ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ分子在瘢痕疙瘩患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的變化

[摘要]目的：探討瘢痕疙瘩患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）HLA-DR和HLA-DQ分子的含量及其基因型的變化。方法：采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)10例瘢痕疙瘩患者、10例扁平瘢痕患者及10例正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-DR、HLA-DQ分子的含量；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）方法檢測(cè)60例瘢痕疙瘩患者和110例正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞HLA-DR和HLA-DQ的基因位點(diǎn)。結(jié)果：①瘢痕疙瘩患者外周血單個(gè)核細(xì)胞HLA-DR、HLA-DQ分子含量的變化：瘢痕疙瘩組HLA-DR+、HLA-DQ+細(xì)胞的積分光密度（813.16±62.77，420.12±94.25）高于扁平瘢痕組（636.22±133.95，302.77±89.77）和正常人組（597.88±166.36，308.57±44.05）（P＜0.01）；②瘢痕疙瘩患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-DR和HLA-DQ基因位點(diǎn)的變化：瘢痕疙瘩組HLA-DR14和HLA-DQ5位點(diǎn)的抗原頻率（0.16，0.28）明顯高于對(duì)照組（0.06，0.15）（P＜0.05），HLA-DR17和HLA-DQ8位點(diǎn)的抗原頻率（0.02，0.03）明顯低于對(duì)照組（0.13，0.15）（P＜0.05）。結(jié)論：HLA-DR和HLA-DQ分子含量在瘢痕疙瘩患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中增高提示瘢痕疙瘩患者機(jī)體可能處于高免疫應(yīng)答狀態(tài)；基因型檢測(cè)結(jié)果則提示HLA-DR14、HLA-DQ5可能是瘢痕疙瘩的易感基因，HLA-DR17、HLA-DQ8可能是抵抗基因。

[關(guān)鍵字]瘢痕疙瘩；HLA-DR；HLA-DQ

[中圖分類(lèi)號(hào)]R619+.9[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）03-04

Variation of HLA-DR、DQ molecule in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients

SUN Dong-jie， CHEN Dong-ming， NIE Fang-fei， LI Sheng， ZHAO Xia， BAO Wei-han

(Department of Plastic Surgery， the Third Hospital of Peking University， Beijing 100083， China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the variation of contents and genotypes of HLA-DR、DQ molecules in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients. MethodsThe expression levels and distribution patterns of HLA-DR、DQ in peripheral blood mononuclear cells were determined in 10 samples of keloid， 10 samples of thin and flat scar and 10 cases of normal people with immunocytochemical staining. The gene locuses of HLA-DR、DQ in peripheral blood mononuclear cells of 60 patients with keloid and 110 normal persons were detected by using polymerase chain reaction-sequence specific primers（PCR-SSP）.Results①The variation of the HLA-DR、DQ molecules contents in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients: The integrated absorbance of HLA-DR+、HLA-DQ+ cells in the keloid group（813.16±62.77，420.12±94.25）was higher respectively than that of HLA-DR+、HLA-DQ+ cells in the flat scar（636.22±133.95，302.77±89.77） and normal people groups （597.88±166.36，308.57±44.05）（P＜0.01）. ②The variation of gene locuses of HLA-DR、DQ in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients: HLA-DR14 and HLA-DQ5 antigen frequencies were significantly higher in patients with keloid（0.16，0.28） than those in the controls（0.06，0.15）（P<0.05）， while HLA-DR17 and HLA-DQ8 antigen frequencies were significantly lower in patients with keloid（0.02，0.03） than those in the controls（0.13，0.15）（P<0.05）.ConclusionThe contents increase of HLA-DR、DQ molecules in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients suggests that the organism of keloid patients may have strong immune reactions; The result of genotyping suggests that HLA-DR14 and HLA-DQ5 may be the predisposing genes of keloid while HLA-DR17 and HLA-DQ8 may be the counteracting genes of keloid.

Key words: Keloid;HLA-DR;HLA-DQ

皮膚瘢痕疙瘩的發(fā)生是多因素作用的結(jié)果，其中免疫因素起著至關(guān)重要的作用[1-2]。HLA-II類(lèi)分子包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP，主要分布于B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和活化的T細(xì)胞表面，負(fù)責(zé)呈遞外源性抗原，是免疫應(yīng)答反應(yīng)的關(guān)鍵分子[3]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析瘢痕疙瘩患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-DR與HLA-DQ蛋白含量和分布；采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物技術(shù)（PCR-SSP）檢測(cè)瘢痕疙瘩患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-DR、HLA-DQ基因位點(diǎn)的改變，以探討HLA-DR、HLA-DQ在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)理中的作用。

1材料和方法

1.1 材料來(lái)源：實(shí)驗(yàn)所用血液標(biāo)本均來(lái)自北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科瘢痕門(mén)診。采用瘢痕疙瘩、扁平瘢痕及正常人外周血各10例用于HLA-DR、HLA-DQ蛋白檢測(cè)；60例瘢痕疙瘩及110例正常人的外周血用于HLA-DR、HLA-DQ的基因檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)方法：外周血單個(gè)核細(xì)胞涂片的制備：取新鮮外周血，肝素抗凝，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋后，采用密度梯度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞，離心涂片機(jī)涂片，直徑0.8cm，丙酮固定，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

