Ｍｓｘ１編碼區(qū)突變與非綜合性唇腭裂相關(guān)性分析

[摘要]目的：探討核心家庭中Msx1編碼區(qū)突變與非綜合征性唇腭裂的關(guān)系。方法：運(yùn)用測序技術(shù)檢測華東地區(qū)核心家庭的Msx1基因全部編碼區(qū)的突變情況，預(yù)測其編碼氨基酸的突變頻率，比較突變位點(diǎn)在患兒與正常兒童中的分布差異并判斷是否有統(tǒng)計學(xué)意義，比較患者組與父母組的基因型和等位基因頻率，并對核心家庭的數(shù)據(jù)進(jìn)行單倍型相對風(fēng)險分析(HRR)，對含雜合子父母的核心家庭進(jìn)行傳遞不平衡檢驗(yàn)(TDT)。結(jié)果：Msx1編碼區(qū)序列共有三個位點(diǎn)突變，分別為編碼區(qū)1的C101G（A34G）突變，編碼區(qū)1同義突變 C330T（G110G），編碼區(qū)2 的G162A（S278N）突變。其中只有編碼區(qū)1的同義突變C330T（G110G）在患兒與正常兒童中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，患者與其父母各位點(diǎn)基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，HRR結(jié)果和TDT結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義，另外兩個突變位點(diǎn)各項統(tǒng)計均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：編碼區(qū)1的同義突變C330T（G110G）可能與中國華東人群非綜合征性唇腭裂存在相關(guān)性，而編碼區(qū)1的C101G（A34G）突變和編碼區(qū)2 的G162A（S278N）突變與中國華東人群非綜合征性唇腭裂不存在相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]非綜合征型唇腭裂；Msx1；編碼區(qū)；突變；測序

[中圖分類號]R782.2[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-04

Association of mutations in coding regions of Msx1 and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate by DNA sequencing technology

WU Xuan1，CUN Min-gui2，ZHOU Xiao-ping2，LIU Jia-yin2，WAN Wei-dong1

(1.Department of Plastic Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University， Nanjing 210009， China;2.The Center of Clinical Reproductive Medicine， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029，Jiangsu， China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between mutations in coding regions of Msx1 and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P)in nuclear families consisting of fathers， mothers and affected offspring with NSCL/P from southeast China.MethodsAll mutations in coding regions of Msx1 were detected by applying sequencing technology in nuclear families， predicting mutation frequency of amino acid， comparing the distributional difference of affected offspring and unimpaired child and judge that if it has the statistical significance.Then compare the genetype and allele frequency in affected offspring and fathers. Haplotype Relative Risk (HRR) and Transmission Disequilibrium Test (TDT) were performed.ResultsThere were three mutational sites in all ，mutation C101G（A34G）and samesense mutation C330T（G110G）in coding region1， mutation G162A（S278N）in coding region2. Only samesense mutation C330T（G110G）in coding region1 has significant difference in genotypes and alleles distribution between patients and normal.No significant difference in genotypes and alleles distribution between patients and their parents.were found. They all got negative results in both HRR and TDT analysis.The other two mutational sites had no significant results in all above.ConclusionThere may have some relationship between Samesense mutation C330T（G110G）in coding region1and NSCL/P in population from southeast China but mutation C101G（A34G）in coding region1and mutation G162A（S278N）in coding region2 have no significant relationship in population from southeast China.

Key words:nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate(NSCL/P); Msx1 gene; coding regions; mutation; sequencing

先天性唇腭裂是人類最常見的先天性畸形之一，國內(nèi)外研究認(rèn)為非綜合征性唇腭裂的發(fā)病與多基因遺傳、環(huán)境及兩者的相互作用相關(guān)，目前已選出多個候選基因，Msx1就是其中的一個。因地區(qū)環(huán)境和種族差異的影響，這個基因在不同文獻(xiàn)的結(jié)果不盡一致。Msx1全基因序列總共只有兩個編碼區(qū)（本文中命名為編碼區(qū)1和編碼區(qū)2），本項研究擬采用測序技術(shù)在華東地區(qū)人群中檢測此基因全部編碼區(qū)的突變情況，預(yù)測其編碼氨基酸的改變，進(jìn)一步探討這個基因與NSCL/P的關(guān)系。

