[摘要]目的:評估外用葡萄籽提取物原花青素對急性光損傷的Fas蛋白及Bcl-2蛋白表達的影響。方法:實驗設計正常皮膚組、單純2MED照射組、基質(zhì)+2MED照射組、含葡萄籽提取物原花青素樣品外用+2MED照射組共四組,連續(xù)3天同樣處理24h后對皮膚取材,進行Fas蛋白及Bcl-2蛋白免疫組化染色。結果:含葡萄籽提取物原花青素樣品外用+2MED照射組的Fas蛋白表達積分與單純2MED照射比較明顯下降,Bcl-2蛋白表達積分明顯增加,接近正常皮膚。結論:葡萄籽提取物原花青素對日曬傷具有一定的防護作用,其機制可能是與Fas蛋白及Bcl-2蛋白表達相關。
[關鍵詞]葡萄籽提取物原花青素;光損傷;Fas 蛋白, Bcl-2蛋白
[中圖分類號]R758.14Q591.2[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2008)03-03
Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on protein expression from acute ultraviolet injury
YUAN Xiao-ying1,LIU Wei1,XIE Yan-fei,GUO Guang-jin1,MENG Ru-song1,F(xiàn)AN Li-ying1,ZHANG Jie1,TIAN Yan1,MA Hui-min1,XIN Xu-ya1
(1. Department of Dermatology, the Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100036,China; 2. Department of Dermatology, the Otorhinolaryngology Hospital of Baitou, Baitou 062510, Hebei,China)
Abstract:ObjectiveIn this study, the Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Fas Protein and Bcl-2 protein expression from acute ultraviolet injury was investigated in skin by solar-simulator radiation. MethodsAreas of skin of normal volunteers were divided into four sites: normal untreated skin, skin treated with 2-MED UV radiation, or skin treated with GPSE solutions or Vehicle 30minutes before 2-MED solar simulated radiation. Skin areas of different sites were examined immunohistochemically for Fas Protein and Bcl-2 protein expression.ResultsOn immunohistochemical examination, Skin treated with GSPE before UV radiation reduced Fas protein expression and upregulated Bcl-2 protein expression compared with skin treated only with UV radiation.ConclusionGrape Seed Proanthocyanidin Extract may protect skin against acute sunburn partly through reducing Fas protein expression and upregulated Bcl-2 protein expression.
Key words: Grape Seed Proanthocyanidin Extract, sunburn, Fas , Bcl-2
隨著生活水平的提高,人們進行越來越多的戶外運動、日光浴,導致接受過多的紫外線照射。研究表明皮膚在急性紫外光損傷過程中,大量氧自由基生成、細胞內(nèi)鈣超載、大量炎性細胞浸潤以及線粒體損傷等均可促使皮膚DNA損傷,從而導致角質(zhì)形成細胞調(diào)亡。在細胞調(diào)亡過程中,調(diào)亡相關的蛋白表達產(chǎn)物Fas蛋白及抗凋亡因子Bcl-2蛋白的作用被認為有重要意義。大量實驗表明葡萄籽提取物原花青素(Grape Seed Proanthocyanidin Extract,GSPE)是一種強效抗氧化劑,但對于其是否對光損傷所造成的細胞調(diào)亡的影響并不清楚。本實驗研究葡萄籽提取物原花青素對皮膚急性光損傷Fas蛋白及Bcl-2蛋白表達的影響。
1材料和方法
1.1 實驗材料與儀器:日光模擬器GS-2000 (中國計量科學研究院生產(chǎn)),包括一個450瓦的氙燈加上一個WG320濾光片(Schott, Clichy, France),光線輸出模擬連續(xù)的290 至 400nm 的日光紫外線輸出。Fas和Bcl-2單克隆抗體(編號為MAB-0226)、二抗均為美國Maxim公司產(chǎn)品,購自福州邁新生物技術公司。GSPE購自深圳建安公司,純度為95%,將8克GSPE溶于100ml的50%的乙醇溶液(即基質(zhì)),制成樣品。
1.2 實驗對象:實驗招募10名志愿者,所有志愿者身體健康,沒有接受任何醫(yī)學治療,既往沒有皮膚病史、日光過敏史。所有的志愿者在試驗結束后均獲得一定的經(jīng)濟補償。這項實驗由空軍總醫(yī)院倫理委員會批準。
1.3 實驗設計:志愿者需要5次就診。第一天按25%六孔遞增法在每位健康志愿者的臀部測定其初始最小紅斑量(minimal erythema dose,MED)值。
第二天讀取最小紅斑量的數(shù)值,其中出現(xiàn)邊界清楚的紅斑所需要的能量即為最小紅斑量。在志愿者的背部分別測定為7cm×3cm大小的四處皮膚并做相應標記,分別作為Group1(G1)、Group2(G2)、Group3(G3)、Group4(G4),其中G1組不作任何處理;G2組連續(xù)三天單純接受2倍MED0值日光模擬照射;G3組先外用基質(zhì)處理,30min后接受2倍MED值日光模擬照射,連續(xù)3天均同樣處理;G4組先外用含GSPE的樣品,30min后接受2倍MED值日光模擬照射,連續(xù)三天。樣品和基質(zhì)的涂抹量為2μl/cm2。
