天然羥基磷灰石／殼聚糖復(fù)合材料細(xì)胞相容性研究

[摘要]目的：評(píng)價(jià)天然羥基磷灰石／殼聚糖復(fù)合材料(nature hydroxyaptite /chitosan composite，NHC )的細(xì)胞相容性。方法：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)法培養(yǎng)成骨細(xì)胞，并鑒定。將材料與細(xì)胞體外進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，應(yīng)用細(xì)胞增殖度，堿性磷酸酶和掃描電鏡等對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞在復(fù)合材料表面粘附，生長(zhǎng)良好，細(xì)胞增殖度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，材料組與對(duì)照組之間堿性磷酸酶無(wú)顯著性差異(P＞0.105)，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)24h后細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞連接緊密，有細(xì)胞外基質(zhì)生成。說(shuō)明本復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞相容性。結(jié)論：NHC具有較良好的體外細(xì)胞相容性。

[關(guān)鍵詞]羥基磷灰石；殼聚糖；細(xì)胞相容性；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）06-0855-04

Cellular biocompatibility of nature hydroxyaptite/chitosan composite

TANG Xiao-jun1，GUI Lai1，LV Xiao-ying2

（1.Department of Cranio-maxillofacial Surgery， Plastic Surgery Hospital， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100144，China. 2. State Key Laboratory of Bioelectronics， School of Biological Science and Medical Engineering， Southeast University， Nanjing 210096，Jiangsu， China）

Abstract： Objective To investigate the cellular biocompatibility of nature Hydroxyaptite/ Chitosan composite（NHC）.MethodsThe composite was cocultured with osteoblasts derived from human bone marrow stem cells. The cellular biocompatibility was studied by means of the evaluation of proliferation capacity， alkaline phosphatase staining and scanning electron microscope observation.ResultsExcellent adherence and growth of osteoblasts were observed on the composite surface. There were no significant differences in both cell proliferation capacity and alkaline phosphatase staining between the experiment and control groups. SEM observation showed normal growth of osteoblasts and extracellular matrix generation in 24 hours. ConclusionNHC had good biocompatibility with the osteoblasts in vitro.

Key words：hydroxyaptite；chitosan；cellular biocompatibility；human bone marrow stem cells

天然羥基磷灰石／殼聚糖復(fù)合材料是由豬骨提取的羥基磷灰石和殼聚糖交聯(lián)法獲得的（該材料合成方法已獲得國(guó)家專利）[1]。其抗壓強(qiáng)度達(dá)到人椎骨水平。理論上本復(fù)合材料擁有羥基磷灰石良好生物相容性，引導(dǎo)骨形成，骨融合特性和殼聚糖的體內(nèi)降解吸收，抗菌抗癌和良好的骨整合等特殊的醫(yī)用生物學(xué)特性[2]。作為一種新復(fù)合成的材料，我們需要對(duì)其進(jìn)行生物相容性評(píng)定。該材料骨內(nèi)植入的掃描電鏡情況已經(jīng)發(fā)表[3]。本文主要是評(píng)價(jià)該材料在體外的細(xì)胞相容性。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑和儀器：1∶50肝素抗凝的正常成人骨髓采自整形醫(yī)院臨床患者，經(jīng)患者知情同意?；颊邿o(wú)感染、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病等系統(tǒng)性疾患。Percoll（Amershan-Pharmacia公司），低糖型DMEM培養(yǎng)基（Gibco BRL公司），胎 牛 血 清（天津川葉生物公司），青、鏈 霉 素（華北制藥股份有限公司），胰酶（Amershan-Pharmacia公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（FORMA 3111型美國(guó)），離心機(jī)（KUBOTA2100日本），倒置相差顯微鏡（LEICA DM IRB 德國(guó)），JSM-T300掃描電鏡，超凈工作臺(tái)YJ-875型（北京昌平凈化設(shè)備廠 國(guó)產(chǎn)），堿性磷酸酶試劑盒（北京中山生物公司產(chǎn)品），骨鈣素RT-PCR引物（賽百盛公司），AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（promega），酶聯(lián)儀（TECAN SUNRISE日本）。