1材料和方法

1.1對象：共有50個核心家庭和50個正常對照，患兒為經(jīng)整形外科醫(yī)師確診的非綜合征性唇腭裂（NSCL/P）患者，均已排除了綜合征性唇腭裂如Van Der Woude綜合征、Meckel綜合征、歌舞伎面譜綜合征、腭心面綜合征。核心家庭患者年齡分布為1～14歲，平均2.96歲，其中單純唇裂男女患者各有10例和5例，唇裂伴腭裂的男女患者各有24例和11例。患者及其父母來自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院和南京市兒童醫(yī)院的住院病人，研究對象均為華東地區(qū)漢族人，且均對本項研究簽署了知情同意書。

1.2 DNA提?。喊碢UREGENE DNA 純化試劑盒的說明書 （美國GENTRA公司）抽提外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增：參照NCBI 基因庫公布的Msx1基因序列設(shè)計擴(kuò)增引物， 引物均由上海英駿生物公司合成，編碼區(qū)1擴(kuò)增選用大連寶生物公司的LA Tag高保真酶，編碼區(qū)2擴(kuò)增采用南京天為公司pfu高保真taq酶。擴(kuò)增引物由Primer Primer 5.0軟件設(shè)計。編碼區(qū)1上游引物(5'-3') 為tggccagtgctgcggcagaa，下游引物(5'-3') 為gttccagacctcctcgcctt，擴(kuò)增片段長度為701bp；編碼區(qū)2上游引物(5'-3') 為tgtggacatcgagccttcaa，下游引物(5'-3') 為cactctccgaagtctgatcc，擴(kuò)增片段長度為877bp。編碼區(qū)1 GC含量高達(dá)73.5％，加入GC Buffer可以降低解鏈的難度，提高PCR效率，其反應(yīng)體系為LA Taq 0.3μl，2×GC Buffer25μl，DNTP 8μl，Primer F1μl，Primer R 1μl，DNA模版1μl，加去離子水至50μl；反應(yīng)條件為94℃1 min，94℃30s、60℃30s、72℃2 min計30個循環(huán)，72℃10 min。編碼區(qū)2反應(yīng)體系為2×master mix 25μl，Primer F2μl， Primer R 2μl， DNA模版1μl，加去離子水至50μl；反應(yīng)條件為94℃3 min，94℃30s、55℃30s、72℃1min計30個循環(huán)，72℃5min。

1.4 純化測序：編碼區(qū)1GC含量高達(dá)73.5％，純化測序由上海英駿公司完成。編碼區(qū)2GC含量57％，由上海博亞公司完成。對發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果的核心家庭進(jìn)行重復(fù)測序，以檢測測序結(jié)果的可靠性，若兩次結(jié)果不一致，再進(jìn)行雙向測序，保證測序結(jié)果的可信度。編碼區(qū)1正向測序引物為tggccagtgctgcggcagaa，反向測序引物為tggtcctcgggagcccag；編碼區(qū)2正向測序引物為tcatgctccaatgcttctct，反向測序引物為cccatgtcgtggtcccga，測序引物由測序公司設(shè)計和合成。

1.5 測序結(jié)果判讀：用Chromas軟件對測序鋒圖進(jìn)行分析，判斷雜合子和純合子，從而得到核心家庭的基因序列，用Dnastar軟件對核心家庭的基因序列與Pubmed提供的正常序列進(jìn)行比對，以發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析：患兒組與對照組做病例對照研究的卡方檢驗(yàn)；患兒組與父母組基因型分別做Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。對核心家庭的父母及患者做各位點(diǎn)基因型及等位基因頻數(shù)比較，和單體型相對風(fēng)險分析（Haplotype Relative Risk， HRR）。選取親代至少有一位是雜合子的核心家庭作傳遞不平衡檢驗(yàn)（transmission disequilibrium test， TDT）。統(tǒng)計由Stata9軟件完成。