第五天即最后一次照射24h后在四個標記部位的中心分別用3mm孔徑的環(huán)鉆鉆取皮膚,用福爾馬林液固定,石蠟包埋,切片于4度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4 Fas基因和Bcl-2基因蛋白表達檢測:取上述石蠟標本相應部位的連續(xù)切片各5張,采用鏈霉素-生物素-過氧化物酶技術法進行免疫組化染色和AEC顯色法。簡單的說,石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫水,用PBS沖洗三次,每次5min。3%過氧化氫酶阻斷以消除非特異性著色,室溫下孵育10min。加特異性第一抗體后放置4℃冰箱過夜,用PBS洗滌三次,每次5min。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶在室溫下孵育10min,用PBS洗滌三次,每次5min,AEC室溫8~20min顯色,然后用自來水沖洗,蘇木素復染,中性封片劑封片。參照Bresalier法[1],在每張切片上隨機觀察10個高倍視野,根據(jù)每個視野中細胞的染色特征進行計分,未著色計為0分,淡黃色計為1分,棕黃色計為2分,棕褐色計為3分。取其平均值作為整張切片的染色強度評分。
1.5統(tǒng)計學處理:采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析,組間均數(shù)比較采用q檢驗進行,P<0.05為差異有顯著性。
2結果
皮膚組織中Fas基因和Bcl-2基因的蛋白表達
2.1G1組僅可見極少數(shù)散在的Fas蛋白陽性染色細胞;G2組和G3組可見較多的Fas蛋白陽性染色細胞;G4組Fas蛋白陽性染色細胞明顯減少。
2.2G1組可見較強的的Bcl-2蛋白陽性染色;G2組和G3組可見Bcl-2蛋白陽性染色明顯減弱;G4組Bcl-2蛋白陽性染色細胞較前增多,與G1組Bcl-2蛋白陽性染色細胞數(shù)目近似。
具體結果圖1、圖2和表1。
3討論
短期較強的紫外線照射通常導致皮膚急性光損傷,可明顯增加皮膚組織中活性氧自由基的生成,產(chǎn)生過多的氧自由基與細胞內(nèi)的結構相互作用而造成細胞DNA的損傷,皮膚角質(zhì)形成細胞出現(xiàn)凋亡。Fas蛋白是存在于細胞表面的一種膜蛋白,為Fas基因的產(chǎn)物,是一種凋亡細胞受體,其活化后可導致細胞在數(shù)小時內(nèi)凋亡[2],在啟動急性光損傷所致的角質(zhì)形成細胞凋亡中被認為具有極其重要的意義。Bcl-2基因被稱為“存活基因”,由Bcl-2基因編碼的Bcl-2蛋白位于核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上[3],Carson[4]發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白能調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)及抑制線粒體中細胞色素C的釋放等作用,阻斷引起凋亡的最后共同通路,有阻止細胞凋亡的能力。本實驗發(fā)現(xiàn),接受2MED紫外線照射后,F(xiàn)as蛋白表達積分明顯升高,而Bcl-2蛋白表達積分明顯減少,說明在日曬后皮膚損傷的早期就可能出現(xiàn)了凋亡。
近年來天然抗氧化植物在光損傷及光防護、治療上受到國內(nèi)外廣泛的關注[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)一些植物如綠茶、大豆、海藻及部分果實提取物如石榴等抗氧化物質(zhì)能夠對紫外線引起的光損傷引起的角質(zhì)形成細胞凋亡具有較好的防護及治療作用。以往研究同樣證明,GSPE具有強效的抗氧化作用,在其抗氧化能力是維生素C及維生素E的數(shù)十倍[8],有研究表明GSPE能夠對心肌灌注損傷的Fas基因表達上調(diào),Bcl-2基因表達下調(diào),但尚無紫外光損傷方面的實驗。本研究結果顯示,外用GSPE后再接受2MED紫外線照射的皮膚與單純接受2MED紫外線照射的皮膚對比,皮膚中Fas蛋白表達積分顯著減少,而Bcl-2蛋白表達積分顯著增加,在一定程度上說明了GSPE對急性光損傷所致的角質(zhì)形成細胞凋亡具有防護作用,但是GSPE是否單純通過此條途徑抑制凋亡,尚有待進一步研究。
[參考文獻]
[1]Bresalier RS, Ho SB, Schoeppner HI, et al. Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis[J]. Gastroenterology,1996,110: 1354-1367.
[2]Suda T, Takahashi T, Golstein P, et al. Molecular cloning and expression of the Fas Ligand, a novel member of tumor necrosis factor family[J]. Cell, 1993, 75:1169-1178.
[3]Chen-Levy Z, Cleary ML. Membrane topology of the Bcl-2protooncogenic protein demonstrated in vitro[J]. J Biol Chem,1990,265: 4929-4933.
[4]Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease[J]. Lancet,1993,341: 1251-1254.
[5]Lee BC, Lee SY, leeHJ, et al. Anti-oxidative and photo-protective effects of coumarins isolated from Fraxinus chinensis[J]. Arch Pharm Res, 2007,30(10):1293-301.
[6]Sevin A, Oztas P, Senen D,et al. Effects of polyphenols on skin damage due to ultraviolet A rays: an experimental study on rats[J]. J Eur Acad dermatol Venereol, 2007,21(5): 650-656.
[7]Rout S, Banerjee RFree radical scavenging, anti-glycation and tyrosinase inhibition properties of a polysaccharide fraction isolated from the rind from Punica granatum[J]. Bioresour Technol, 2007,98(16):3159-3163.
[8] Bagchi D, Garg A, Krohn RL, et al. Oxygen free radicals scavenging abilities of Vitamin C and E, and a grape seed proanthocyanidin extract in human vivo[J]. Res Commun Pathol Pharmacol, 1997, 95:179-189.
[收稿日期]2007-12-18[修回日期]2008-03-04
編輯/張惠娟
注:“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文?!?/p>