γ-受體。還有激素和生長因子，例如胰島素及胰島素樣生長因子（IGF），能傳遞外部信號刺激脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)脂肪形成及血管發(fā)生[15]。向胎牛血清培養(yǎng)基中加入地塞米松、甲狀腺激素或胰島素等誘導(dǎo)劑，能使前脂肪細(xì)胞和干細(xì)胞的體外分化得到加強(qiáng)。進(jìn)一步在分子水平上了解脂肪形成的機(jī)制，將有助于構(gòu)建組織工程化脂肪并促進(jìn)脂肪組織再生。

1.3 脂肪組織工程的支架材料：支架材料在組織工程組織的構(gòu)建中占有舉足輕重的地位。理想的三維支架應(yīng)具有臨時細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的作用，為脂肪組織工程種子細(xì)胞提供附著、增殖、分化和營養(yǎng)代謝的場所。細(xì)胞以其附著的三維支架為模板，發(fā)展形成新的脂肪組織?，F(xiàn)已研究出許多應(yīng)用于脂肪組織工程的不同種類的人工合成支架材料，包括聚乙醇酸（PGA）、聚對苯二甲酸乙酯（PET）、多聚共乳乙交酯酸（PLGA）和聚四氟乙烯（PTEF）。天然衍生材料，例如膠原，透明質(zhì)酸衍生物，基質(zhì)膠和纖維蛋白等也已得到研究。在設(shè)計支架的時候，有許多因素值得考慮，包括支架的機(jī)械性能、降解特性、免疫原性、細(xì)胞對材料的反應(yīng)性，在臨床應(yīng)用中是否易于操作并能減少成本[16]。理想的材料修飾是將生物活性成分與支架材料結(jié)合，使支架成為一個生物分子控釋系統(tǒng)，以使生物活性分子的釋放持續(xù)于支架降解全過程。這些加工技術(shù)的改進(jìn)，使脂肪組織工程的支架材料有可能與細(xì)胞粘附分子、趨化因子和生長因子結(jié)合，系統(tǒng)地調(diào)控脂肪干細(xì)胞的粘附、分化、增殖和代謝功能，從而促進(jìn)組織工程化脂肪的形成。最近納米級結(jié)構(gòu)材料的發(fā)展與分子生物學(xué)研究結(jié)果的結(jié)合[17]，可使生物活性分子在材料中有序組裝，將對組織工程發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

2脂肪組織工程研究策略及其進(jìn)展

現(xiàn)在已有許多構(gòu)建脂肪組織的策略。這些策略通常是將前脂肪細(xì)胞播種在由可被吸收的聚酯、透明質(zhì)酸、膠原、聚乙二醇（PEG）和化學(xué)改性藻酸鹽等材料構(gòu)成的聚合物支架上。應(yīng)用于脂肪組織工程研究中的支架形狀各不相同，比如聚合物盤、海綿、泡沫和可注射的微球[2]。傳統(tǒng)的脂肪組織工程策略，是從患者身上吸取或切除的脂肪組織中獲得前脂肪細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，并通過酶消化作用將它們分離出來。把前脂肪細(xì)胞與適當(dāng)?shù)纳L因子一起培養(yǎng)在多聚體支架上，然后將該支架植入到患者軟組織缺損處。理想的結(jié)果是隨著支架改型或吸收，前脂肪細(xì)胞會不斷生長、增殖，并最終發(fā)育成熟為脂肪組織。Patrick等[18]應(yīng)用這種方法證明了前脂肪細(xì)胞具有分化成為成熟脂肪細(xì)胞的能力，而細(xì)胞在PLG支架上的生長狀況說明前脂肪細(xì)胞經(jīng)移植后具有長期的存活力。脂肪細(xì)胞的產(chǎn)生可通過組織學(xué)染色和熒光標(biāo)記方法進(jìn)行鑒定。這一基本的脂肪組織工程策略主要以前脂肪細(xì)胞的應(yīng)用為重點(diǎn)，而忽視了用來構(gòu)造支架的材料方面的問題。