1.2人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：正常人1∶50肝素抗凝骨髓5ml，用含10％FBS的L-DMEM 1∶5稀釋離心1200 rpm 5min，去掉脂肪層，重懸細(xì)胞。用1.073g/mlPercoll分離，將密度為1.073g/ml Percoll先置于試管的底部，然后按照1∶1的比例緩慢滴加稀釋后的骨髓，離心 2500 rpm 30min，收集位于界面層的單個(gè)核細(xì)胞。用L-DMEM洗滌兩次，重新懸浮于含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中，接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，密度為2.0×105/cm2，置于37℃，含 5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。48h后除去非貼壁細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液。之后每3至4天換一次液。待貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶1比例傳代，第2代以后的細(xì)胞按1∶2或1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.3人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

1.3.1 MTT比色實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10% FBS的L-DMEM配制成細(xì)胞懸液，以每孔1.5×104個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔體積200μl。將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。分別于1、2、4、6、8、10和12天各取出三孔，每孔加入MTT 20μl，37℃孵育4h，中止培養(yǎng)，棄上清，每孔加150μl二甲基亞砜（DMSO），震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)儀上測(cè)定各孔光吸收值（optical density value OD）。

1.3.2人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力的鑒定。

1.3.2.1 MSC向成骨誘導(dǎo)：取體外擴(kuò)增的第3代MSCs，以3.0×103/cm2的濃度接種于放置有無(wú)菌處理的蓋玻片的六孔板中，每孔內(nèi)加2ml含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到60%～70%匯合時(shí)，加入骨誘導(dǎo)劑100nM Dex、0.25mM AsA和 10mMβ-GP，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。對(duì)照組只加培養(yǎng)基。在第4、8、12和16天分別觀察各孔中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)變化情況。

1.3.2.2 堿性磷酸酶活性測(cè)定：按堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。取進(jìn)行誘導(dǎo)后的MSCs的上清液進(jìn)行測(cè)定，分別取4、8、12和16天 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定。

1.3.2.3 RT-PCR分析骨鈣素mRNA：人MSC在對(duì)照組和含誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)7天和14天。消化后收集細(xì)胞，采用QIAGEN公司的RNeasy mini column 試劑盒提取總RNA。提取后的RNA標(biāo)本經(jīng)測(cè)定OD 260/280 測(cè)定比值為2.0～2.1。取1μg總RNA采用mRNA Selective PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，方法按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。45℃ 30min反轉(zhuǎn)錄，各取10μl的cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.3.3 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力的鑒定：將hMSC接種于24孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為4×104個(gè)。24h后添加脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液，為高糖DMEM，內(nèi)含10%FBS、0.5mmol/L異丁基-甲基黃嘌呤、0.2mmol/L吲哚美辛、10-3mmol/L地塞米松、10mg/ml胰島素。誘導(dǎo)2周，每周換液2次。2周后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，10%福爾馬林固定，油紅O染色。

1.4 天然羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)：將支架材料制成厚0.2cm，直徑1cm的圓片狀，雙蒸水清洗，室溫下自然干燥24h，紙塑包裝密封，環(huán)氧乙烷消毒。

1.4.1人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）在天然羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合支架材料上的貼附實(shí)驗(yàn)：無(wú)菌條件下在超凈臺(tái)上將消毒的材料圓片放入24孔板，將體外擴(kuò)增的hMSC經(jīng)過(guò)消化離心，得到細(xì)胞懸液，按細(xì)胞密度2×l06/cm2均勻接種在材料上。加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～6h。

1.4.2 MTT法分析hMSCs與天然羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合支架材料復(fù)合培養(yǎng)的成活率和增殖能力：將傳至第3代的細(xì)胞以1×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板， 每孔加入培養(yǎng)基200μl，37℃， 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 分別于第2、4、6及8天，每孔加入MTT20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出培養(yǎng)液后，加入DMSO液(150μl/孔)，室溫下于微孔板振蕩囂上振蕩10min，使結(jié)晶物溶解，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的A值(選擇波長(zhǎng)570nm)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.3堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定：將支架材料3塊置于六孔培養(yǎng)板，并設(shè)3孔為不加材料的空白對(duì)照組。將hMSCs以1×105/孔接種于預(yù)濕材料上，在條件培養(yǎng)基下(含抗壞血酸、地塞米松和甘油磷酸鈉)培養(yǎng)3周后，收集細(xì)胞，采用磷酸苯二鈉法測(cè)定樣品ALP活性。

1.4.4掃描電鏡觀察：hMSCs-支架材料復(fù)合體標(biāo)本取出后用2%戊二醛固定，系列丙酮中脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金，用JSM-T300掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料貼附和基質(zhì)分泌及生長(zhǎng)情況。

