溫固化水凝膠負(fù)載骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：探討溫固化水凝膠作為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的載體修復(fù)軟骨缺損的可行性。方法:將培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與400g/L濃度的溫化水凝膠混合后移植到兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損中，分別于術(shù)后4、8、12周觀察大體標(biāo)本及組織學(xué)修復(fù)結(jié)果。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組的缺損為透明軟骨修復(fù)。而單純材料組和空白對照組則以纖維組織修復(fù)。參考Wakitani制定的組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，Pluronic F-127組和空白對照組的組織學(xué)評分在各個(gè)時(shí)期無顯著的差異（P＞0.05），而實(shí)驗(yàn)組和空白組在各個(gè)時(shí)期均存在顯著的差異（P＜0.05）。結(jié)論：Pluronic F-127可作為軟骨組織工程良好的支架材料。

[關(guān)鍵詞]溫固化水凝膠；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；組織工程；軟骨缺損

[中圖分類號]R318.5R684[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-04

The experimental study on bone marrow stromal cells loaded temperature dependent hydrogel on repair of full-thickness defects of rabbit articular cartilage

WANG Jin-ming，ZHANG Qing-guo，ZHAGN Jiao

（School of Clinical Medical College Southeast University， Nanjing 210009，Jiangsu，China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of the temperature dependent hydrogel loading bone marrow stromal cells for repairing articular cartilage defects. Methods Cultured bone marrow stromal cells and 4OOg/Lhydrogelmixture was transplanted to the knee articular cartilage defects in rabbits， after 4， 8 and 12 weeks， Repair of articular cartilage defect was investigated by gross observation and HE stain of histological specimens.Results In the experimental group the defect was repaired by hyaline cartilage. While in the Pluronic F-127 group and control group the defect was repaired by fibrous tissue. Referencing Wakitani developed histological grading scale . Between the Pluronic F-127 group and the control group in the histologic score in each period there was no significant difference (P> 0.05)， while between the experimental group and control group in each period there was significant difference (P<0.05).ConclusionPluronic F-127 can be used as good cartilage tissue engineering scaffold.

Key words: temperature dependent hydrogel; BMSCs; tissue engineering; articular cartilage defect

關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力很弱，是矯形外科一個(gè)非常棘手的問題[1]。很多的方法如關(guān)節(jié)軟骨下骨鉆孔， 骨膜或軟骨膜修補(bǔ)等方法均有待臨床進(jìn)一步應(yīng)用驗(yàn)證［2］。組織工程學(xué)的方法對膝關(guān)節(jié)軟骨損傷有重要的應(yīng)用前景。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs) 含有形成前體細(xì)胞及干細(xì)胞， 可體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞方向分化。而一定濃度的聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯(PEO－PPO－PEO)三嵌段共聚物（Pluronic F-127）水溶液具有在低溫下為液態(tài)而常溫下為固態(tài)的特性，即溫固化水凝膠［3］。本實(shí)驗(yàn)中以BMSCs為種子細(xì)胞，可注射性生物材料Pluronic F-127為支架，在低溫下將此混合物注射到兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損處，觀察其修復(fù)作用。

1材料和方法

1.1材料：DMEM干粉(低糖型)(GIBCO公司)，胰蛋白酶 （SIGMA公司），Percoll細(xì)胞分離液（SIGMA公司），Pluronic F-127（SIGMA公司），50ml培養(yǎng)瓶（丹麥NUNC公司），SW-CJ-IF超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），OLYMPUSCK2光學(xué)倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），GB-B16 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國Heraeus公司）

1.2 方法

1.2.1 溫固化水凝膠的制備：將Pluronic F-127 以1g分裝在青霉素安瓿瓶中密封好，CO60照射滅菌。于超凈臺中在每小瓶材料中加入2.5mlPBS。密封后置于4℃冰箱。

1.2.2 BMSCs的獲取和培養(yǎng)：成年灰兔，體重2.0～2.5kg，分別在全麻、無菌下暴露雙側(cè)髂骨， 16號骨穿針抽取雙側(cè)髂骨骨髓總量約4.0ml，加入等量PBS稀釋，混勻，以1∶4比例加入淋巴細(xì)胞分離液，2 000r/min離心30min，取中間白色云霧狀細(xì)胞層，PBS液洗滌，加入含胎牛血清的DMEM標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液，以1×105/ml細(xì)胞密度接種于50ml培養(yǎng)瓶，37℃下5%CO2、100%濕度孵箱孵育，3天后首次換液，其后根據(jù)細(xì)胞生長情況及培養(yǎng)液顏色確定換液時(shí)間。待細(xì)胞長滿瓶底70％～80%時(shí)傳代，逐日使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長及形態(tài)特征。當(dāng)原代細(xì)胞培養(yǎng)7～9天時(shí)細(xì)胞融合為單層，占瓶底80%以上，0.25%胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)至第三代備用。

