ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信號通路在ＣＴＧＦ促人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用

[摘要]目的：探討磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路是否介導(dǎo)結(jié)締組織生長因子促人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。方法：體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分3組：①空白對照組；②結(jié)締組織生長因子（10ng/ml）刺激組；③磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002（10μmol/L）預(yù)處理后結(jié)締組織生長因子刺激組。應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測48h后a-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測a-平滑肌肌動蛋白陽性細(xì)胞百分率。 結(jié)果：和空白對照組相比，結(jié)締組織生長因子刺激組細(xì)胞a-平滑肌肌動蛋白表達(dá)和陽性細(xì)胞百分率升高；經(jīng)磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002預(yù)處理后，再以結(jié)締組織生長因子刺激，細(xì)胞a-平滑肌肌動蛋白表達(dá)和陽性細(xì)胞百分率升高水平下降，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差別具有顯著性（P＜0.05）。 結(jié)論：結(jié)締組織生長因子能夠促進(jìn)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路介導(dǎo)該效應(yīng)，磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002 可抑制此效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]結(jié)締組織生長因子；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；轉(zhuǎn)分化；a-平滑肌肌動蛋白

[中圖分類號]R619+.9[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-

Effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B( PI3K/PKB) signal pathway

LIU Jian-yi，LI Shi-rong

（Department of Plastic and Cosmetic Surgery， Southwest Hospital， the Third Military Medical University， Chongqing， 400038， China）

Abstract： ObjectiveTo explore if the effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts is mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B(PI3K/PKB) signal pathway. MethodsHuman hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro. The cells were divided into three groups: ①control group，②connective tissue growth factor（10 ng/ml）stimulated group，③PI3K inhibitor LY294002（10μmol/ L）pretreated and connective tissue growth factorstimulated group. The expression of a-smooth muscle actin was examined by western blot in human hypertrophic scar fibroblasts after 48 hours. The positive ratio of a-smooth muscle actin was examined by flow cytometry.ResultsCompared with the control group， the expression and the positive ratio of a-smooth muscle actin in the connective tissue growth factor stimulated group increased. The raise level of a-smooth muscle decreased after the pretreatment of PI3K inhibitor LY294002. The results were markedly different by statistic analysis（P<0.05）.ConclusionConnective tissue growth factor can promote the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts mediated by PI3K/PKB signaling pathway. This effect can be inhibited by LY294002.

Key words: connective tissue growth factor; hypertrophic scar; fibroblast; phosphatidylinositol 3-kinase; protein kinase B; transdifferentation; a-smooth muscle actin

增生性瘢痕（hypertrophic Scar，HS）是人類皮膚真皮損傷后以成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)如膠原等過度沉積為特征的皮膚纖維化疾病，其中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞后促纖維化功能明顯增強(qiáng)。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一種具有強(qiáng)烈促纖維化作用的生長因子，具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用[1]。磷脂肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路（PI3K /PKB）參與CTGF促HS纖維化（另文發(fā)表），但是否介導(dǎo)促轉(zhuǎn)分化效應(yīng)，尚未見報(bào)道。本研究擬應(yīng)用CTGF刺激人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（hypertrophic Scar fibroblast，HSF），檢測細(xì)胞a-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)，并應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002 進(jìn)行阻斷，以初步明確PI3K /PKB信號通路在其中的作用。

1材料和方法

1.1 主要試劑：人重組CTGF購自美國peprotech公司。小鼠抗人a-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。PI3K特異性抑制劑LY294002、辣根過氧化物酶連接的“二抗”、生物素化的蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其抗體以及化學(xué)發(fā)光試劑均購自美國Cell Signaling Technology公司。預(yù)染的蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自美國Promega 公司。DMEM培養(yǎng)基和新生小牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)所用HS組織取自我科因HS自愿行手術(shù)治療的患者，均為創(chuàng)面愈合3個月以上瘢痕仍持續(xù)增生者，術(shù)前均取得患者同意，所取HS特點(diǎn)為外觀發(fā)紅、充血、質(zhì)硬、高出皮面1cm以上，瘢痕增生局限于皮損區(qū)，局部伴瘙癢或疼痛等不適，共6例，其中男性4例，女性2例，年齡21～40歲，平均29.2歲。用酶消化法分離成纖維細(xì)胞，于37 ℃，CO2體積百分?jǐn)?shù)5%的孵箱中培養(yǎng)，傳代，實(shí)驗(yàn)用第5～7代細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，將細(xì)胞以8×105/瓶接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，先用10% FBS－DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，待細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合后，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，使細(xì)胞達(dá)到同步，棄去培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分3組：①空白對照組；②結(jié)締組織生長因子（10ng/ml）刺激組；③磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002（10μmol/L）預(yù)處理后結(jié)締組織生長因子刺激組（先用10μmol/L LY294002 作用細(xì)胞60min，再與10ng/ml CTGF共同作用細(xì)胞30min）。