2結(jié)果

2.1采用密度梯度離心法成功分離獲得了MSCs。用密度為1.073g/ml的Percoll對(duì)骨髓進(jìn)行密度梯度離心，經(jīng)過(guò)2，500rpm 30min離心后，分離得到了富含MSC的單個(gè)核細(xì)胞，將其接種于含10％經(jīng)過(guò)篩選的FBS的培養(yǎng)基中，細(xì)胞于48h后貼壁，72h后出現(xiàn)紡錘狀細(xì)胞（圖1），6～12天細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，貼壁的MSCs平均約12天后形成克?。▓D2），兩周左右細(xì)胞近80%～90%匯合，出現(xiàn)致密的貼壁層（圖3）。

2.2 MSC的生長(zhǎng)曲線（圖4）

2.3 MSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

2.3.1 MSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化：本實(shí)驗(yàn)采用包含有100nM Dex、0.25mM AsA和10mMβ-GP的骨誘導(dǎo)液進(jìn)行MSCs向成骨細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)研究。應(yīng)用Von Kossa 染色和X光衍射等方法對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。在16天的誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，與對(duì)照組有顯著差別。在進(jìn)行骨誘導(dǎo)第2天時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，第4天更為明顯，大約30%～40%的MSCs由紡錘狀變?yōu)榱⒎叫?；?天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大約80%以上的MSCs成為立方形或多角形，細(xì)胞基質(zhì)中出現(xiàn)鈣化斑；第12天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿中廣泛均一地形成骨樣物質(zhì)，礦化物形成明顯，并且開(kāi)始形成多層小結(jié)結(jié)構(gòu)；第16天時(shí)，成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞基質(zhì)形成廣泛的礦化，并形成鈣化結(jié)節(jié)（圖5）。而對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)仍然是紡錘狀。

2.3.2 RT-PCR分析骨鈣素mRNA：RT-PCR分析，在7天、14天時(shí)誘導(dǎo)組中骨鈣素的表達(dá)明顯增高（圖6）。

2.4 MSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化：原代培養(yǎng)的MSC呈集落樣增殖，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或長(zhǎng)三角形，類似成纖維細(xì)胞。傳代細(xì)胞第3～5代形態(tài)逐漸趨于均一的長(zhǎng)梭形，核位于中央，細(xì)胞分布均勻。誘導(dǎo)36～48h后，光鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞沿胞膜下出現(xiàn)環(huán)形細(xì)顆粒層，折光性較強(qiáng)，細(xì)胞核仍位于中央，以后顆粒逐漸增多，并向細(xì)胞中央、核周圍逼近，顆粒逐漸變大；細(xì)胞仍呈長(zhǎng)梭形，但胞體變大和變寬，細(xì)胞兩極變短（圖7），油紅O染色證實(shí)這些顆粒為中性脂肪顆粒。2～6天后，顆粒細(xì)胞明顯增多，分化較早的細(xì)胞，在細(xì)顆粒增多的同時(shí)，顆粒逐漸融合成光鏡下可見(jiàn)的小圓形脂滴，晶瑩透亮，整個(gè)細(xì)胞內(nèi)從胞膜到細(xì)胞核之間充滿大小較均一的脂滴，呈葡萄串狀(圖8)，胞體明顯變大，并趨于橢圓形。

2.5統(tǒng)計(jì)測(cè)定

2.5.1 hMSC增殖度測(cè)定：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞數(shù)量都有所增加，各組細(xì)胞增殖度差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.5.2堿性磷酸酶(ALP)活性：材料組ALP活性為(2.1259±0.1094)，空白對(duì)照組為(2.1337±0.1101)，材料組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.105)，說(shuō)明材料對(duì)hMSCs進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)未見(jiàn)不利的影響，且對(duì)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的ALP活性沒(méi)有影響。

2.5.3掃描電鏡：材料表面在掃描電鏡下為微粒狀，具有微孔(圖9)。培養(yǎng)4h，細(xì)胞附著于材料表面，形態(tài)多樣，呈有多個(gè)突起的梭形或多角形，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞跨越微孔表面或向孔內(nèi)長(zhǎng)入(圖10)。培養(yǎng)8h后細(xì)胞連接成片，可見(jiàn)細(xì)胞表層有絲狀纖維形成(圖11)。培養(yǎng)24h后細(xì)胞形成單層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞緊密，可見(jiàn)到細(xì)胞外基質(zhì)（圖12）。

