瘢痕疙瘩發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與Ｆａｓ基因－６７０位點(diǎn)多態(tài)性

[摘要]目的：研究Fas基因-670位點(diǎn)多態(tài)性與瘢痕疙瘩發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)-反向點(diǎn)雜交、DNA直接測(cè)序方法，檢測(cè)了75例瘢痕疙瘩患者與120名正常對(duì)照的Fas基因-670多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。結(jié)果：瘢痕疙瘩患者的A等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組(χ2=4.408，P=0.036)。瘢痕疙瘩患者的A/G、G/G基因型頻率與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為1.051和1.134;P值分別為0.305和0.287)，而瘢痕疙瘩患者的A/A基因型頻率明顯高于對(duì)照組(χ2=5.207，P=0.022)。提示A/A基因型者患瘢痕疙瘩的風(fēng)險(xiǎn)性明顯高于A/G、G/G基因型者(OR=2.122，95%CI:1.105～4.077)。結(jié)論：Fas基因-670多態(tài)性位點(diǎn)的基因型檢測(cè)可能對(duì)判斷瘢痕疙瘩高危個(gè)體具有指導(dǎo)意義。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩；Fas基因；多態(tài)性；遺傳易感性

[中圖分類號(hào)]R619+.9[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）03-03

Fas gene -670 polymorphism and susceptibility to keloid in a Chinese population

ZHUO Yang，ZENG Xing-ye， ZHOU Xue-xue，HUANG Da-dao，CAO Xiao-en，HUANG Zheng-lian

（Department of Surgery，the 118th Hospital of PLA，Wenzhou 325000，Zhejiang， China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between Fas-670 polymorphism and susceptibility to keloid in a southern Chinese population.MethodsThe Fas-670 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 75 patients with keloid and 120 unrelated healthy controls.ResultsThe frequency of the Fas-670 A allele among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4. 408，P=0.036). The A/G and G/G genotype distribution among keloid patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=1.051 and 1.134; P=0.305 and 0.287， respectively). However， the A/A genotype frequency among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.207，P=0.022). The Fas-670 A/A genotype significantly increased the risk for developing keloid，compared to the combination of A/G and G/G genotypes，with the odds ratio(OR) of 2.122， (95%CI: 1.105～4.077).ConclusionDetermination of the Fas-670 genotype may be used as a stratification marker to predicate high-risk individuals for keloid.

Key words: keloid; Fas gene; polymorphism; genetic susceptibility

近幾年的研究結(jié)果提示，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的過量增生和凋亡相對(duì)減少在瘢痕疙瘩的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1]。而Fas蛋白是細(xì)胞表面一種與凋亡相關(guān)的抗原，F(xiàn)as介導(dǎo)的凋亡被認(rèn)為是介導(dǎo)死亡信號(hào)傳遞的最主要通道。為此，我們從分子遺傳學(xué)角度，探討Fas基因-670位點(diǎn)多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族人群瘢痕疙瘩發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系， 以便深入地、多層次地解析瘢痕疙瘩的分子生物學(xué)機(jī)制。

1對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象：瘢痕疙瘩患者和正常對(duì)照人群均為浙江地區(qū)漢族居民。瘢痕疙瘩患者均經(jīng)本院臨床及病理診斷證實(shí)，共75例，其中男41例、女34例，年齡9～53歲，病變位于前胸、三角肌區(qū)及耳垂，病史6個(gè)月～15年。正常對(duì)照為有外傷史而無瘢痕疙瘩產(chǎn)生，且無瘢痕疙瘩家族史的健康居民，共120例，其中男69例、女51例，年齡13～60歲，平均年齡29.6歲。用于基因分析的DNA全部來源于研究對(duì)象的外周靜脈血，血樣本用枸櫞酸鈉抗凝，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2聚合酶鏈反應(yīng)-反向點(diǎn)雜交（PCR-RDB）

