COX-2抑制劑聯(lián)合順鉑通過Wnt/β-catenin信號通路對肺癌細胞增殖與凋亡的影響

趙一波 邢 述

肺癌無論是發(fā)病率還是死亡率均高居全世界惡性腫瘤之首。雖然當今肺癌治療手段有很大發(fā)展，但其預(yù)后仍然較差。以鉑類為主的聯(lián)合化療方案仍然是目前肺癌治療的重要手段，常規(guī)化療雖然取得了較大的進步，但是大劑量、多療程、多聯(lián)合化療會加劇患者毒副作用、嚴重抑制免疫系統(tǒng)，使得機體的免疫力下降，嚴重損傷患者的機體。同時化療藥物產(chǎn)生的耐藥性成為肺癌治療的難點[1]。肺癌的發(fā)病是1個多因素、多階段、多基因及多信號通路共同作用的復(fù)雜機制，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用[2]。近年來COX-2抑制劑的抗腫瘤作用日益受到人們的關(guān)注，其可以通過多種途徑對腫瘤生長產(chǎn)生抑制作用[3]。因此，本研究擬以肺腺癌A549細胞系為研究對象，研究探討COX-2抑制劑(塞來昔布)聯(lián)合順鉑對肺腺癌細胞增殖和凋亡的影響，以及與Wnt/β-catenin信號通路之間的關(guān)系，為兩藥聯(lián)合應(yīng)用臨床治療肺癌提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑

人肺腺癌A549細胞株購于中科院上海細胞庫，塞來昔布膠囊(西樂葆)(0.2g，輝瑞制藥有限公司，批準文號：國藥準字J20180063)，注射用順鉑(凍干型)(10mg，齊魯制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20183652)；RT-PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，MTT試劑盒購于美國Sigma公司；兔抗人Wnt、β-Catenin和c-myc單克隆抗體均購于美國Abcam公司，GAPDH單克隆抗體、FITC標記羊抗兔IgG購于武漢博士德生物工程有限公司；Hoechst3358試劑染液購于北京百奧萊博科技有限公司，TUNEL試劑盒購于美國羅氏公司，ABI Prism7500型熒光定量PCR儀購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，流式細胞儀購于美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 人肺腺癌A549細胞培養(yǎng) 肺腺癌A549細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青鏈霉素(青鏈霉100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、95%飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱，每2 d更換一次培養(yǎng)基，實驗均取處于對數(shù)生長期的細胞，制備成單細胞懸液。

1.2.2 細胞藥物處理及分組 塞來昔布去除糖衣后溶解于DMSO制成濃度為0.1 mmol/l母液，實驗用PBS溶液稀釋至目標濃度，保持終溶液DMSO濃度<0.1%。取對數(shù)生長期肺腺癌A549細胞5×105/ml接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入相應(yīng)藥物，實驗分組：對照組(不加任何藥物)；塞來昔布組(塞來昔布；25 μmol/l)；順鉑組：(順鉑；1 mg/l)；聯(lián)合組：(塞來昔布；25 μmol/l+順鉑；1 mg/l)，均以RPMI 1640培養(yǎng)液配置濃度。

1.2.3 甲基偶氮哇鹽法(MTT)檢測細胞細胞活力檢測 取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，每孔按100 μl(1×104/孔)接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，24 h后分別加入不同處理藥物及全培養(yǎng)液的空白對照組，置常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h時間后每孔加入MTT溶液20 μl(50 mg/ml)，37 ℃孵育4 h；去除上清液，每孔加150 μlDMSO，酶標儀檢測每孔波長490 nm吸光度值(A值)，求其平均值，并計算細胞抑制率，抑制率(E)=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%，并繪制細胞生長抑制曲線。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化 接種A549細胞24 h后分別加藥，48 h后收集細胞，PBS洗2次，參照檢測試劑盒說明書逐步操作，最后流式細胞儀上機檢測，采用軟件分析細胞周期分布變化。

1.2.5 Hoechst3358染色法檢測細胞凋亡率 接種A549細胞24 h后加藥，48 h后收集不同處理組細胞，4%多聚甲醛固定20 min，添加10 μg/ml Hoechst3358的染液，37 ℃孵育30 min，熒光顯微鏡觀察隨機選擇至少10個觀察視野，計算細胞凋亡率(%)=凋亡陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

