同種異體軟骨移植免疫排斥反應(yīng)的研究進(jìn)展

關(guān)節(jié)炎、顳頜關(guān)節(jié)疾病及關(guān)節(jié)機(jī)械損傷以及頜面部美容整形的發(fā)展，都使得軟骨治療成為倍受關(guān)注的對(duì)象，由于軟骨組織中無血管、神經(jīng)及淋巴等供應(yīng)，而軟骨細(xì)胞又為終末分化細(xì)胞，軟骨缺損很難自身修復(fù)，故治療以軟骨移植為主。軟骨移植包括自體、同種異體、異種移植，其中自體軟骨移植來源有限、給患者帶來二次創(chuàng)傷并增加患者疼痛而致應(yīng)用受限，異種移植由于強(qiáng)烈的免疫排斥等問題研究還處在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，而同種異體軟骨移植來源廣泛，生物學(xué)性能良好，可望成為較理想的軟骨移植物，但其存在的免疫排斥反應(yīng)影響移植物在體內(nèi)的長(zhǎng)期存活，是目前研究不容忽視的問題[1]。

1免疫原性來源

1.1軟骨細(xì)胞表面的主要組織相容性抗原（MHC）：軟骨細(xì)胞同其他有核細(xì)胞一樣表面也表達(dá)MHC I類分子[2]，供者和受者細(xì)胞間MHC分子不匹配所誘發(fā)的細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)是引起同種異體軟骨移植免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[3]。許多學(xué)者在人或豬的軟骨組織實(shí)驗(yàn)研究中表明：軟骨細(xì)胞只表達(dá)MHC I類分子，而不表達(dá)MHC II，但與γ-干擾素（IFN-γ）共培養(yǎng)誘導(dǎo)后可表達(dá)MHC II，進(jìn)而發(fā)揮類似抗原提呈細(xì)胞的功能，促進(jìn)免疫排斥反應(yīng)[4-5]。 Romaniuk等[6]進(jìn)行了兔同種異體骺軟骨細(xì)胞移植研究，發(fā)現(xiàn)1周后移植物周圍有大量MHC II+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，這可能也是由于MHC I類分子激發(fā)同種異體淋巴細(xì)胞活化，分泌IFN-γ進(jìn)而誘導(dǎo)所致。

1.2軟骨細(xì)胞特異性分化抗原（CSDA）：Langer等[7]通過分析白細(xì)胞游走試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)同基因軟骨細(xì)胞注射或軟骨刨削后可發(fā)生自身反應(yīng)，首次證實(shí)了軟骨細(xì)胞特異分化抗原(CSDA)的存在。Moskalewski 等[8]在同種異體軟骨移植的大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，間期接受2～3次大鼠軟骨細(xì)胞移植的兔血清中含有高滴度的抗軟骨細(xì)胞的細(xì)胞毒抗體，同時(shí)對(duì)新鮮或培養(yǎng)24h的軟骨細(xì)胞溶胞產(chǎn)物Western blot蛋白分析中檢測(cè)到了一種抗原，而在成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中未檢測(cè)到，表明軟骨細(xì)胞特異性抗原在移植免疫中發(fā)揮了重要作用。Phipatanakul等[9]在進(jìn)行新鮮異體骨軟骨移植的研究中也檢測(cè)到移植物軟骨特殊蛋白抗原的存在。

1.3軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）：軟骨組織由豐富的細(xì)胞外基質(zhì)和少量軟骨細(xì)胞組成，ECM將軟骨細(xì)胞包裹在軟骨陷窩內(nèi)，隔絕了軟骨細(xì)胞與宿主免疫原性分子的相互接觸，形成免疫屏障，預(yù)防或延緩了同種異體軟骨移植的免疫排斥反應(yīng)[10-11]。軟骨基質(zhì)主要由II型膠原和多聚蛋白聚糖(aggrecan)組成，蛋白多糖中的核心蛋白具有抗原性，但被其周圍無抗原性的酸性糖胺多糖所遮蓋，致使其不具有抗原性[12]，這在提取硫酸軟骨素體外免疫實(shí)驗(yàn)中亦得以證實(shí)。對(duì)于II型膠原，有學(xué)者研究指出其存在抗原性，且是一種T細(xì)胞依賴性的抗原，在軟骨組織工程中應(yīng)考慮其抗原性[13]。但由于II型膠原抗原性非常弱，目前的軟骨異體移植研究中幾乎都未將膠原的抗原性考慮在內(nèi)。

