３Ｙ－ＴＺＰ全瓷材料體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（ＭＴＴ法）

[摘要]目的：初步評價(jià)牙科全瓷材料3Y-TZP生物相容性。方法：根據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)采用體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)（MTT法）測試不同濃度和浸提時(shí)間的材料浸提液L-929小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞的影響從而對全瓷材料3Y-TZP的生物相容性進(jìn)行初篩。結(jié)果：各濃度組OD值均與陰性對照無顯著性差異（P>0.05），與陽性組差異顯著 (P<0.01)，材料毒性級別0級。結(jié)論：兩種材料體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)陰性，初步認(rèn)為材料具有較好的生物相容性。

[關(guān)鍵詞]3Y-TZP；生物相容性；體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

[中圖分類號]R783[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號]1008-6455（2008）03-03

Preliminary evaluation on biocompatibility ofall-ceramic dental material:3Y-TZP

LI Guo-hua1，GONG Zhen-yu1，YU Shu-xiang2，CHEN Ji-hua3

(1.Department of Stomatology， Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command， Fuzhou 350025，F(xiàn)ujian，China)

Abstract: Objective To preliminarily evaluate the biocompatibility of 3Y-TZP which were used as a new dental all-ceramic materials. Methods According to ISO standards， in vitro cytotoxicity-test (MTT method) on L-929 cell were carried on. Results The OD-value of each test group were similar to the negative control and significantly different from positive control which indicated that the materials tested were safe to L-929 cells. Conclusion It is preliminarily estimated that 3Y-TZP is a safe material for dental clinical application.

Key words：3Y-TZP;biocompatibility;vitro cytotoxicity-test(MTT method)

隨著人們對審美要求的不斷提高，越來越多的修復(fù)專業(yè)人士及患者樂于接受色澤逼真，無齦緣灰線的全瓷修復(fù)體。以往的全瓷材料因脆性大使其臨床應(yīng)用尤其是后牙橋、多單位長橋受到限制，氧化鋯具有應(yīng)力誘發(fā)相變增韌性能而被稱為韌性陶瓷，是最有希望替代金屬烤瓷的全瓷材料[1-2]。目前國內(nèi)外的此類產(chǎn)品研究方興未艾。良好的生物相容性是生物材料包含牙科材料得以應(yīng)用的重要前提，也是保證臨床安全的重要技術(shù)指標(biāo)。因此針對這種材料的生物學(xué)評價(jià)是十分必要和重要的。本研究采用體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的方法檢測該材料對細(xì)胞生長狀況的影響，從而初步評價(jià)其生物相容性。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：3mol%氧化釔穩(wěn)定的四方多晶氧化鋯（3Y-TZP）全瓷材料試件；受試細(xì)胞株：小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞（L-929細(xì)胞），ISO推薦；主要試劑與設(shè)備：①M(fèi)TT：全稱為3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑溴鹽（Sigma，USA）；實(shí)驗(yàn)前用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）新鮮配制，0.22μm微孔濾菌器過濾除菌；②DMSO（西安化學(xué)試劑廠）：全稱為二甲基亞砜；③DMEM培養(yǎng)液，10%小牛血清；④BioRAD Model-550酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀；⑤Heraus二氧化碳孵箱；⑥Olympus IX-70倒置相差顯微鏡。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1陶瓷材料浸漬液的制備：將實(shí)驗(yàn)材料所作試件打磨圓鈍后，無水乙醇超聲清洗20min，干燥后在121℃，33MPa壓力下滅菌處理后放入無菌培養(yǎng)皿，加入10mlDMEM培養(yǎng)液（表面積與浸提液之比為1.5cm2/ml）后置于37℃培養(yǎng)箱中浸泡24h，制成浸提液。完成后用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋，制備100%、50%、25%、12.5%的浸提液，放入4℃冰箱保存。

1.2.2凍存L-929細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過兩次傳代，生長情況穩(wěn)定。取對數(shù)生長期的受試細(xì)胞系，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度約1 000個(gè)/ml，接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板（200μl/孔，n=4）置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，在飽和濕度條件下培養(yǎng)24h。

1.2.3準(zhǔn)備4塊96孔培養(yǎng)板，分別用于連續(xù)培養(yǎng)1、2、4、8天組。每塊培養(yǎng)板按照陰性對照，4個(gè)不同濃度的實(shí)驗(yàn)組，陽性對照，空白對照組（調(diào)零）劃區(qū)分組，每組樣本5孔。

1.2.4觀察細(xì)胞貼壁良好后，棄去原培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)分組分別將當(dāng)日要用的不同濃度的材料浸提液按10%的濃度加入小牛血清，后加入各實(shí)驗(yàn)組（200μl/孔），陰性對照為DMEM培養(yǎng)液，加入血清的培養(yǎng)液，單純浸提液。陽性對照為0.1%苯酚，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.5 MTT檢測：分別培養(yǎng)1、2、4、8天（其中4天與8天組需要隔3天換液一次），終止培養(yǎng)前4h加入0.5%MTT（20μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO150μl置于室溫下15～20min，震蕩培養(yǎng)板10min使染色均勻，采用酶聯(lián)檢測儀在490nm波長測定各孔光吸收值（OD值），計(jì)算出各組的均值。

1.2.6采用倒置相差顯微鏡，觀察細(xì)胞形態(tài)，于MTT檢測前對細(xì)胞照相。

1.2.7評價(jià)方法：計(jì)算出每種材料的陰性對照和各濃度組的OD均值（n=4）。以陰性對照的OD值作為100%細(xì)胞增殖率，則各濃度組的細(xì)胞增殖百分率可依式P%=各濃度組OD均值/陰性對照組OD均值×100%求出，將浸提液各濃度組的P%轉(zhuǎn)化為0～5級細(xì)胞毒性：