1.2.6 免疫熒光法檢測細胞Wnt、β-Catenin蛋白的表達 以5×105/ml細胞接種蓋片上，24 h后分組處理，孵育48 h后，取出細胞爬片，預(yù)溫PBS洗滌，4%預(yù)冷多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗滌；山羊血清封閉30min，PBS洗滌；添加Wnt和β-Catenin一抗(1∶200)，4 ℃濕盒過夜，PBS洗滌；FITC標記二抗(1∶200)，37 ℃避光孵育1.5 h，PBS洗滌；甘油封片，熒光顯微鏡采片。

1.2.7 Real-Time PCR方法檢測Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA水平 參照Trizol試劑說明書操作提取總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?，鑒定總RNA濃度及純度。采用Real-Time PCR試劑盒，按照上面反應(yīng)體系進行cDNA的合成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系?；蛞镄蛄校篏APDH：上游5'-CAGAGTGGACGGATTTTGGTCCTAT-3'，下游：5'-ATCCTTCTCAATCGTGGTGATGTC-3'；Wnt：上游：5'-CAGTGAGCTGGTTGTCACCT-3'，下游：5'-CTGAGCTGCTCCTTGAAGTG-3'；β-Catenin上游：5'-CAAGGAGCAGGTAATCGCAAGT-3'，下游5'-GGAACCAGAATGGGAGAAACG-3'；c-myc：上游：5'-TGAGGAAACGAC GAGAACAG-3'，下游：5'-ACGAGAGATTCCAGCTCCCTTGATTCAAACGC-3'。ABI Prism7500型熒光定量PCR儀中擴增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火2 min，40個循環(huán)。以內(nèi)參GAPDH進行標準化，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖能力

塞來昔布組、順鉑組、聯(lián)合組較對照組細胞抑制率增高，細胞增殖能力下降(P<0.05)，尤以聯(lián)合組細胞抑制率最高，細胞增殖能力最低(P<0.05)；且各組對細胞的殺傷效應(yīng)呈時間依賴性，見圖1。

圖1 MTT檢測各組細胞增殖生長狀況

2.2 細胞周期變化

塞來昔布組、順鉑組、聯(lián)合組較對照組處于G0/G1期細胞增多(P<0.05)，以聯(lián)合組處于G0/G1期細胞最多(P<0.05)；塞來昔布組、順鉑組S期、G2期細胞減少(P<0.05)，以聯(lián)合組處于S期、G2期細胞最少(P<0.05)，見表1。

表1 流式細胞儀檢測細胞周期變化

注：※為與對照組比較，P<0.05。

2.3 細胞凋亡率

對照組細胞較多，無邊聚，胞質(zhì)染色均勻一致，熒光較弱；聯(lián)合組細胞較少形態(tài)飽滿，形狀規(guī)則，染色較深、染色質(zhì)濃集、熒光強，細胞核呈現(xiàn)核固縮濃染，核分葉呈月牙狀或蠶豆狀，碎裂呈米粒狀大小不等的碎片，形成凋亡小體。對照組、塞來昔布組、順鉑組、聯(lián)合組凋亡率分別為：(0.78±0.04)%、(32.56±1.67)%、(25.67±1.98)%、(63.37±2.12)%。塞來昔布組、順鉑組、聯(lián)合組較對照組細胞凋亡率增高(P<0.05)，尤以聯(lián)合組細胞凋亡率最高(P<0.05)。

2.4 Wnt、β-Catenin和c-myc的蛋白表達

Wnt主要表達于A549細胞胞膜和胞質(zhì)，β-Catenin主要表達于A549細胞胞質(zhì)，c-myc主要表達于A549細胞胞質(zhì)。對照組細胞Wnt、β-Catenin和c-myc熒光很強，塞來昔布組和順鉑組熒光強度減弱，聯(lián)合組熒光強度顯著減弱。塞來昔布組、順鉑組、聯(lián)合組較對照組細胞Wnt、β-Catenin和c-myc的蛋白均降低(P<0.05)，以聯(lián)合組降低最顯著(P<0.05)，見表2。

2.5 Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表達

塞來昔布組、順鉑組、聯(lián)合用藥組較對照組細胞Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表達均降低(P<0.05)，其中以聯(lián)合組降低最顯著(P<0.05)，見表3。