1.4 免疫細(xì)胞及相關(guān)組分：自然殺傷細(xì)胞（NK）對(duì)正常的軟骨細(xì)胞具有自發(fā)的細(xì)胞毒效應(yīng)，Anna Romaniuk等[8]在大鼠同種異體軟骨移植研究中指出，CD8+是參與移植軟骨直接破壞的重要細(xì)胞，而CD8標(biāo)記物在NK細(xì)胞上也有分布，表明NK細(xì)胞對(duì)移植的軟骨細(xì)胞也有殺傷作用。而樹突狀細(xì)胞（DC）的抗原提呈作用，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及少許非主要組織相容性抗原等在軟骨移植中均發(fā)揮了重要作用。

1.5 其他：Osiecka-Iwan等[14]研究使用TLCK和膠原酶處理的軟骨細(xì)胞與脾細(xì)胞混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示加TLCK處理組并未引起脾細(xì)胞的刺激作用，而未加TLCK組卻相反，說明在軟骨分離時(shí)所用的II型膠原酶是致免疫源，而該酶在軟骨細(xì)胞中的殘留也是軟骨移植免疫反應(yīng)的一個(gè)來源。另外，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中缺損模型的制備方法以及所選動(dòng)物的近交程度均對(duì)軟骨移植的免疫排斥有影響。

2軟骨免疫反應(yīng)機(jī)制

軟骨細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性抗原(MHC)I類分子，有些動(dòng)物還表達(dá)MHC II 類分子，如兔和小鼠[15]。而人和豬只表達(dá)I類，受體和供體的MHC分子不匹配所誘導(dǎo)的T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)是同種異體軟骨移植發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的關(guān)鍵。

軟骨移植免疫反應(yīng)發(fā)生的途徑包括：①CD8+ T細(xì)胞即殺傷T細(xì)胞(Tc)識(shí)別MHC I類分子而引起的對(duì)靶細(xì)胞的直接殺傷作用；②NK細(xì)胞對(duì)異體細(xì)胞的殺傷作用；③誘導(dǎo)性的MHC II分子-CD4+ T細(xì)胞間接識(shí)別免疫途徑；④樹突狀細(xì)胞(DC)對(duì)靶細(xì)胞的作用，即抗原提呈作用。而在整個(gè)免疫排斥反應(yīng)中淋巴細(xì)胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ等發(fā)揮了重要作用。

同種異體軟骨移植后，移植物外周暴露的軟骨細(xì)胞上的MHC I分子被受體CD8+T細(xì)胞識(shí)別，并與其表面受體(TCR)結(jié)合，進(jìn)而激活Tc細(xì)胞，活化的Tc細(xì)胞會(huì)釋放胞漿內(nèi)顆粒：穿孔素(peiforin)和顆粒酶(granzyme)，前者在靶細(xì)胞膜上穿孔，后者是胰蛋白酶或糜蛋白酶類物質(zhì)，它們對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用很快，使軟骨細(xì)胞在數(shù)分鐘內(nèi)迅速被溶解；同時(shí)它釋放的效應(yīng)分子可活化靶細(xì)胞內(nèi)核酸酶，破壞靶細(xì)胞的DNA，從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡；另外，活化的Tc還表達(dá)配體Fasl，它可與靶細(xì)胞上的受體Fas分子（又稱CD95）結(jié)合，促使靶細(xì)胞凋亡，而T細(xì)胞表面也表達(dá)有Fas，故Tc活化后也可殺死自身或相鄰表達(dá)Fas的T細(xì)胞，即為活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，此過程對(duì)免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)或維持自身耐受很重要。

Tc細(xì)胞活化后還會(huì)釋放細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-β等。IFN-γ可刺激抗原提呈細(xì)胞（APC）表達(dá)MHC II類分子，進(jìn)而被宿主的CD4+T細(xì)胞所識(shí)別，促進(jìn)Th1/Th2活化，釋放IL-2等因子，引起更強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。柳子星等[16]將IFN-γ與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞可表達(dá)MHC II類分子，使其發(fā)揮類似抗原提呈細(xì)胞(APC)功能，這進(jìn)一步證實(shí)了IFN-γ的刺激作用，并說明軟骨細(xì)胞移植后還誘導(dǎo)了MHC II類分子表達(dá)，從而激活了MHC II分子-CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)途徑。同時(shí)IFN-γ還具有增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，促進(jìn)CTL成熟等特點(diǎn)。

正常情況下，MHC I類分子和KIR(NK細(xì)胞的抑制性受體)相結(jié)合，有效阻止了NK對(duì)自身正常組織的攻擊，但KIR不能識(shí)別同種異基因或異種細(xì)胞的MHC I類分子，故在同種異體軟骨移植中無法轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)，致使NK細(xì)胞處于激活狀態(tài) ，從而殺傷異體軟骨細(xì)胞。另外由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中所釋放的細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-2均可進(jìn)一步增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

3免疫反應(yīng)的處理

同種異體軟骨移植后有較強(qiáng)的免疫排斥反應(yīng)，為了維持軟骨移植后的穩(wěn)定，目前降低異體軟骨移植免疫排斥反應(yīng)的方法主要有以下幾種：