2結(jié)果（見表1～4，圖1～4）

培養(yǎng)同樣的培養(yǎng)時(shí)間各濃度實(shí)驗(yàn)組的OD值之間沒有明顯的差異（P＞0.05）；隨培養(yǎng)時(shí)間延長，各濃度組OD值都逐漸增高，不同濃度的各實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組之間無顯著性差異（P＞0.05）；各實(shí)驗(yàn)組均與陽性對照組有顯著差異（P＜0.01）?？梢哉J(rèn)為實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞毒性分級與陰性對照同為0級，陽性對照毒級為5級。根據(jù)細(xì)胞增殖曲線可見：各濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖曲線都與陰性對照組走勢相似，與陽性對照組差別明顯。

圖2～4分別為MTT檢測前陰性對照組8天、100％濃度的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)8天及陽性對照組培養(yǎng)1天細(xì)胞的照片。可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)良好，為長梭形和多角形，并可見圓形分裂細(xì)胞，表明細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞折光性強(qiáng)，與陰性對照組相似。陽性對照組正常細(xì)胞形態(tài)消失，核固縮或溶解，漂浮在培養(yǎng)液中。染色后，實(shí)驗(yàn)組MTT結(jié)晶物密度與陰性對照組相似，呈現(xiàn)為透明的藍(lán)紫色，陽性組染色后變色不明顯。

3討論

為了檢測牙科材料的生物相容性，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)常常是材料初選時(shí)的必測項(xiàng)目[3]。本實(shí)驗(yàn)采用間接接觸方法，通過細(xì)胞的增殖率來測定細(xì)胞的生長增殖情況，從而間接檢測材料對細(xì)胞的毒性作用。在正常培養(yǎng)基中，L-929細(xì)胞通過有絲分裂呈指數(shù)增長，當(dāng)有外來因素影響其生長時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞粘附力、細(xì)胞生物合成活性及細(xì)胞增殖率的下降，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。本實(shí)驗(yàn)基于此原理，通過材料對細(xì)胞增殖率的影響大小，來判定材料的體外細(xì)胞毒性程度。

MTT法的原理是生活細(xì)胞線粒體上的琥珀酸脫氫酶可與外源性的MTT發(fā)生氧化還原反應(yīng)，被還原成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶物沉積于細(xì)胞內(nèi)，而死細(xì)胞無此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，然后酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定光吸收值，就可以間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量[5]。目前國際上在評價(jià)一種細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法時(shí)，往往把該方法的生物學(xué)終點(diǎn)和其證實(shí)過程放在首位，即看該方法最終測定的是細(xì)胞哪個(gè)方面的生物學(xué)變化。如觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞核計(jì)數(shù)及測定細(xì)胞的酶活性改變等。MTT試驗(yàn)法的生物學(xué)終點(diǎn)是重要的細(xì)胞器-線粒體，線粒體在細(xì)胞的生命活動(dòng)中是一個(gè)能量供應(yīng)站，其數(shù)目在細(xì)胞生命活動(dòng)旺盛時(shí)增多，衰退時(shí)則減少。線粒體病變被認(rèn)為是表示細(xì)胞受損傷最靈敏的指征。MTT試驗(yàn)法用線粒體作為其生物學(xué)終點(diǎn)，可以十分靈敏地反映出被測試材料對細(xì)胞造成的毒性損害程度。

MTT試驗(yàn)法具有通用性，廣泛用于各種器械材料的評價(jià)。通?？梢愿鶕?jù)生活細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，死亡分解的細(xì)胞數(shù)量和彌散范圍等方面來衡量，將細(xì)胞增殖度法與細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合，可以更加有效地評價(jià)材料的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性與被測材料的量尤其是表面積有關(guān)[6]，本實(shí)驗(yàn)為此設(shè)計(jì)了不同濃度的浸提液比較，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果無顯著性差異，也從側(cè)面說明本實(shí)驗(yàn)材料對細(xì)胞沒有毒性。

4結(jié)論

從毒性評級比較，本實(shí)驗(yàn)所檢測的3Y-TZP全瓷材料的毒級為0級，可認(rèn)為對細(xì)胞無毒，即該材料屬于惰性材料，不會(huì)干擾生物細(xì)胞的正常功能，可以初步認(rèn)為該材料對人體是安全的。

[參考文獻(xiàn)]

[1]李國華，陳吉華.粉體粒度對全瓷材料3Y-TZP力學(xué)性能與顯微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2007，16（1）：91-95.

[2]上海生物材料研究測試中心譯，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織7406技術(shù)報(bào)告.牙科材料的生物學(xué)評價(jià)[J].口腔材料器械雜志，1995；4(1)：41-46.

[3]Stanley HR. Biological evaluation of dental materials[J].Int Dent J，1992，42(1):37-46.

[4]Mollnes TE. Biocompatibility: complement as mediator of tissue damage and as indicator of incompatibility[J]. Exp Clin Immunogenet，1997，14(1):24-29.

[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods，1983，65(1-2):55-63.

[6]Meryon SD.The influence of surface area on the in vitro cyto－toxicity of a range of dental materials[J].J Biomed Mat Res，1987，21:1179-1186.

[收稿日期]2007-12-17[修回日期]2008-01-31

編輯/何志斌