1.2.1基因組DNA提?。翰捎帽本┵惏賱偕锛夹g(shù)有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 ASO（等位基因特異性寡核苷酸）探針設(shè)計(jì)：應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)探針，氨基標(biāo)記，探針序列分別為：NH2-5′-CATTCCAGGAACGTCTGTGA-3′；NH2-5′- CATTCC AGA AACGTCTGT GA -3′，由上海生工生物公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)：用于擴(kuò)增Fas基因-670位點(diǎn)的引物5′端標(biāo)記了非同位素檢測(cè)介質(zhì)Biotin，引物序列為：Bio-5′- TGTTCACCAGAGCACGAAAG -3′；Bio-5′- GCTGGC ATCTCACTTCAGGT -3′，由上海生工生物公司合成。反應(yīng)在PE-480型擴(kuò)增儀(美國PE公司)上進(jìn)行。在50μl反應(yīng)總體積中，含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎國生物公司)。熱循環(huán)參數(shù)：95℃熱啟動(dòng)2min后，95℃45sec，55℃1min，72℃/2min；共35個(gè)循環(huán) 72℃延伸 10min。取3μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，紫外透射儀下觀察結(jié)果。

1.2.4 雜交：固化上寡核苷酸探針的膜條連同40μlPCR產(chǎn)物加入含5ml 2×SSC～0.1%SDS的試管中，100℃水浴變性7min，置雜交儀中42℃雜交3～6h；然后放入42℃預(yù)熱的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；將膜條轉(zhuǎn)入含2.5U辣根過氧化物酶連鏈酶抗生素蛋白的10ml 2×SSC～0.1%SDS試管中，室溫反應(yīng)15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，將膜條轉(zhuǎn)入20ml顯色液[19ml 0.1mol/L檸檬酸鈉(pH5.0)中加30%過氧化氫3μl和0.1mg/ml TMB]中避光顯色5～15min，期間觀察、記錄結(jié)果。

1.3 為檢驗(yàn)反向點(diǎn)雜交結(jié)果的正確性，隨機(jī)抽取18例PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)分析各組等位基因和基因型頻率分布的差異，并計(jì)算表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidenceinterval，CI)。

2結(jié)果

根據(jù)我們?cè)O(shè)計(jì)的方案，雜交結(jié)束后膜條上格顯示藍(lán)紫色斑點(diǎn)為A/A基因型，中格顯示藍(lán)紫色斑點(diǎn)為G/G基因型，而上、中全部顯示為A/G基因型，下格為空白對(duì)照，無斑點(diǎn)顯示（圖1）。瘢痕疙瘩組和正常對(duì)照組Fas基因多態(tài)性比較如表1、2所示。

實(shí)驗(yàn)中，在瘢痕疙瘩和正常對(duì)照組間的年齡構(gòu)成比例相似，對(duì)照組及瘢痕疙瘩患者組的Fas-670位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡的情況下，結(jié)果顯示：①瘢痕疙瘩組的A等位基因頻率(54.7%)明顯高于正常對(duì)照組(43.8%)(χ2=4.408，P=0.036，P＜0.05)；而瘢痕疙瘩患者的A/G、 G/G基因型頻率分別為40.0%和25.3%， 與正常對(duì)照組相比差異無顯著性 (χ2值分別為1.051和1.134； P值分別為0.305和0.287)；②瘢痕疙瘩組的A/A 基因型頻率為34.7%，明顯高于正常對(duì)照組(χ2=5.207，P=0.022，P＜0.05)。與A/G、G/G基因型相比，A/A 基因型者患瘢痕疙瘩的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性(OR)明顯增高(OR=2.122，95%CI: 1.105～4.077)。我們隨機(jī)抽取的18例PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與反向點(diǎn)雜交結(jié)果完全吻合（圖2），證明了聚合酶鏈反應(yīng)-反向點(diǎn)雜交結(jié)果的正確性。