2結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳：編碼區(qū)1PCR產(chǎn)物長度為701bp，PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖如圖1，編碼區(qū)2 PCR產(chǎn)物長度為877bp，PCR產(chǎn)物的凝膠電泳如圖2。

2.2測序結(jié)果

2.2.1編碼區(qū)1：圖3是一患兒的部分測序峰圖，圖上可見第115號位點(diǎn)是個雙峰，該位點(diǎn)為雜合子，基因型為G/C雜合型，而該位點(diǎn)對應(yīng)的是編碼區(qū)1的101號位點(diǎn)，即該患者編碼區(qū)1的101號位點(diǎn)為G/C雜合型。圖4上可見343號位點(diǎn)也是個雙峰，為雜合子，基因型為T/C雜合型，而該位點(diǎn)對應(yīng)的是編碼區(qū)1的330號位點(diǎn)，即該患者編碼區(qū)1的330號位點(diǎn)為T/G雜合型。圖5上可見該患者第115號位點(diǎn)和344號位點(diǎn)都為雙峰，分別對應(yīng)為編碼區(qū)1的101號位點(diǎn)和330號位點(diǎn)，說明該患者此兩個位點(diǎn)的突變是連鎖性突變。

2.2.2編碼區(qū)2：編碼區(qū)2在父母中未發(fā)現(xiàn)突變的基因型，在一例患兒中發(fā)現(xiàn)有G162A突變。

2.3 患兒與正常人基因型差異的卡方檢驗(yàn)：①表1所示為101位點(diǎn)患兒與正常對照得基因型分布，代入卡方檢驗(yàn)公式，得卡方值χ2=0.92，對應(yīng)P值＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義；②表2所示330位點(diǎn)患兒與正常對照組的基因型分布，代入卡方檢驗(yàn)公式，其中T=6×50/100=3，1＜T＜5，n=100＞40，用計算校正的卡方值，計算得χ2=4.43，對應(yīng)P值＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4患兒組與父母組各位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），各位點(diǎn)兩組間基因型及等位基因頻數(shù)皆無統(tǒng)計學(xué)差異，見表3與表4

2.5 HRR分析：C101G與C330T兩位點(diǎn)各自兩個等位基因在傳遞與未傳遞例數(shù)比較中差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。見表5。

2.6 TDT結(jié)果：各位點(diǎn)以患者染色體等位基因?yàn)椴±M，患者父母未傳遞給患者的等位基因?yàn)閮?nèi)對照，進(jìn)行病例內(nèi)對照研究，經(jīng)檢驗(yàn)，此兩位點(diǎn)P值均＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，見表6。

2.7 編碼氨基酸突變：Msx1基因一共只有兩個編碼區(qū)，即編碼區(qū)1和編碼區(qū)2，通過以上編碼區(qū)基因的突變，我們可以得出Msx1編碼的氨基酸序列的變化，但由于突變率較低，都沒有統(tǒng)計學(xué)意義。見表7。

3討論

非綜合征性唇腭裂是一種常見的先天性顏面部缺陷，世界各地發(fā)病率從1/500到1/2500不等，目前被認(rèn)為是多基因遺傳病。Msx1是最近研究的熱點(diǎn)之一。