1.2.2 western blot法檢測a-平滑肌肌動蛋白表達(dá)：采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 和免疫印跡雜交法。①藥物作用：以10ng/ml CTGF作用HSF 48h；②細(xì)胞總蛋白的提?。簵壢ニ幬?，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS) 沖洗細(xì)胞，立即加入1×SDS 上樣緩沖液（含62.5 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，2% SDS，10%甘油，50mmol/L 二硫蘇糖醇，0.01%溴酚藍(lán)），迅速刮下細(xì)胞，冰上裂解，冰上細(xì)胞超聲15～20s，離心，取上清液于-70℃保存；③ SDS-PAGE和免疫印跡雜交：各取20μl 細(xì)胞裂解提取物，95℃變性5min，上樣，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜后封閉，加入小鼠抗人a-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(1∶500)，4 ℃過夜，洗膜，加入二抗室溫下作用1h，洗膜后加化學(xué)發(fā)光液，X線片曝光，對蛋白條帶進(jìn)行吸光度(A) 值測定。內(nèi)參照采用GAPDH。蛋白含量以a-平滑肌肌動蛋白和內(nèi)參蛋白的平均光密度(OD)×面積(mm2)的比值來表示。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測a-平滑肌肌動蛋白陽性細(xì)胞百分率：制備細(xì)胞懸液，收集各組細(xì)胞(細(xì)胞培養(yǎng)于75cm2培養(yǎng)瓶中)；PBS漂洗細(xì)胞兩次后，離心，得到細(xì)胞沉淀；4％多聚甲醛固定30min，離心，棄上清；用0.1％皂素(內(nèi)含2%BSA)通透10min，以利于抗體進(jìn)入胞內(nèi)，離心，棄上清；加入鼠抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(1:100)300μl，室溫孵育1h；PBS洗滌兩次后，加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育30 min；PBS洗滌兩次后，重懸于300μl PBS溶液中，行FCM檢測。

1.3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以x±s表示，應(yīng)用SPSS10.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。組間比較應(yīng)用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 a-平滑肌肌動蛋白表達(dá)情況：空白對照組有較少量的a-平滑肌肌動蛋白表達(dá)，當(dāng)外源重組結(jié)締組織生長因子刺激后，a-平滑肌肌動蛋白表達(dá)，而當(dāng)應(yīng)用磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002（10μmol/L）預(yù)處理后再刺激，a-平滑肌肌動蛋白表達(dá)升高較少，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差別具有顯著性（P＜0.05），結(jié)果見圖1、表1。

2.2 a-平滑肌肌動蛋白陽性細(xì)胞百分率：應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測a-平滑肌肌動蛋白陽性細(xì)胞百分率。和空白對照組相比，10ng/ml 結(jié)締組織生長因子刺激組細(xì)胞a-平滑肌肌動蛋白陽性細(xì)胞百分率升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差別具有顯著性（P＜0.05）；經(jīng)磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002（10μmol/L）預(yù)處理后，再以結(jié)締組織生長因子刺激，a-平滑肌肌動蛋白陽性細(xì)胞百分率升高較少，和單純刺激組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差別具有顯著性（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和LY294002預(yù)處理后結(jié)締組織生長因子刺激組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）結(jié)果見表2。

3討論

HS是整形外科領(lǐng)域重點(diǎn)研究內(nèi)容之一，其發(fā)生、發(fā)展主要是由成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和生長因子三者共同的作用導(dǎo)致，而抑制成纖維細(xì)胞的增殖和分化是抗纖維化的中心策略，生長因子在其中起極其重要的調(diào)控作用。在創(chuàng)面愈合瘢痕形成過程中，曾處于靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞增殖并分化，其中70%左右的成纖維細(xì)胞分化為收縮表型，被稱為肌成纖維細(xì)胞。它是介于成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間的終末分化細(xì)胞，能夠分泌大量的膠原和纖維連接蛋白，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積，a-平滑肌肌動蛋白是其標(biāo)志性蛋白[2]。

CTGF是一種新發(fā)現(xiàn)的在纖維化病程中發(fā)揮重要促進(jìn)作用的生長因子[3]，我們前期研究表明它具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的作用[1]，但傳遞此效應(yīng)的的具體細(xì)胞內(nèi)信號通路還不清楚。PI3K/PKB是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PI3K是一種重要的細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，當(dāng)細(xì)胞受生長因子等刺激因子刺激后，細(xì)胞內(nèi)PI3K活化，使其轉(zhuǎn)化為3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），并與其下游分子Akt 結(jié)合，活化的PI3K/Akt 可能通過TSC1/2 復(fù)合物進(jìn)一步激活其中下游分子Mtor、eIF- 4E 結(jié)合蛋白1（4E- BP1）和核糖體蛋白P70S6K，啟動蛋白質(zhì)的翻譯，因此磷酸化的PI3K被認(rèn)為是蛋白質(zhì)合成的主要信號調(diào)節(jié)通路，參與細(xì)胞增生、分化、移行等的調(diào)節(jié)[4-5]。在人腎系膜細(xì)胞中，PKB信號通路在CTGF誘導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)沉積，細(xì)胞遷移和細(xì)胞骨架重排中起作用[6]。亦有研究表明PI3K/PKB通路參與轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程[7]。

我們前期研究結(jié)果表明PI3K/PKB信號通路參與CTGF促HS纖維化（另文發(fā)表），其是否介導(dǎo)CTGF促成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化？我們應(yīng)用了PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理HSF，再以CTGF刺激，結(jié)果表明阻斷后細(xì)胞a-平滑肌肌動蛋白表達(dá)較單純刺激組下降，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)分析a-平滑肌肌動蛋白陽性細(xì)胞百分率亦下降，這說明LY294002阻斷了PI3K/PKB信號通路，導(dǎo)致了a-平滑肌肌動蛋白整體水平下降，外源性CTGF不能通過PI3K/PKB信號通路產(chǎn)生促成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的效應(yīng)，亦即PI3K/PKB信號通路介導(dǎo)了CTGF促成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的效應(yīng)。但該信號通路效應(yīng)對應(yīng)的細(xì)胞核內(nèi)靶信號分子仍有待于進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2007-12-25 [修回日期]2008-03-07

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文?！?/p>