ＳＫＩ基因多態(tài)性與中國(guó)華東地區(qū)部分人群非綜合征性唇腭裂的相關(guān)研究

[摘要]目的：探討SKI基因257C＞G多態(tài)與中國(guó)華東地區(qū)部分人群非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)發(fā)生的關(guān)系。方法：采用病例對(duì)照設(shè)計(jì)，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP），進(jìn)行SKI基因257C＞G多態(tài)性檢測(cè)，并進(jìn)行遺傳統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：對(duì)于SKI基因257C＞G，8個(gè)雜合子父母及患兒的核心家庭TDT 檢驗(yàn)(χ2=3.56，P＞0.05)；50例NSCL/P 患兒和50例正常兒童基因型及等位基因頻數(shù)病例對(duì)照研究(χ2= 2.08，P＞0.05)。 結(jié)論：SKI基因257C＞G位點(diǎn)多態(tài)與中國(guó)華東地區(qū)部分人群NSCL/P 的發(fā)生無(wú)相關(guān)性，可能不是NSCL/P的主要易感基因。

[關(guān)鍵詞]非綜合征性唇腭裂；基因多態(tài)性；SKI基因

[中圖分類號(hào)]R782.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）03-03

Relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate and genetic polymorphisms of SKI

GAO Xia， LIU Jia-yin，CUI Yu-gui，ZHOU Xiao-ping， WAN Wei-dong

(Department of Plastic Surgery，Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University， Nanjing 210009，Jiangsu，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) and genetic polymorphism of SKI in Chinese population. MethodsCase-control study design was employed. SKI genotypes were determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism t echniques ( PCR－RFLP).ResultsAs to SKI 257C>G， 8 heterozygous parents with an affected child were analyzed through case-parental control study using TDT (χ2= 3.56， P>0.05) . The genotype frequency and allele frequency of 50 NSCL/P cases and 50 controls were analyzed through case-control study (χ2= 2.08， P>0. 05).ConclusionThe genetic polymorphism of SKI 257C＞G is not associated with the development of NSCL/P， and the genetic polymorphism of SKI is not a risk factor for NSCL/P in the Chinese population.

Key words: nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate;genetic polymorphism;SKI

非綜合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P) 是指不伴發(fā)其他系統(tǒng)器官畸形的不在綜合征之內(nèi)的唇裂、唇裂合并腭裂或單純腭裂的總稱。NSCL/P 發(fā)病原因仍不明確。目前研究認(rèn)為是一種多基因易感性疾病，環(huán)境及遺傳因素共同作用引起發(fā)病[1-2]。文獻(xiàn)報(bào)道與NSCL/P 相關(guān)的基因達(dá)20余個(gè)。SKI基因是其中之一。但SKI基因與NSCL/P 畸形發(fā)生的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道極少。為探討中國(guó)人群SKI基因多態(tài)性與NSCL/P 發(fā)生的關(guān)系，我們應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）對(duì)50例NSCL/P患者SKI基因257C＞G多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了遺傳研究分析。

1資料和方法

1.1 臨床資料：選自50個(gè)核心家庭，共50 例患兒，均為東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院整形外科住院手術(shù)的唇腭裂畸形患者，其中唇裂15例，唇裂合并腭裂35例，并排除了其他系統(tǒng)畸形或綜合征之內(nèi)的唇腭裂病例。對(duì)照組50例兒童均為南京市兒童醫(yī)院“上感”就診患者，排除了綜合征或非綜合征性唇腭裂畸形。兩組兒童均來(lái)自中國(guó)江蘇和安徽地區(qū)，均為漢族，年齡，性別分布也無(wú)差異。

1.2基因多態(tài)性檢測(cè)

1.2.1 樣本采集：抽取患兒及父母，對(duì)照兒童外周靜脈血2ml，EDTA 抗凝。

1.2.2 DNA 提?。喊碢UREGENE DNA 純化試劑盒的說(shuō)明書 （美國(guó)GENTRA公司）抽提外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增：擴(kuò)增引物由上海英駿生物公司合成，引物序列為 F5′-AGA AGA CGC TGG AGC AGT TC-3′R 5′-GGT CGG ACG GCA TGA AGA AG-3′。SKI基因257C＞G反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系50μl，其中上下游引物各2μl(10 pmolPμl)，2×Pfu PCR Master Mix 25μl ，ddH2O 13μl ，模板DNA 2μl(100μgPμl)，DMSO 6μl.PCR 反應(yīng)條件：94℃變性3min，PCR循環(huán)條件為94℃30 min、58℃30min、72℃2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色檢測(cè)PCR 擴(kuò)增結(jié)果(圖1) 。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物PCR-RFLP分析：限制性內(nèi)切酶Ehe I酶切消化SKI基因257C＞G PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，共30μl，其中PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物20μl，10×Buffer Tango 2μl，nuclease free Water 7μl，Ehe Ⅰ酶1μl，37 ℃酶解5h。4%瓊脂糖凝膠電泳。分析記錄基因型（圖2）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析：配對(duì)資料的McNemer 檢驗(yàn)，計(jì)算傳遞失衡指數(shù)(transmitted disequillibrium test，TDT)；NSCL/P患兒與正常兒童基因型構(gòu)成及等位基因頻數(shù)的比較。