Msx1基因是同源異型盒基因家族的成員之一，它作為核轉(zhuǎn)錄因子，是器官發(fā)育過程中的主調(diào)控基因，亦是頜面發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，其基因突變可導(dǎo)致唇裂、腭裂等嚴(yán)重先天性畸形。Msx1編碼區(qū)的exon1編碼150個氨基酸，exon2編碼147個氨基酸，編碼區(qū)多態(tài)性致氨基酸變異大多集中在exon1。Jezewski[1]等對Msx1進(jìn)行測序分析時發(fā)現(xiàn)的氨基酸突變有， E78V，G98E，G110GV，114G，G116E，L118L。同時證實(shí)同義突變G110G（c＞t）在亞洲人群的非綜合性唇腭裂中有顯著意義。缺失突變（811－816缺失）在Iowa州人群中與非綜合性唇腭裂的關(guān)聯(lián)性亦被發(fā)現(xiàn)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。Yasushi Suzuki[2]等在對一組越南NSCL/P核心家庭研究時發(fā)現(xiàn)Msx1基因中兩種錯義突變，P147Q和G98E。其中P147Q，即該基因的第一個外顯子第440個堿基由C變?yōu)锳，此人群中2%的患者有這種點(diǎn)突變，有統(tǒng)計學(xué)意義。Tongkobpetch S[3]等對100名泰國非綜合性唇腭裂患者的Msx1編碼區(qū)進(jìn)行分析，在外顯子2編碼區(qū)的羧基末端新發(fā)現(xiàn)了兩個突變G267C，P278S，而在162名對照組中沒有發(fā)現(xiàn)此兩種突變。Jungyong Park[4]等以52名韓國非綜合性唇腭裂患者為對象，對Msx1基因內(nèi)部及其周圍9.8kb長度的序列進(jìn)行了測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了7個snp位點(diǎn)，其中位于exon2的第7個SNP，1170G/A在韓國非綜合性唇腭裂人群中有著顯著意義。Vieira[5]等對智利45個NSCLP家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MsxI基因兩個錯義突變(G16D和G34A)， G16D突變可能破壞了一個剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致唇腭裂的形成。De Muynck[6]等研究發(fā)現(xiàn)，在一個唇聘裂家系的3個個體中發(fā)現(xiàn)一個新的MsxI突變，C559T，導(dǎo)致編碼氨基酸由谷氨酸轉(zhuǎn)變成終止信號。

本研究采用傳統(tǒng)的病例對照設(shè)計和核心家庭的病例父母對照研究，進(jìn)行了 HRR分析和TDT檢驗(yàn)，以患者父母為內(nèi)對照，可避免關(guān)聯(lián)研究中存在的不恰當(dāng)?shù)膶φ諉栴}。其中TDT不受遺傳方式、群體不純、分層的限制而成為研究核心家庭遺傳標(biāo)志與疾病易感位點(diǎn)關(guān)系的首選方法。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，編碼區(qū)1的同義突變G110G（C330T）有統(tǒng)計學(xué)意義，與Jezewski等在亞洲人群中的研究結(jié)果一致，證實(shí)其在中國華東人群非綜合征性唇腭裂中存在一定相關(guān)性。A34G（C101G）的突變在Vieira等對智利45個NSCLP家系的研究中也發(fā)現(xiàn)了，但在本實(shí)驗(yàn)研究的中國華東人群非綜合征性唇腭裂中無統(tǒng)計學(xué)意義。編碼區(qū)2的G162A（S278N）突變在本實(shí)驗(yàn)研究對象中只發(fā)現(xiàn)了一例，無統(tǒng)計學(xué)意義。我們的研究結(jié)果與國內(nèi)外同類報道不盡一致，可能主要與基因存在種族和地區(qū)的差異性相關(guān)。

Msx1編碼由297個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。人類連鎖和連鎖不平衡研究發(fā)現(xiàn)， Msx基因特殊編碼序列的突變，可能會使Msx編碼蛋白缺失，從而引起其功能不足，導(dǎo)致遠(yuǎn)端面芽萌出缺乏，隨之發(fā)生一期或二期腭裂[7]。突變Msx1蛋白缺乏N端結(jié)構(gòu)域，無法調(diào)節(jié)細(xì)胞周期素(cyclin D1)，故抑制分化[8]。對Msx1基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)并介導(dǎo)誘導(dǎo)組織間相互作用，下位靶基因及其對器官發(fā)生中相關(guān)細(xì)胞過程的確切作用機(jī)制等方面的進(jìn)一步研究，將為闡明疾病的分子生物學(xué)機(jī)制，以及臨床開展非綜合性唇腭裂患者的產(chǎn)前診斷、早期基因修正、孕期外源性生長因子治療等研究，奠定理論基礎(chǔ)，為患病人群及后代提供預(yù)警和遺傳風(fēng)險的評估和咨詢，據(jù)此建立有效的預(yù)防和干預(yù)措施。

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[收稿日期]2007-12-09[修回日期]2008-03-06

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。”