1.2.3 BMSCs與Pluronic F-127復(fù)合物的制備：取生長良好的第三代BMSCs四瓶消化，1500r/min離心5 min，得細(xì)胞沉淀，以1ml 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)約為1×107[4]。在5ml離心管中加入Pluronic F-127溶液 0.5ml，細(xì)胞懸液0.5ml。密封于離心管，置于4℃冰箱。

1.2.4 動物實(shí)驗(yàn)：健康灰兔27只，體重2.5～3.5kg ，雌雄不限，編號后隨機(jī)分成A、B、C三組，每組九只，雙膝均用于實(shí)驗(yàn)。用3 %戊巴比妥鈉(1mg/kg) 靜脈麻醉，仰臥位固定，剪毛、常規(guī)消毒鋪巾，取髕骨內(nèi)側(cè)切口，依次切開各層，髕骨向外側(cè)脫位， 屈曲膝關(guān)節(jié)， 充分暴露股骨關(guān)節(jié)軟骨面， 用直徑4mm鉆頭于股骨關(guān)節(jié)面中心造成深度約3mm的全厚關(guān)節(jié)軟骨缺損。A組：（18膝）缺損處注入細(xì)胞、材料及生長因子三者的復(fù)合物。B組：（18膝）缺損處單純注入400g/L Pluronic F-127凝膠。C組：（18膝）缺損處不做任何處理，為空白對照。髕骨復(fù)位，逐層縫合。同條件分籠飼養(yǎng)，自由活動。

1.2.5 結(jié)果檢測：分別于術(shù)后4、8、12周空氣栓塞處死動物，取材，行大體及組織學(xué)觀察：①大體觀察：膝關(guān)節(jié)活動情況，關(guān)節(jié)滑膜有無充血水腫，關(guān)節(jié)囊有無增厚粘連及關(guān)節(jié)面缺損修復(fù)的平整度及光澤度；②組織學(xué)檢測：取材后10%福爾馬林固定48h，5%硝酸脫鈣液脫鈣24h，沖洗、系列酒精脫水、石蠟包埋、5μm切片、HE 染色光鏡觀察

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：參考Wakitani制定的組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)［5］（表1），所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料以x±s表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，α值取0.05。

2結(jié)果

2.1 功能評價(jià)：術(shù)后3天內(nèi)，兔膝關(guān)節(jié)活動受限，活動較少。隨后運(yùn)動逐漸增加，屈曲姿態(tài)和跳躍動作逐漸正常，1周內(nèi)恢復(fù)正常。

2.2 大體形態(tài)觀察：膝關(guān)節(jié)無紅腫，關(guān)節(jié)囊無明顯增生肥厚，無攣縮、粘連；關(guān)節(jié)液清亮。

2.2.1 A組：術(shù)后4周，填充物與周圍正常軟骨分界清楚，大部分呈淡紅色半透明，缺損填充物周邊部見部分呈乳白色；填充物表面平整光滑，與周圍正常軟骨連接良好，高度基本一樣或略微凹陷；觸之微韌，與周圍正常軟骨能分離。術(shù)后8周，填充物與周圍軟骨分界不明顯，呈乳白色，與正常軟骨顏色接近，表面光滑，與周圍軟骨連接好，高度與周圍軟骨基本一致；觸之質(zhì)韌，與周圍正常軟骨不能分離。術(shù)后12周，填充物與周圍正常軟骨分界模糊，呈乳白色，填充物表面平整光滑，與周圍軟骨連接好，高度與周圍軟骨基本一致；觸之質(zhì)韌，與周圍正常軟骨基本一致，與周圍正常軟骨不能分離（圖1）。

2.2.2 B組：術(shù)后4周，填充物與周圍正常軟骨分界清楚，大部分呈半透明狀，周邊部見部分呈白色，填充物表面平整光滑，與周圍正常軟骨連接良好，高度基本一樣或略微凹陷；觸之微韌，與周圍正常軟骨能分離。術(shù)后8周，填充物與周圍軟骨分界不明顯，呈白色，表面略粗糙，與周圍軟骨連接好，高度略微低于周圍正常軟骨；觸之質(zhì)韌，與周圍正常軟骨不能分離。術(shù)后12周，填充物與周圍正常軟骨分界不清楚，呈白色，填充物表面凹陷不平，與周圍軟骨連接好，高度略低于周圍正常軟骨；觸之質(zhì)硬，與周圍正常軟骨不能分離(圖2)。