免疫細(xì)胞化學(xué)染色：選用鏈霉卵白素-過(guò)氧化物酶法顯示HLA-DR，HLA-DQ蛋白。I抗，鼠抗人HLA-DR、HLA-DQ單克隆抗體及HistostainTM -SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)公司購(gòu)置，DAB顯色。

1.2.2 序列特異性引物多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR-SSP）方法：基因組DNA的提取[4]：取靜脈血5ml，EDTA抗凝，用鹽析法提取DNA，測(cè)定吸光度值，調(diào)整DNA濃度至50～100ng/μl。

序列特異性引物多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR-SSP）[5]：Biotest DRB SSP kit（德國(guó)）、DQB SSP kit（德國(guó)）PCR反應(yīng)板（德國(guó)）內(nèi)含有32個(gè)反應(yīng)孔，第一孔為陰性對(duì)照孔，不含特異性引物，其他31孔含有特異性引物，可檢測(cè)31個(gè)基因位點(diǎn)，31對(duì)特異性引物已由公司預(yù)先放入反應(yīng)孔中?；蚱尉鶠?20～270bp。PCR反應(yīng)體系：50μlPCR反應(yīng)緩沖液（10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2），含4種200μmol的dNTP，一對(duì)引物各為1μmol/L，1μg待擴(kuò)增DNA，混合后94℃5min預(yù)變性加入Taq酶、模板DNA。PCR反應(yīng)條件：94℃4min預(yù)變性，94℃10s變性，退火65℃1min，延伸72℃1min為一個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，共35個(gè)循環(huán)，后延伸72℃5min。

結(jié)果判定：擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中（含溴化乙錠1μg/ml）電泳后，紫外透射燈下觀(guān)察結(jié)果，相應(yīng)的HLA-DR、HLA-DQ等位基因電泳道中可見(jiàn)到清晰的DNA條帶即為陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析：HLA-DR+、HLA-DQ+細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法：在10×40倍光鏡下，選取細(xì)胞分布均勻的區(qū)域記200個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，分析各組陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

HLA-DR+、HLA-DQ+ 細(xì)胞的積分光密度：應(yīng)用CMIAS2001B多功能彩色圖像分析儀，在10×20倍數(shù)下采集圖像，每張樣本選取5個(gè)視野，檢測(cè)瘢痕疙瘩組、扁平瘢痕組和對(duì)照組外周血HLA-DR+、HLA-DQ+單個(gè)核細(xì)胞的積分光密度。積分光密度是各個(gè)單獨(dú)探測(cè)的像點(diǎn)密度分布的總和，即積分光密度=被測(cè)物體面積×平均光密度。用積分光密度表示HLA-DR、HLA-DQ分子的蛋白含量，P＜0.05為有顯著性差異。

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，細(xì)胞計(jì)數(shù)和積分光密度的數(shù)據(jù)均以x±s表示，所得計(jì)量資料多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較用LSD方法，P＜0.05為差異有顯著性意義。

1.3.2HLA-DR、HLA-DQ基因型分析方法：瘢痕疙瘩組及正常對(duì)照組HLA-DR、HLA-DQ各基因位點(diǎn)的抗原頻率（antigen frequency，Af）=陽(yáng)性例數(shù)/檢測(cè)例數(shù)，基因頻率（gene frequency，Gf）=1- ；計(jì)算相對(duì)危險(xiǎn)率（relative risk，RR），RR=瘢痕疙瘩組抗原頻率/對(duì)照組抗原頻率，RR＞1表示該基因位點(diǎn)瘢痕疙瘩組的抗原頻率高于對(duì)照組，即有此基因的人患該病的危險(xiǎn)性增高，RR<1則反之，RR=1表示該位點(diǎn)與疾病無(wú)關(guān)聯(lián)，最后經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析其易感性基因位點(diǎn)， P＜ 0.05為有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 瘢痕疙瘩、扁平瘢痕和正常人外周血HLA-DR+及HLA-DQ+單個(gè)核細(xì)胞的比較：Wright-Giesa染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察離心涂片，可見(jiàn)單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，核大圓形，一側(cè)有切跡，呈藍(lán)紫色，胞質(zhì)少，呈天藍(lán)色；單核細(xì)胞較大，核為橢圓形或腎形，呈淺紫色，胞質(zhì)灰藍(lán)色；偶見(jiàn)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等細(xì)胞（圖1）。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鏡下可見(jiàn)HLA-DR陽(yáng)性和HLA-DQ陽(yáng)性信號(hào)均在單個(gè)核細(xì)胞表面，著棕黃色，無(wú)棕黃色的為陰性細(xì)胞（圖2）。

圖1 正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Wright-Giesa染色，400×）(單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞（a），核大圓形，一側(cè)有切跡，呈藍(lán)紫色，胞質(zhì)少，呈天藍(lán)色。單核細(xì)胞（b）較大，核為橢圓形或腎形，呈淺紫色，胞質(zhì)灰藍(lán)色)