3討論

細(xì)胞相容性是組織工程對(duì)支架材料的最基本的要求之一。細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)材料細(xì)胞相容性是一種快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好又價(jià)廉的方法，在材料生物相容性評(píng)價(jià)中起著越來(lái)越重要的作用。體外材料復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞相容性試驗(yàn)可以排除體內(nèi)試驗(yàn)的各種復(fù)雜因素之間的相互干擾。可以從細(xì)胞水平直接觀察某一單一因素所致的細(xì)胞與生物材料復(fù)合生長(zhǎng)的情況，可以直接觀察細(xì)胞對(duì)材料的趨化、粘附和細(xì)胞在材料表面及內(nèi)部的生長(zhǎng)、增殖和分化。結(jié)果較敏感和客觀。

3.1細(xì)胞相容性試驗(yàn)中的細(xì)胞選擇：1948年Rosen Bluth等首次報(bào)道利用鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)篩選聚合物，進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)生物材料的生物相容性的研究。目前一般多選用成纖維細(xì)胞株(如L-929)作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞[4]。越來(lái)越多學(xué)者認(rèn)為不同組織來(lái)源的細(xì)胞對(duì)材料的敏感性是有差異的[5]，應(yīng)該根據(jù)材料植入體內(nèi)的不同部位及使用目的選擇人體不部位或/和組織來(lái)源的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，使體外細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的模擬更趨真實(shí)，其結(jié)果更為準(zhǔn)確與客觀。由于我們研究的材料為骨替代材料最終是要被種植到骨組織內(nèi)，需要長(zhǎng)期和骨組織進(jìn)行生物學(xué)接觸。因此骨替代材料應(yīng)選擇骨組織來(lái)源的細(xì)胞才能準(zhǔn)確反映材料最終在生物體內(nèi)的真實(shí)狀況。比如：成骨細(xì)胞，或前體成骨細(xì)胞等[6]。

3.2復(fù)合材料細(xì)胞相容性：材料和細(xì)胞相容性有很多的影響因素，比如：金屬材料基質(zhì)能，表面自由能，界面自由能，材料表面的粗糙程度[7]，材料表面基團(tuán)種類和結(jié)構(gòu)， 表面電荷， 材料表面的改性和修飾情況等等因素。Baier[8]等認(rèn)為材料表面的特性和自由能決定其細(xì)胞生物粘附性，他們通過(guò)在新西蘭白免體內(nèi)移植幾種不同表面能的金屬材料發(fā)現(xiàn)，低表面能材料粘附的細(xì)胞呈現(xiàn)球形或近球形，粘附作用極弱。高表面能材料的表面可以被活體細(xì)胞完全覆蓋，表面粘附的細(xì)胞呈現(xiàn)出扁平、拉長(zhǎng)的形態(tài)，粘附作用很強(qiáng)。因此高表面能材料的表面更有利于細(xì)胞的粘附與鋪展。生物材料表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)，表面基團(tuán)或改性修飾對(duì)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)是另一個(gè)重要因素。Lee[9]等認(rèn)為材料表面不同功能基團(tuán)具有不同的細(xì)胞特性，比如羧基、羥基、磺酸基、胺基、亞胺基及酰胺基等基團(tuán)可促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽表面修飾對(duì)HA材料的細(xì)胞相容性有明顯的優(yōu)化作用[10]。并且在生理狀態(tài)下，一切脊椎動(dòng)物細(xì)胞表面都帶有分布不均勻的負(fù)電荷。因此我們認(rèn)為帶正電荷的材料表面與帶負(fù)電荷的細(xì)胞之間的靜電吸引作用有利于細(xì)胞的粘附。