2結(jié)果

2.1 SKI基因擴(kuò)增結(jié)果和基因型分析：SKI基因257C＞G擴(kuò)增目的片段為234bp，EheⅠ酶切后，257C＞G野生型產(chǎn)生2個(gè)片段，長(zhǎng)度為101，133bp；C →G 后失去一個(gè)酶切位點(diǎn)，因此，純和突變型257C＞G 產(chǎn)生1 個(gè)片段，長(zhǎng)度為234bp，雜合突變型257C＞G 產(chǎn)生3個(gè)片段，長(zhǎng)度為234，101，133bp。

2.2 計(jì)算傳遞失衡指數(shù)(TDT)：以患兒染色體等位基因?yàn)椴±?，以父母未傳遞給患兒的一對(duì)等位基因?yàn)閷?duì)照，進(jìn)行1∶1 配對(duì)的病例對(duì)照研究。TDT(χ2)=3.56，P＞0.05.

2.3 NSCL/P 患兒與正常兒童基因型及等位基因頻數(shù)的比較分別記錄患兒和正常對(duì)照兒童的SKI基因257C＞G基因型，進(jìn)一步計(jì)算等位基因頻數(shù)，各組間比較，SKI基因257C＞G的 χ2=2.08，P>0.05。差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

3討論

非綜合征性唇腭裂是一種常見的先天性顏面部缺陷，其發(fā)病率因國(guó)家、地區(qū)、種族的不同而有所不同，從1/500到1/2500[3]不等，其中亞洲和美洲人群發(fā)病率最高，歐洲人群居中，非洲人群最低。在中國(guó)，NSCL/P是一種常見的先天畸形，在頭面部先天畸形中位居首位。該畸形的出現(xiàn)影響患兒正常的生理、心理發(fā)育，給患兒的父母帶來(lái)沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，該病的發(fā)病原因尚處于研究階段?，F(xiàn)在認(rèn)為，非綜合征性唇腭裂是一種多基因易感性疾病。而SKI基因正是眾多易感基因中的一種。

1986年，Stavnezer E等[4]從感染了禽白血病轉(zhuǎn)化缺陷病毒Bratislava 77的雞胚胎細(xì)胞分離出來(lái)的一組逆轉(zhuǎn)錄病毒－SKV病毒。通過(guò)溶解和點(diǎn)雜交發(fā)現(xiàn)眾多的SKV病毒中包含了一段共同序列，既是v-SKI。SKI基因位于人類1q22-1q24，是一種原癌基因，屬于myc家族。SKI基因編碼核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)或誘導(dǎo)其它與面部結(jié)構(gòu)形成有關(guān)的因子的轉(zhuǎn)錄作用，間接控制面部畸形的產(chǎn)生。Colmenares C.等[5]認(rèn)為SKI通過(guò)調(diào)節(jié)兩組因子的轉(zhuǎn)錄來(lái)控制唇腭裂的發(fā)生。第一組是Rara/Rarg（視黃素受體家族基因）和TGF（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子）。第二組是MSX2 和BMP4。這兩組基因都已被證明和唇腭裂的發(fā)生有一定的相關(guān)性。SKI基因雖然在顱頜面結(jié)構(gòu)的形成起重要作用，但該基因的缺失或突變，是否導(dǎo)致NSCL/P畸形發(fā)生的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道極少。

我們對(duì)中國(guó)江蘇和安徽地區(qū)50例NSCL/P 核心家庭計(jì)算傳遞失衡指數(shù)(TDT) ，結(jié)果顯示SKI 基因257C＞G 在50例NSCL/P 核心家庭中不存在遺傳失衡現(xiàn)象。對(duì)50 例患兒與50例正常兒童SKI 基因257C＞G的基因型及等位基因頻數(shù)進(jìn)行比較表明， SKI 基因257C＞G兩個(gè)等位基因頻率在兩組人群中分布也無(wú)明顯差異。上述結(jié)果提示，SKI基因257C＞G位點(diǎn)多態(tài)可能與中國(guó)華東地區(qū)部分人群NSCL/P無(wú)明顯相關(guān)性。2005年，Wei Lu等[6]對(duì)394位非綜合征型唇腭裂病例進(jìn)行SKI基因257C＞G多態(tài)性分析，結(jié)果顯示SKI基因257C＞G可以降低NSCL/P的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。這些結(jié)果充分說(shuō)明NSCL/P 的發(fā)生原因是非常復(fù)雜的。許多研究都已表明，NSCL/P具有多基因遺傳的特點(diǎn)，而且與環(huán)境因素以及遺傳與環(huán)境的相互作用有很大的關(guān)系[7]。就本次研究而言，SKI基因257C＞G位點(diǎn)多態(tài)與中國(guó)華東地區(qū)部分人群NSCL/P 的發(fā)生無(wú)相關(guān)性，可能不是NSCL/P的主要易感基因。

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[收稿日期]2007-11-29[修回日期]2008-02-28

編輯/張惠娟