二氫青蒿素抑制兔耳瘢痕增生的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：觀察二氫青蒿素對(duì)兔耳增生性瘢痕增生的影響。方法：選取成年新西蘭大耳白兔16只，建立兔耳增生性瘢痕動(dòng)物模型，待上皮化后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別給予二氫青蒿素（180mg/kg）和生理鹽水（乙醇終濃度為0.1%）各10ml灌胃，術(shù)后28 天 和56 天時(shí)觀察藥物對(duì)瘢痕增生指數(shù)(HI)的影響及光鏡下瘢痕變化情況。結(jié)果：二氫青蒿素組與生理鹽水組之間HI差異均有顯著性意義(P<0.O1)；光鏡下見二氫青蒿素組成纖維細(xì)胞凋亡增加及膠原纖維的含量降低。結(jié)論：二氫青蒿素可明顯抑制兔耳增生性瘢痕的形成及瘢痕組織增生。

[關(guān)鍵詞]二氫青蒿素；增生性瘢痕；兔耳瘢痕模型

[中圖分類號(hào)]R619+.9[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）03-03

Effects of dihydroartemisinin on the hypertrophic scar in rabbits ears

FENG Deng-chao1，2，HE Guang-zhao1，JIANG Chuan1，ZHANG Wei1，HUANG Chong-ben1

(1.Department of Plastic and Burning Surgery，the First Affiliated Hospital， Chongqing Medical University，Chongqing 400016， China;2. Department of Plastic and Burning Surgery，the Affiliated Hospital，Yan'an University， Yan'an 700016，Shaanxi，China)

Abstract：Objective To investigate the effects of dihydroartemisinin on the hypertrophic scar through hypertrophic scarring of rabbits ears model． Methods Sixteen New Zealand white rabbits were used to establish the models of hypertrophic scar in ears. The rabbits in the experimental and control groups were received each 10 ml dihydroartemisinin by perfusion in dose of 180g/kg and 0g/kg (normal saline) after epithelization．At day 28 and 56 the rabbits were killed to observe hypertrophic index(HI) and morphological change of scars．ResultsCompared with the control group， dihydroartemisinin significantly reduced HI (P<0.01). The proliferation of fibroblast was obviously inhibited and the contents of collagen fiber were decreased in the dihydroartemisinin treated group under light microscope on postoperative 28th and 56th day.ConclusionDihydroartemisinin can inhibit formation of hypertrophic scar in rabbit ears.

Key words:dihydroartemisinin;hypertrophic scar；hypertrophic scar of rabbits ears model

增生性瘢痕(Hypertrophic scars，HS )是一種常見的病理性愈合現(xiàn)象，常發(fā)生于深I(lǐng)I度燒傷或外傷后因各種原因延期愈合的創(chuàng)面。目前對(duì)于增生性瘢痕的治療方法較多，用于防治瘢痕的藥物研究也非常多，但由于對(duì)增生性瘢痕的形成機(jī)理尚不完全明了，臨床療效還不盡如人意。近年來發(fā)現(xiàn)青蒿素有較好的抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的作用，但作用機(jī)制不詳。本研究旨在通過兔耳瘢痕模型的建立探討二氫青蒿素對(duì)兔耳瘢痕形成的影響，為瘢痕防治提供實(shí)驗(yàn)工具和藥物臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1 材料：二氫青蒿素，薛斌博士提供(純度99.99％，批號(hào)：20041103)

1.2 動(dòng)物：新西蘭大白兔16只，體重（2.5±0.3）kg，兔耳健全，雌雄不拘，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的制作：選用健康成年新西蘭大白兔16只，分籠飼養(yǎng)1周。動(dòng)物瘢痕模型的制作方法參照Morris[1]和李薈元[2]等報(bào)道建立兔耳增生性瘢痕模型的研究資料，并加以改良：用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)做耳緣靜脈麻醉，嚴(yán)格無菌操作技術(shù)下，在兔耳腹側(cè)沿長(zhǎng)軸避開可見血管，創(chuàng)面間隔1cm以上，做1cm×1cm大小創(chuàng)面，去掉兔耳全層皮膚及軟骨膜，創(chuàng)緣用烙鐵燒灼，每只兔耳做6個(gè)相同創(chuàng)面，共192個(gè)創(chuàng)面，術(shù)后創(chuàng)面暴露，待創(chuàng)面自行愈合。待上皮化后，將兔隨機(jī)分為兩組，每組8只，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別給予180mg/kg的二氫青蒿素（二氫青蒿素先用75%乙醇1ml溶解，再用生理鹽水稀釋濃度為180mg/kg）（乙醇終濃度為0.1%）和生理鹽水各10ml灌胃。每天1次，連續(xù)6次。

1.3.2 標(biāo)本收集：最后一次灌胃后1天（術(shù)后28天），用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)做耳緣靜脈麻醉，每組隨機(jī)處死4只兔子，切取標(biāo)本。余繼續(xù)喂養(yǎng)，術(shù)后56 天時(shí)，同樣在麻醉?xiàng)l件下處死每組最后4只兔子，切取瘢痕組織標(biāo)本。做HE染色的標(biāo)本用4％中性甲醛固定，然后石臘包埋。測(cè)定瘢痕增生情況，光鏡下觀查。

1.4 瘢痕增生情況觀察：傷后19～21天(上皮化時(shí))、術(shù)后28天和56 天觀察并記錄瘢痕增生情況。瘢痕組織瘢痕高度大于或等于2mm，硬度與兔耳軟骨相似時(shí)即為增生性瘢痕[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行方差分析和q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