瘢痕疙瘩組、扁平瘢痕組和正常對(duì)照組3組HLA-DR+單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量分別為（62.82±13.0）、（59.85±13.75）和（61.05±16.37）；HLA-DQ+單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量分別為（21.90±8.86）、（29.20±8.85）和（21.10±8.16）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間比較（P＞0.05）差異無(wú)顯著性意義。而瘢痕疙瘩組HLA-DR+、-DQ+單個(gè)核細(xì)胞的積分光密度均高于扁平瘢痕組和正常對(duì)照組(P＜0.01)（表1）。

2.2 瘢痕疙瘩和正常人外周血HLA-DR及HLA-DQ基因型的比較：PCR-SSP結(jié)果顯示正常人及瘢痕疙瘩患者HLA-DR、HLA-DQ基因分布在23個(gè)基因位點(diǎn)（表2），通過(guò)相對(duì)危險(xiǎn)率（RR）評(píng)估瘢痕疙瘩與HLA-DR，-DQ基因位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)，結(jié)果RR＞1的基因位點(diǎn)包括HLA-DR1、11、13、14、15、51和DQ5、6；RR＜1的基因位點(diǎn)包括HLA-DR4、9、10、12、16、17、52、53和DQ2、7、8、9；RR≈1的包括HLA-DR7、8和HLA-DQ4。 經(jīng)χ2檢驗(yàn)，瘢痕疙瘩組與對(duì)照組相比HLA-DR14及HLA-DQ5的抗原頻率（0.16，0.28）明顯高于對(duì)照組（0.06，0.15）（P＜0.05），其RR值分別為2.62和1.83；HLA-DR17和HLA-DQ8的抗原頻率（0.02，0.03）明顯低于對(duì)照組（0.13，0.15）（P＜0.05），RR值分別為0.13和0.23。

3討論

HLA-DR 和HLA-DQ 屬HLA-Ⅱ類(lèi)抗原， 編碼它的基因群稱(chēng)為人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC） 位于第6 號(hào)染色體的短臂上，是目前已知的人體最具多態(tài)性的基因體系[3]。HLA-Ⅱ類(lèi)抗原存在于抗原提呈細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，負(fù)責(zé)外源性抗原的加工和提呈，對(duì)CD4＋T細(xì)胞具有限制作用，通過(guò)抗原肽-MHC-T細(xì)胞受體三分子復(fù)合體形式參與免疫應(yīng)答[6]。樹(shù)突狀細(xì)胞是一種抗原呈遞細(xì)胞，HLA-DR＋樹(shù)突狀細(xì)胞在瘢痕疙瘩組織中的增加說(shuō)明瘢痕疙瘩局部處于高免疫應(yīng)答狀態(tài)[7-8]。與扁平瘢痕組和正常對(duì)照組相比，瘢痕疙瘩患者外周血HLA-DR＋、HLA-DQ＋單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量雖無(wú)明顯差異但HLA-DR、HLA-DQ含量增多，此結(jié)果表明，瘢痕疙瘩患者機(jī)體可能也處于一種高免疫應(yīng)答狀態(tài)，當(dāng)有某些因素刺激時(shí)易發(fā)生機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)。該結(jié)果可能解釋臨床上常說(shuō)的“瘢痕體質(zhì)”，即在同樣部位、同樣致傷因素作用下，大部分人能正常愈合，而少部分人形成瘢痕疙瘩的現(xiàn)象。

早在1977年Laurentaci 等人報(bào)道白種人增生性瘢痕與HLA-B14 和HLA-Bw16 相關(guān)開(kāi)始[9]，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)HLA-B21、-Bw35、-DR5、-DQw3 、HLA-DQ5和A血型與瘢痕疙瘩的發(fā)生有較密切的關(guān)系[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR-SSP 方法觀(guān)察發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩的發(fā)生與HLA-DQ5及HLA-DR14呈正相關(guān)，與HLA-DR17及HLA-DQ8呈負(fù)相關(guān)。HLA-DR14、-DQ5、-DR17 和HLA-DQ8 基因位點(diǎn)可能是瘢痕疙瘩患者易感的單倍型。其中HLA-DR14和HLA-DQ5可能是瘢痕疙瘩的易感基因，而HLA-DR17和HLA-DQ8則可能是其抵抗基因。

與本研究比較，前期研究[11]結(jié)果顯示HLA-DR14位點(diǎn)的相對(duì)危險(xiǎn)率在所有基因位點(diǎn)中最高（2.98），但經(jīng)χ2檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。排除計(jì)算方法問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)增加了樣本量，統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)DR14位點(diǎn)相對(duì)危險(xiǎn)率雖稍有降低（2.62），但經(jīng)過(guò)χ2檢驗(yàn)P＜0.05，差異顯著。該結(jié)果說(shuō)明HLA-DR14在瘢痕疙瘩發(fā)生過(guò)程中可能是一個(gè)參考的單倍型基因。

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[收稿日期]2007-12-26[修回日期]2008-03-05

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文?！?/p>