3 討論

非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%。含鉑化療方案是目前NSCLC一線標準化療方案[4]。而目前化療藥物由于缺乏特異性，毒性反應(yīng)成為使用劑量受到限制的關(guān)鍵因素，且化療過程中耐藥現(xiàn)象，同時也使患者的依從性和耐受性降低，影響遠期療效和患者的生存質(zhì)量。環(huán)加氧酶(cyclo-oxygenase，COX-2)過度表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，COX-2促進合成大量前列腺素，提高腫瘤的免疫耐受，降低宿主抗惡性腫瘤免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖[5]。COX-2抑制劑可抑制其催化產(chǎn)物前列腺素E2的合成，促進干擾素γ及TNF-α產(chǎn)生而恢復(fù)和維持免疫平衡，提升免疫監(jiān)視功能，增加細胞殺傷能力，抑制腫瘤生長，發(fā)揮增強免疫的機制[6]。選擇性COX-2抑制劑塞來昔布已經(jīng)證實其對多種腫瘤細胞有很好的抑制作用，化療藥物聯(lián)合選擇性COX-2抑制劑可降低單純化療藥物所引起的不良反應(yīng)，具有協(xié)同化療藥物通過調(diào)節(jié)細胞因子，增強機體細胞免疫，殺傷抑制癌細胞生長，從而增強化療藥物敏感性及療效，還可以減輕化療藥物的毒性，克服化療藥物的耐藥性問題[7]。

Wnt/β-catenin信號通路在肺癌發(fā)病中發(fā)揮了非常重要的作用，其依賴于β-catenin表達調(diào)控，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)作用機制，涉及腫瘤細胞信號傳導(dǎo)、細胞周期、細胞增殖、凋亡以及細胞黏附、浸潤、轉(zhuǎn)移等一系列過程[8]。Wnt信號異?；罨D(zhuǎn)導(dǎo)細胞內(nèi)的信號，Wnt配體與其受體結(jié)合，β-catenin被活化，在胞漿異常大量聚集，并進入胞核，并與Axin-APC-GSK-3β形成復(fù)合物，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子(TCF)/淋巴結(jié)增強因子(LEF)相結(jié)合，激活下游cyclinD1、Survivin、c-myc等細胞周期相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細胞異常增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[9-10]COX-2抑制劑通過藥抑制腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)β-catenin向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，減少Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因異常表達，從而抑制肺癌的發(fā)展[11]。

表2 免疫熒光檢測A549細胞Wnt、β-Catenin和c-myc的表達

注：※為與對照組比較，P<0.05。

表3 RT-PCR法檢測A549細胞Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表達

注：※為與對照組比較，P<0.05。

本研究表明，COX-2抑制劑(塞來昔布)和順鉑單獨及聯(lián)合應(yīng)用均能抑制肺癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡，降低Wnt、β-Catenin和c-myc蛋白表達，下調(diào)Wnt、β-Catenin和c-myc的mRNA表達，且兩藥聯(lián)合效應(yīng)優(yōu)于各自單獨用藥，表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用可以共同抑制COX-2-Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制其下游靶基因c-myc水平表達。因此，Wnt/β-catenin信號通路的活化狀態(tài)的變化必然會引起其下游靶基因c-my水平的變化。王玲嬋等[12]研究表明艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑能夠抑制非小細胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移，艾瑞昔布對洛鉑化療可能具有增敏作用。熊建萍等[13]研究發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑塞來昔布聯(lián)合順鉑可增強對A549人肺腺癌細胞的生長抑制效應(yīng)。陳剛等[14]研究表明塞來昔布可抑制人肺癌裸鼠移植瘤的生長和血管生成。塞來昔布與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用提高了奧沙利鉑的抗腫瘤效果。

綜上所述，塞來昔布聯(lián)合順鉑可協(xié)同抑制肺癌細胞生長增殖，促進細胞凋亡，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，其作用機制可能為兩藥通過共同抑制Wnt/β-Catenin信號通路，進而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤的效應(yīng)。為臨床上兩藥聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤患者提供一定的實驗及理論基礎(chǔ)。隨著本研究的不斷深入，Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控肺癌的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)將更加清晰，將更加全面揭示COX-2抑制劑抑制腫瘤，聯(lián)合化療藥增效的作用機制，為塞來昔布治療肺癌提供新的實驗依據(jù)。同時，塞來昔布的最佳劑量、毒副反應(yīng)等也尚有待于動物實驗以及臨床實驗進一步研究證實。