3.1 MHC分子的配型：Stevenson 等[17]在犬的同種異體軟骨移植實(shí)驗(yàn)中，對(duì)軟骨細(xì)胞的MHC配型或不配型的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，不配型移植組較配型移植組免疫反應(yīng)嚴(yán)重，有學(xué)者主張建立軟骨細(xì)胞庫，以便為軟骨移植提供合適的供體。

3.2 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)：曹誼林等[18]應(yīng)用FasL-pLNCX2基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染豬的軟骨細(xì)胞，使FasL基因轉(zhuǎn)入豬的軟骨細(xì)胞中并有效表達(dá)，首先在體外證實(shí)了FasL+軟骨細(xì)胞能有效殺傷Fas靶細(xì)胞，應(yīng)用該細(xì)胞構(gòu)建的組織工程軟骨進(jìn)行同種異體移植的進(jìn)一步研究表明， FasL+軟骨細(xì)胞在體內(nèi)可形成軟骨組織，且移植物局部免疫反應(yīng)有所降低，表明該技術(shù)有利于發(fā)揮抑制免疫反應(yīng)的作用。

3.3免疫抑制劑的應(yīng)用：為了克服免疫排斥反應(yīng)，許多學(xué)者還嘗試像器官移植一樣采用免疫抑制劑來處理。Osiecka-Iwan 等[14]在大鼠同種異基因軟骨移植后，應(yīng)用環(huán)孢霉素A和克拉屈濱藥物處理，移植5周后觀察脾細(xì)胞－軟骨細(xì)胞混合培養(yǎng)中脾單核細(xì)胞(SMC)的刺激作用，發(fā)現(xiàn)單純同種異體移植者SMC刺激作用強(qiáng)烈，聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制劑者則無刺激作用，表明免疫抑制劑可抑制異體軟骨移植的免疫排斥反應(yīng)，且對(duì)全身反應(yīng)的作用較局部反應(yīng)更為明顯。

3.4 深低溫凍存：深低溫凍存尤其是程序性降溫可明顯地減輕軟骨細(xì)胞抗原性，從而預(yù)防性地降低移植后的免疫排斥反應(yīng)[19]，該現(xiàn)象可能的解釋有：①低溫冷凍選擇性去除或減少了過路淋巴細(xì)胞，或喪失了對(duì)過路淋巴細(xì)胞的免疫刺激能力，從而導(dǎo)致了抗原性降低；②深低溫凍存降低了移植軟骨樹突狀細(xì)胞的數(shù)量和功能，減少了抗原提呈作用[20]。但該方法會(huì)影響細(xì)胞的活力，Acosta 等[21]研究表明，冰凍較4℃保存相比，盡管可以提供更多數(shù)量的活細(xì)胞，但成冰作用的壞死、滲透性的改變以及凋亡過程等都直接降低了細(xì)胞活力，并且導(dǎo)致炎性物質(zhì)的釋放和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)。

3.5鈷60(Co60)照射處理：有學(xué)者報(bào)道術(shù)前應(yīng)用Co60照射肋軟骨，可降低同種異體肋軟骨的抗原性，減輕炎癥反應(yīng)，減少軟骨吸收[22]。

另外，還有一些方法可不同程度地降低軟骨的免疫原性。張晨等[23]報(bào)道采用低滲的Triton X-100為主的脫細(xì)胞方法脫去人耳軟骨細(xì)胞，使人耳軟骨抗MHC I反應(yīng)由陽性轉(zhuǎn)為陰性，有效地去除了移植物的抗原性。此外，軟骨細(xì)胞在分離和體外培養(yǎng)過程中酶消化也可能造成膜受體丟失，從而降低了細(xì)胞的抗原性[24]。

4展望

軟骨移植免疫反應(yīng)降低或預(yù)防措施目前取得了一定的成效，但尚無理想的方法，且多是通過純粹的免疫學(xué)途徑來進(jìn)行干預(yù)。眾所周知，軟骨移植物的破壞及排斥反應(yīng)的發(fā)生主要是由于細(xì)胞外基質(zhì)降解致軟骨細(xì)胞暴露，進(jìn)而細(xì)胞膜表面的MHC分子與宿主免疫性物質(zhì)相接觸所引起[11]。據(jù)此推想，今后的研究是否可以從基質(zhì)降解的始動(dòng)環(huán)節(jié)入手，通過抑制負(fù)責(zé)基質(zhì)降解的酶來保持基質(zhì)的完整性，發(fā)揮其免疫屏障作用，以降低軟骨移植的免疫排斥反應(yīng)，從而保持軟骨移植物在體內(nèi)的長(zhǎng)期存活。

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[收稿日期]2007-12-19 [修回日期]2008-02-20

編輯/李陽利

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文?！?/p>