骨保護(hù)素在犬恒牙胚發(fā)育中的表達(dá)及意義

[摘要]目的：探討犬乳恒牙替換過(guò)程中骨保護(hù)素在犬恒牙胚發(fā)育中的表達(dá)及意義。方法：分別對(duì)乳牙期、替牙期、恒牙期本地犬取牙胚及其周?chē)M織，制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色和牙胚內(nèi)OPG的免疫組化染色，用彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析各組染色強(qiáng)度灰度值。結(jié)果：乳牙期、替牙期犬牙胚的成牙本質(zhì)細(xì)胞OPG的免疫組化強(qiáng)度明顯高于另外一組，成釉細(xì)胞中也有陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)論：OPG可能參與恒牙胚的形成和發(fā)育。

[關(guān)鍵詞]犬恒牙胚；骨保護(hù)素；成牙本質(zhì)細(xì)胞；成釉細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)]R781 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2008）06-0877-2

The expression and significance of osteoprotegerin in the the development of of dogs' permanent teeth germs

CHEN Li-ping1，WU Wei1，BAI Hui-ying1，YANG Fu-sheng2

(1.Department of Dentistry， Qinghai Provincial Corps Hospital，Chinese Pepole′s Armed Police Force， Xi′ning 810001，Qinghai，China;2.College of Stomatology，F(xiàn)ourth Military Medical University)

Abstract:ObjectiveTo study the expression and significance of osteoprotegerin（OPG）in the development of dogs'permanent teeth germs. MethodsDogs of different ages were selected as objects，selected permanent teeth germs and their peripheral tissue of dogs in different periods of primary dentition roots stability，primary dentition roots resorption，permanent dentition，preparating of paraffin slice.HE dyeing and OPG immunohistochemical dyeing were analysing the gray value of dyeing tense.ResultsOPG dyeing tense of immunohistochemic in odontoblasts of the germs in period of primary dentition roots stability and primary dentition roots resorption is stronger than the other team.OPG position signals were observed on ameloblasts. ConclusionOPG probably takes partin the formation and development of dogs'permanent teeth germs.

Key words:dogs'permanent teeth germs;osteoprotegerin(OPG);odontoblasts;ameloblasts

骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)是腫瘤壞死因子受體超家族成員，其主要生物學(xué)作用是抑制破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)形成、分化和增加骨密度，是抑制骨吸收的關(guān)鍵因子。有研究表明， OPG基因表達(dá)在牙濾泡，在牙齒萌出中發(fā)揮一定作用。而在恒牙胚發(fā)育中的作用卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)犬恒牙胚成牙本質(zhì)細(xì)胞中OPG的表達(dá)進(jìn)行研究，探討OPG在此過(guò)程中的作用。

1材料和方法

1.1材料及分組：動(dòng)物選用本地犬共3只，分為3組，A組：乳牙牙根穩(wěn)定犬(8周齡)；B組：乳牙牙根吸收犬(18周齡)；C組：成年恒牙列犬(22周齡)。

1.2試劑：兔抗人OPG多克隆抗體(北京博奧森生物工程有限公司)；SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)。

1.3切片標(biāo)本制作及觀(guān)察：分別將實(shí)驗(yàn)犬以速眠新Ⅱ注射液按0.2ml/kg肌注麻醉，解剖分離雙側(cè)頸動(dòng)脈后斷頭處死，頸動(dòng)脈插管，用生理鹽水沖洗，4%甲醛固定液進(jìn)行灌注組織內(nèi)固定，分離上、下頜骨，4%甲醛固定液外固定24h，上、下頜骨于甲酸、甲酸鈉脫鈣液中4℃脫鈣，4周后分切成小塊，再脫鈣4周。脫鈣后，分切、修整、酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，制作5μm厚石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，常規(guī)HE染色，每只犬取5張切片共30張，每張切片光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察根尖組織。

1.4免疫組化染色及圖像分析：切片脫蠟至水，一抗為兔源性抗體，稀釋度1:350，其余步驟按試劑盒進(jìn)行。用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析染色強(qiáng)度的灰度值，每個(gè)時(shí)期10張切片，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)成牙本質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。