納入實(shí)驗(yàn)大耳白兔16只，均進(jìn)入結(jié)果分析。

2.1 瘢痕形成情況（見表1）：上皮化時(shí)即能觸到硬塊，此硬塊不斷高于皮面，淡紅色，增生范圍不超過原創(chuàng)緣，大約28～32天增生到最高峰。實(shí)驗(yàn)組兔耳瘢痕質(zhì)地較對(duì)照組柔軟平整。

2.2 瘢痕增生指數(shù)(HI)對(duì)比情況（見表2）：測(cè)定瘢痕增生指數(shù)(Hypertrophic Index，HI)，顯微鏡下用測(cè)微尺測(cè)量相對(duì)增生厚度，設(shè)定瘢痕的高度(scar height)為SH，正常的皮膚高度(dermis height)為DH，則HI＝SH／DH。

2.3 組織切片觀察

2.3.1 對(duì)照組：鏡下顯示瘢痕組織真皮層明顯增厚，為周邊正常真皮層厚度的4～5倍，主要是大量成行纖維細(xì)胞增殖，膠原纖維多而致密粗大，排列混亂，可見漩渦狀結(jié)構(gòu)和膠原結(jié)節(jié)（見圖1），其間有少量炎性細(xì)胞，結(jié)構(gòu)近似人的增生性瘢痕組織。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)組：鏡下顯示真皮層厚度約為正常真皮層厚度的2.0倍，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，凋亡的成纖維細(xì)胞多。膠原纖維束間有較大的空隙，排列比較規(guī)則，呈水平方向（見圖2）。

3討論

嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷及外科手術(shù)后常常遺留增生性瘢痕，瘢痕對(duì)人而言，輕則影響外觀、影響機(jī)體的正常功能，重則軀體外形改變、容貌的毀壞，也會(huì)造成患者心理的異常。由于瘢痕的發(fā)生機(jī)制目前仍不十分清楚，至今還缺乏具有臨床指導(dǎo)意義的應(yīng)用基礎(chǔ)理論和滿意有效的防治方法。目前治療方法主要有手術(shù)切除、類固醇激素、抗代謝藥、免疫抑制劑、放射療法和硅膠膜等[4]，但遠(yuǎn)沒達(dá)到滿意控制瘢痕生長(zhǎng)防治復(fù)發(fā)的目的 ，均因術(shù)后易復(fù)發(fā)或嚴(yán)重的全身性副作用而限制了臨床應(yīng)用，因此從祖國(guó)中醫(yī)中藥中篩選出療效確切、副作用小的抗瘢痕纖維化的有效藥物，具有重要的臨床意義。兔耳腹側(cè)面皮膚全層缺損后產(chǎn)生瘢痕組織類似人皮膚增生性瘢痕[1]，這為更深入研究瘢痕發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸提供了一種很好的實(shí)驗(yàn)工具。目前李薈元[2]等已經(jīng)成功地建立兔耳瘢痕動(dòng)物模型，使藥物對(duì)于瘢痕防治的研究手段有了新的方法。

青蒿（Artemisia annua L.）是一種有效的抗瘧藥，20世紀(jì)70年代，我國(guó)學(xué)者從中藥黃花蒿中分離出有效單體成分青蒿素后，又陸續(xù)合成了蒿甲醚、青蒿琥酯、二氫青蒿素等有效衍生物，掀起了各國(guó)學(xué)者對(duì)青蒿素類藥物療效和作用機(jī)制研究的熱潮。通過對(duì)該類藥物作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)青蒿素類藥物除了有很好的抗瘧作用外，還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗纖維化和抗腫瘤作用。1998年徐德忻[5]等研究發(fā)現(xiàn)青蒿素對(duì)實(shí)驗(yàn)性矽肺有明顯的治療作用，矽肺的發(fā)生是由于成纖維細(xì)胞增生，膠原合成增多導(dǎo)致肺內(nèi)膠原沉積所致，提示青蒿素具有抗纖維化作用。1998年賀光照等[6]首次將青蒿素用于增殖性瘢痕的治療，通過局部應(yīng)用青蒿素霜?jiǎng)?duì)50例增殖性瘢痕進(jìn)行療效觀察，發(fā)現(xiàn)其具有抗瘢痕作用，治療1～3個(gè)月后瘢痕紅、癢痛癥狀減輕或消失，瘢痕質(zhì)地變軟、變平，有效率88%。隨后又進(jìn)行人瘢痕成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)，觀察并分析了其對(duì)增殖性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖活力及膠原合成功能的影響，結(jié)果表明，青蒿素可呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并明顯降低細(xì)胞外膠原量[7]?？缀愕萚8]認(rèn)為青蒿素可能通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡而抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖。李偉等[9]用青蒿琥酯做局部瘢痕內(nèi)注射，觀察其對(duì)兔耳增生性瘢痕形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：青蒿琥酯組兔耳瘢痕組織中膠原含量較對(duì)照組明顯減少。陳衛(wèi)強(qiáng)等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A569有明顯的促進(jìn)凋亡作用。青蒿琥脂、蒿甲醚和蒿乙醚在體內(nèi)外可轉(zhuǎn)化為二氫青蒿素，二氫青蒿素為其有效代謝物，它的毒性更低，藥理作用強(qiáng)，生物利用度高。

本實(shí)驗(yàn)通過建立兔耳創(chuàng)面瘢痕動(dòng)物模型，在兔耳創(chuàng)面上皮化后給予二氫青蒿素（180mg/kg）灌胃治療，觀察其對(duì)兔耳瘢痕影響的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素組真皮層厚度，成纖維細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯減少；膠原纖維致密度下降，排列較規(guī)則；而且治療組瘢痕增生指數(shù)（HI）明顯低于對(duì)照組。差異均有顯著性(P

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[收稿日期]2007-12-06[修回日期]2008-03-02

編輯/張惠娟