3討論

近年來，遺傳因素在許多疾病的發(fā)生中所起的重要作用備受重視，且已發(fā)現(xiàn)了多種易感基因的存在。Fas基因即是目前較為關(guān)注的與瘢痕疙瘩疾病相關(guān)的基因之一。人Fas基因組DNA位于染色體10q24上，是全長36Kb的單拷貝基因，由8個(gè)內(nèi)含子及9個(gè)外顯子組成，編碼335個(gè)氨基酸，其全稱是factor associated suicide，又稱CD95/APO-1，屬于NGF/TNF受體家族，其相應(yīng)的配體及單克隆抗體與之結(jié)合后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Fas蛋白包括膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)，F(xiàn)as蛋白的重要功能結(jié)構(gòu)“死亡域”編碼區(qū)位于膜內(nèi)區(qū)[2]。已證實(shí)FasR-FasL系統(tǒng)在調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡中起著重要的作用[3-4]，F(xiàn)as介導(dǎo)的凋亡被認(rèn)為是介導(dǎo)死亡信號(hào)傳遞的最主要通道。

Fas 基因啟動(dòng)子區(qū)域存在兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)[5]，其啟動(dòng)子-670 核苷酸APG多態(tài)性位點(diǎn)位于核轉(zhuǎn)錄元件GAS 中，能影響干擾素的信號(hào)傳導(dǎo)。干擾素與其受體結(jié)合后，激發(fā)了酪氨酸激酶Jak(janus kinases)，使轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)和激活因子-1(signal transducers and activitors of transcription1，STAT1) 酪氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1 形成同源二聚體與GAS元件結(jié)合，誘導(dǎo)含有GAS元件的基因轉(zhuǎn)錄[6]。當(dāng)然其他細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后，也可通過STAT家族成員誘導(dǎo)含有GAS元件的基因轉(zhuǎn)錄[7]。若Fas-670 位點(diǎn)堿基為G，則含有GAS元件的一致序列TTCNNNGAA(N3 位點(diǎn)) ，該序列能被STAT家族的多數(shù)成員識(shí)別[8]，細(xì)胞因子-受體作用激活STATs，從而誘導(dǎo)Fas基因轉(zhuǎn)錄。而堿基A代替G后，則DNA序列變?yōu)門TCNNNAAA，可能影響Fas轉(zhuǎn)錄，影響Fas蛋白表達(dá)。已有報(bào)道其他基因GAS元件能夠影響轉(zhuǎn)錄水平[9]。

國外對(duì)Fas-670位點(diǎn)多態(tài)性與自身免疫性疾病相關(guān)性研究，提示AA 基因型與白種人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床亞型相關(guān)[10]，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化患者A等位基因頻率顯著增高[9-10]。然而，國內(nèi)外尚未見Fas 基因多態(tài)性與瘢痕疙瘩的相關(guān)性研究。本研究初步結(jié)果提示，F(xiàn)as基因-670位點(diǎn)A等位基因及AA基因型是中國浙江地區(qū)人群對(duì)瘢痕疙瘩的易感因素。我們的初步研究結(jié)果對(duì)瘢痕疙瘩的預(yù)測(cè)診斷及篩選具有較大潛在的臨床意義，然而更大樣本、更多地域、多民族的印證研究尚有待完善。

本實(shí)驗(yàn)采用的聚合酶鏈反應(yīng)-反向點(diǎn)雜交方法是由Saiki RK[11]于1989年首次提出，雖然在原理上與正向斑點(diǎn)雜交相似，但卻巧妙地反其道而用之，即反方向的將各種探針固定在基質(zhì)上，用以檢測(cè)受檢的各種標(biāo)記樣品中與探針互補(bǔ)的核酸物質(zhì)的變化。近年來應(yīng)用此法進(jìn)行β-地中海貧血、囊腫性纖維化等疾病的基因診斷，取得較好效果。該方法分辨率高，技術(shù)簡(jiǎn)便、快速、可靠，其檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序符合率高，值得推廣應(yīng)用。

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[收稿日期]2007-11-26 [修回日期]2008-02-27

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。”