2結(jié)果

A組：8周犬乳牙根未發(fā)生生理性根吸收，恒牙胚牙冠發(fā)育處于牙體組織形成期，牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)基質(zhì)開(kāi)始形成。成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞高柱狀，胞核橢圓形，遠(yuǎn)離基底膜，整齊排列，極性倒置明顯。此時(shí)可見(jiàn)恒牙胚內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞及成釉細(xì)胞染色陽(yáng)性，染棕黃色?？瞻讓?duì)照組染色陰性。B組：18周犬乳牙根發(fā)生生理性吸收，恒牙胚冠部牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)進(jìn)一步形成和礦化，成釉器萎縮、上皮根鞘向根方生長(zhǎng)，形成上皮隔，并可見(jiàn)上皮根鞘發(fā)生斷裂。此時(shí)恒牙胚內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞及成釉細(xì)胞染色陽(yáng)性（如圖1），空白對(duì)照組染色陰性。C組：22周成年犬恒牙列，乳牙已脫落，恒牙萌出。恒牙成牙本質(zhì)細(xì)胞染色陰性。經(jīng)彩色病理圖像分析系統(tǒng)分析，成牙本質(zhì)細(xì)胞染色灰度值分析見(jiàn)表1。

經(jīng)LSD檢驗(yàn)，成牙本質(zhì)細(xì)胞A、B組與C組間P＜0.05，即免疫組化染色強(qiáng)度A、B組與C組間有顯著性差異，說(shuō)明成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)OPG的強(qiáng)度不同。成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞A組與B組間P＞0.05，即這兩類(lèi)細(xì)胞免疫組化染色強(qiáng)度A組與B組間無(wú)顯著性差異。

3討論

OPG是Simonet等[1]1997年在胎鼠小腸 cDNA文庫(kù)中克隆出的一種新型分泌型糖蛋白，是缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域的腫瘤壞死因子受體超家族成員，具有降低OC分化和增加骨密度的功能。人類(lèi)OPG基因定位于染色體8q23-24，包含5個(gè)外顯子，在體內(nèi)以單體和同源二聚體兩種形式存在。OPG mRNA具有廣泛的組織分布，在骨骼，OPG主要由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。而骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)是通過(guò)不斷的吸收與形成來(lái)維持的，骨的形成主要由成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)，在骨量維持中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá) OPG的OPG轉(zhuǎn)基因(opg+/+)小鼠表現(xiàn)為骨質(zhì)硬化癥，骨質(zhì)堅(jiān)硬，骨髓腔縮小，呈現(xiàn)明顯的大理石樣變，而 OPG基因敲除(opg-/-)小鼠在成熟前即顯示嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松[2]。因此我們推測(cè)，OPG與牙齒硬組織礦化也可能存在一定的關(guān)系。

Yao S[3]發(fā)現(xiàn)在大鼠牙囊中有OPG的存在。金星愛(ài)等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在牙齒萌出的骨內(nèi)階段中期牙囊成纖維細(xì)胞、成釉細(xì)胞OPGmRNA呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。當(dāng)成釉細(xì)胞成熟后，對(duì)牙乳頭發(fā)生誘導(dǎo)作用，分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，成熟后的成牙本質(zhì)細(xì)胞已具備合成蛋白質(zhì)的功能。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)：OPG的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)于發(fā)育中的恒牙胚成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞中，鏡下觀(guān)察，兩類(lèi)細(xì)胞高柱狀，細(xì)胞核大、橢圓形，遠(yuǎn)離基底膜，這種細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)反映其功能和狀態(tài)正處于活躍的基質(zhì)分泌期；恒牙萌出后，其成牙本質(zhì)細(xì)胞成為扁平狀，說(shuō)明其功能處于靜止，染色結(jié)果為陰性。圖像分析的結(jié)果兩類(lèi)細(xì)胞A、B兩組間灰度值稍有不同，但相差不顯著，提示牙胚發(fā)育期間，細(xì)胞的功能狀態(tài)可能差別不明顯，但成牙本質(zhì)細(xì)胞A、B組與C組則有顯著性差異，說(shuō)明恒牙萌出后，成牙本質(zhì)細(xì)胞OPG染色強(qiáng)度明顯減弱，提示OPG可能參與了牙胚的形成和發(fā)育，推測(cè)可能與硬組織礦化有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Simonet WS，Lacey DL，Dunstan CR，et a1.Osteoprotegerin:A novel secretedprotein involved in the regulation of bone density[J].Cell，1997，89:309-319.

[2]YAO S，RING S，HENK WG，et a1.In vivo expression of RANKL in the rat dental follicle as determined by laser capture microdissection[J].Arch Oral Biol，2004，49(6):451-456.

[3]Bucay N，Sarosi I，Dunstan CR，et a1.Osteoprotegedn deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification[J].Genes Dev，1998，12(9):1260-1268.

[4]金星愛(ài).RANKL在犬乳恒牙替換期牙齦上皮中的表達(dá)[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41(4):333-337.

[收稿日期]2008-03-30[修回日期]2008-04-21

編輯/何志斌