在本實(shí)驗(yàn)中，將復(fù)合材料和成骨細(xì)胞在體外進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，通過(guò)電鏡形態(tài)學(xué)對(duì)材料和細(xì)胞復(fù)合檢查發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)活躍，培養(yǎng)早期細(xì)胞散在于材料表面，呈有多個(gè)突起的梭形或多角形，細(xì)胞間連接松散。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖，連接成單層或生長(zhǎng)附著于較大孔隙表面，細(xì)胞排列緊密，部分區(qū)域有細(xì)胞外基質(zhì)形成。即4h細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，8h連成片狀，24h細(xì)胞在材料表面形成單層或長(zhǎng)入孔隙內(nèi)，同時(shí)有細(xì)胞外基質(zhì)分泌。這說(shuō)明骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以在材料表面貼附生長(zhǎng)，并伸入材料之中，可在材料表面及內(nèi)部伸展和繁殖，保持細(xì)胞的梭形形態(tài)，并能分泌膠原纖維和鈣離子顆粒等細(xì)胞外基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)也同時(shí)應(yīng)用MTT法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與天然羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料復(fù)合培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞其增殖不受影響，表明該材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂無(wú)明顯的干擾作用。通過(guò)ALP測(cè)定進(jìn)一步檢測(cè)該材料對(duì)細(xì)胞功能狀態(tài)的影響，ALP是成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志，被認(rèn)為與成骨細(xì)胞的分化有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ALP活性均有增高，同期比較差異無(wú)顯著性。說(shuō)明這種生物材料不僅對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯阻滯作用，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的功能尤其是對(duì)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化無(wú)明顯影響。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出該材料具有良好的細(xì)胞相容性，無(wú)細(xì)胞毒性?？梢宰鳛楣墙M織工程研究中種子細(xì)胞的生物支架。但是這僅僅是在體外短期試驗(yàn)的結(jié)果，該材料在生物體內(nèi)具體反映如何仍需要進(jìn)一步的試驗(yàn)論證。

根據(jù)前述的影響生物材料細(xì)胞相容性的因素分析，考慮本實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞良好相容性與以下因素有關(guān)。天然羥基磷灰石具有較高的結(jié)合鈣離子的能力，而局部鈣離子濃度的增加，可在材料表面形成高密度的正電荷層，有利于成骨細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和增殖。殼聚糖是可降解和可吸收的高分子材料，它表面具有較多的化學(xué)基團(tuán)，可通過(guò)調(diào)節(jié)表面的親水性和本身的生理活性促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。殼聚糖也是自然界唯一的帶正電荷的多糖，可以和帶負(fù)電荷的細(xì)胞相互吸引，有利于細(xì)胞粘附。該材料的降解性有利于材料與機(jī)體之間的物質(zhì)交換，材料表面殼聚糖成份的降解更為細(xì)胞的伸入提供了位置，對(duì)形成早期的骨性結(jié)合比較有利。從理論上我們推測(cè)本材料可能隨著殼聚糖的吸收，成骨細(xì)胞長(zhǎng)入，骨組織形成逐漸長(zhǎng)入、連接并和羥基磷灰石形成骨性愈合，最終實(shí)現(xiàn)完全的骨整合。

[參考文獻(xiàn)]

[1]授權(quán)專利：呂曉迎，鄭步中.全天然體外成型硬組織修復(fù)材料制備方法（專利號(hào)：2004100145670）[P].

[2]侯春林，顧其勝. 幾丁質(zhì)與醫(yī)學(xué)[J]. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2001:36-75.

[3]唐曉軍，歸 來(lái)，呂曉迎，等.天然羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合材料骨相容性研究(一) [J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2007，16（1）：31-34.

[4]Torabinejad M， Hong CU， Pitt Ford TR， et al. Cytotoxicity of four root end filling materials[J]. J Endodontics，2006， 21(10):489-492.

[5]Cheung HS， Heak MH. Growth of osteoblasts on porous calcium phosphate ceramic:an in-vitro model for biocompatibility study[J]. Biomaterials，1989，10:63.

[6]Coelhoa MJ， Trigo Cabralb A， Fernandes MH. Human bone cell cultures in biocompatibility testing. Part I: osteoblastic differentiation of serially passaged human bone marrow cells cultured in α-MEM and in DMEM[J]. Biomaterials，2000， 21(11):1087-1094.

[7]Ponsonnet L， Reybier K， Jaffrezic N，et al. Relationship between surface properties (roughness， wettability) of titanium and titanium alloys and cell behaviour[J]. Materials Science and Engineering，2003， 23(4):551-560.

[8]Baier RE， Meyer AE， Natiella JR， et al. Surface properties determine bioadhesive outcomes: Methods and results[J]. J Biom Mater Res，1984，18 ( 4):337-355.

[9]Lee JH， Jung HW， Kang IK， et al. Cell behaviour on polymer surfaces with different functional groups[J]. Biomaterials， 1994， 15 (9):705-711.

[10]藍(lán) 旭，梁 軍，葛寶豐，等. 表面修飾對(duì)羥基磷灰石細(xì)胞相容性的影響[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程研究 ，2007，26（3）：278-281.

[收稿日期]2008-02-26[修回日期]2008-05-11

編輯/張惠娟