后來的研究對材料進(jìn)行了修飾，使之盡可能地增強(qiáng)細(xì)胞的粘附增殖及生物相容性。Hemmrich等[19]比較了裝載有前脂肪細(xì)胞的透明質(zhì)酸和膠原這兩種生物材料對于脂肪組織工程的適用性。結(jié)果證明該方法能夠使脂肪組織在活體內(nèi)重新形成，但是支架孔徑的大小和穩(wěn)定性是限制細(xì)胞在其構(gòu)造中充分分布的客觀因素。他們在后面的研究中制作了一個新的可降解基質(zhì)：聚酯衍生的非針織物。這種材料是應(yīng)用紡織制造業(yè)中的空氣動力學(xué)網(wǎng)狀物形成方法和針毯技術(shù)而制成的，它是以己內(nèi)酰胺、已二酸和1，4-丁二醇為基礎(chǔ)的三維結(jié)構(gòu)。把人的前脂肪細(xì)胞播種到該支架上，并對細(xì)胞增殖分化進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示聚酯材料允許前脂肪細(xì)胞很好的粘著、增殖和分化。這些研究對于設(shè)計一種能使細(xì)胞相互作用最佳化的支架具有指導(dǎo)作用。由于脂肪來源干細(xì)胞（ADSC）能較好地經(jīng)受住來自抽吸套管的機(jī)械性損傷，移植后具有良好的細(xì)胞存活力并能再生新的脂肪組織，Rubin等[20]用多孔的膠原微球作為細(xì)胞載體來培養(yǎng)和移植ADSCs，經(jīng)過試驗(yàn)證明該策略是可行的。這一策略將ADSCs在體外誘導(dǎo)分化，然后將細(xì)胞和支架精確地置入組織床內(nèi)，觀察干細(xì)胞在這些微球內(nèi)增殖和分化的能力。研究者從人脂肪組織中分離出脂肪來源干細(xì)胞并置于微球上，在攪動生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)幾周后，細(xì)胞在微球上附著、增殖并保持高度活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠原微球?qū)χ緛碓锤杉?xì)胞是一種良好的支架，能夠使細(xì)胞在顆粒上進(jìn)行體外增殖和分化，并且這些微球顆粒小到能以注射的方式植入到組織缺損部位。

另一個新穎的研究策略是完全以細(xì)胞為基礎(chǔ)的重建方法。Melanie Vermette等[21]利用適當(dāng)?shù)摹白越M裝”培養(yǎng)方法學(xué)，試圖創(chuàng)造一個新的、完全自體來源的組織工程脂肪替代物。他們應(yīng)用來源于抽吸或切除下來的脂肪中的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，在脂肪細(xì)胞分化發(fā)生的過程中，添加維生素C，從而刺激間質(zhì)細(xì)胞自己產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。有功能的脂肪細(xì)胞長入到自身分泌的ECM支架內(nèi)，形成一個天然的“生物材料”。經(jīng)掃描電鏡觀察，這些重建的脂肪組織的形態(tài)與皮下脂肪十分相似，而且能分泌脂肪動員因子并發(fā)揮β-腎上腺素刺激性受體介導(dǎo)的脂解作用，具有白色脂肪組織主要的生物學(xué)功能。因此，這種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程策略，能夠產(chǎn)生一種有功能的完全天然的脂肪組織，為特定的體外和自體軟組織重建提供應(yīng)用可能。

3脂肪組織工程的臨床應(yīng)用和展望

盡管眾多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究工作，組織工程化脂肪替代物由于種種原因尚未能應(yīng)用于臨床，這表明需要進(jìn)一步優(yōu)化目前的支架模型并改革創(chuàng)新構(gòu)建這種特殊類型組織的策略。目前干細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用是研究的熱點(diǎn)，有許多相關(guān)的問題需要解決，包括組織獲得方法的標(biāo)準(zhǔn)化、細(xì)胞分離和培養(yǎng)。直到今天，沒有發(fā)現(xiàn)一種確定的成體干細(xì)胞標(biāo)記，可以保證所有干細(xì)胞群的純凈[22-23]。缺乏這樣的標(biāo)記，有可能使干細(xì)胞的應(yīng)用存在變異性。但無論如何，干細(xì)胞在脂肪組織工程的研究中已顯示出了良好的應(yīng)用前景，干細(xì)胞接受適當(dāng)刺激后有分化為內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力，將有利于形成一個血管化的脂肪移植物，為應(yīng)用組織工程脂肪組織進(jìn)行軟組織重建帶來了希望。

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[收稿日期]2008-03-02 [修回日期]2008-05-25

編輯/李陽利