2.2.3 C組：術(shù)后4周，缺損區(qū)由白色組織填充，可見血凝塊甚者部分缺損區(qū)骨質(zhì)裸露無組織覆蓋，表面粗糙，與周圍正常軟骨連接不佳，高度低于周圍正常軟骨；觸之軟，與周圍正常軟骨能分離。術(shù)后8周，缺損區(qū)由白色組織填充，周邊可見部分裸露骨質(zhì)無組織覆蓋，表面粗糙不平，高度低于周圍軟骨，觸之質(zhì)韌，與周圍正常軟骨不能分離。術(shù)后12周，缺損區(qū)由白色組織填充，周邊可見部分裸露骨質(zhì)無組織覆蓋，表面粗糙不平，高度低于周圍軟骨，觸之硬，與周圍正常軟骨不能分離（圖3）。

2.3組織學(xué)觀察

2.3.1 A組：術(shù)后4周，缺損填充區(qū)可見增殖的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞排列不規(guī)則，成簇生長，細(xì)胞形態(tài)較少，基質(zhì)較少，表面可見部分纖維樣組織，可見不連續(xù)的軟骨下骨(圖4)。術(shù)后8周，缺損填充區(qū)可見軟骨細(xì)胞增多，基質(zhì)較多，細(xì)胞周圍可見典型的陷窩樣結(jié)構(gòu)，軟骨下骨連續(xù)性好(圖5)。術(shù)后12周，缺損填充區(qū)形態(tài)與周圍正常軟骨相似，細(xì)胞形態(tài)、排列，基質(zhì)量接近周圍正常軟骨(圖6)。

2.3.2 B組：術(shù)后4周，缺損填充區(qū)主要被纖維樣組織覆蓋，可散在見軟骨細(xì)胞，軟骨下骨生成較少。術(shù)后8，12周，缺損填充區(qū)同樣主要為纖維樣組織覆蓋，軟骨下骨逐漸增厚與正常接近(圖7)。

2.3.3 C組：修復(fù)各個(gè)時(shí)期，缺損區(qū)均為纖維組織覆蓋，無軟骨細(xì)胞。軟骨下骨逐漸增厚(圖8)。

2.4統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：A、B、C三組在4、8、12周時(shí)所采集的數(shù)據(jù)，以x±s表示（表2），采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異顯著。實(shí)驗(yàn)組（A組）和空白對照組相比在各個(gè)時(shí)期均有顯著性差異(P＜0.05 )，單純材料組（B組）和空白對照組相比在各個(gè)時(shí)期無顯著性差異（P＞0.05）。

3討論

成熟的關(guān)節(jié)軟骨損傷后其自我修復(fù)的能力十分有限，一般認(rèn)為直徑小于3mm的缺損可得到部分或全部的修復(fù)，而直徑大于4mm的缺損一般不能以透明軟骨形式修復(fù)[6]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了約直徑4mm、深3mm的關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。

軟骨細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增修復(fù)軟骨缺損多有報(bào)道，但細(xì)胞獲取及擴(kuò)增均較困難[7]，且軟骨細(xì)胞修復(fù)軟骨下骨效果不佳。BMSCs 能夠根據(jù)微環(huán)境信號的指令分別分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞， 適合于伴有軟骨下骨損傷的軟骨缺損修復(fù)。由于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的乏氧環(huán)境和關(guān)節(jié)液中各種細(xì)胞因子的作用， 促使骨髓BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化形成軟骨組織。而缺損底部鄰近髓腔， 較高的氧分壓促使骨髓BMSCs 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成骨小梁。軟骨和骨小梁的形成有利于修復(fù)組織與鄰近正常組織的結(jié)合。這樣， 軟骨層及軟骨下層的骨缺損都能修復(fù)而形成正常的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)[8]。

本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯(PEO－PPO－PEO) 三嵌段共聚物具有良好的生物相容性和良好的生物降解性［9-10］。它最大的特點(diǎn)是濃度大于100g/L的水溶液都有一個(gè)凝膠化溫度， 當(dāng)溫度低于凝膠化溫度時(shí)， 粘度很低，為粘性流體， 溫度超過凝膠化溫度時(shí)， 粘度急劇增高， 變?yōu)槟z。400g/L時(shí)凝膠化溫度約為4℃。因此我們可在低溫下將此材料和細(xì)胞混合后注射至缺損區(qū)，操作上有了極大的便利。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯(PEO－PPO－PEO) 三嵌段共聚物與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合物能以透明軟骨方式修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，而單純材料組和空白對照組則以纖維樣組織修復(fù)缺損，不能以透明軟骨方式修復(fù)。

因此溫固化水凝膠聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯(PEO－PPO－PEO) 在軟骨組織工程中將有良好的應(yīng)用前景。

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[收稿日期]2007-12-15[修回日期]2008-03-10

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文?！?/p>