核因子－ｋＢ對急性缺血－再灌流心肌細胞凋亡及左室局部功能的影響

林　萍　任衛(wèi)東　王朝暉　劉長宏　武　俊　王月愛

【摘要】目的探討核因子-kB(nuclear factor-kB，NF-kB)對急性缺血一再灌流心肌細胞凋亡及左室局部功能的影響。方法24只健康雜種犬隨機分為對照組(c組)、缺血一再灌流組(IR組)和缺血一再灌流加特異性NF-kB抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷組(PDTC組)。IR組于第一對角支以下1cm處套扎左冠狀動脈前降支30 min，恢復(fù)血流再灌流120 min，PDTC組在心肌缺血前應(yīng)用PDTC(100 mg／kg)，C組游離左冠狀動脈前降支不結(jié)扎。超聲心動圖中的應(yīng)變率法測量左室局部收縮功能，simpsons雙平面法測左室射血分數(shù)(EF)，應(yīng)用脫氧核甘酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(TUNEL)測心肌細胞凋亡指數(shù)，免疫組化法及蛋白印跡(western-blot)檢測心肌組織中NF-kB的表達。結(jié)果IR組NF-kB在缺血心肌組織中表達增高，顯著高于C組(P＜0.05)，而PDTC組NF-kB表達明顯減弱，顯著低于IR組(P＜0.05)；PDTc組心肌細胞凋亡數(shù)較IR組明顯減少(P＜0.05)；IR組左室前壁缺血節(jié)段收縮期峰值應(yīng)變率(SRpeak)明顯減低(P＜0.01)，PDTC組的應(yīng)變率與IR組比較明顯增高(P＜0.05)。射血分數(shù)在三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論NF-kB在心肌缺血一再灌流中起重要作用，PDTC通過抑制NF-kB的表達從而減輕心肌缺血一再灌流損傷，改善心功能。

【關(guān)鍵詞】核因子-kB；心??；缺血-再灌流；細胞凋亡

NF-kB廣泛存在于包括心肌細胞，血管內(nèi)皮細胞在內(nèi)的各種細胞，通常以非活化狀態(tài)存在于細胞漿中，當(dāng)機體在外界因素刺激如細胞因子、缺血、低氧刺激作用下開始激活，由細胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核，可能是誘發(fā)細胞凋亡的機制。而細胞凋亡可影響心功能，應(yīng)變率成像是在多普勒組織成像發(fā)展起來的新技術(shù)，可以反映局部心肌功能，且不受整體心肌運動的影響。因此，本實驗應(yīng)用特異性NF-kB抑制劑PDTC研究其對缺血．再灌流心肌細胞凋亡及局部功能的影響，探討NF-kB在缺血一再灌流心肌中的作用，為進一步研究缺血一再灌流的發(fā)病機制及診療措施提供依據(jù)。

1材料與方法

1．1動物及分組

健康雜種犬24只(大連醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)，其中雌性14只，雄性10只，體質(zhì)量(10.2±2.4)kg，隨機均分三組(n=8)：對照組(C組)，缺血-再灌流(IR組)及缺血一再灌流加NF-kB抑制劑組(PDTC組)。3％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定于實驗臺上，行股動脈插管監(jiān)測動脈壓，體表連心電圖，氣管插管連呼吸機正壓人工呼吸，取胸骨正中切口開胸，剪開心包制成心包吊籃；IR組結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)30 min后再灌流120 min；PDTC組結(jié)扎前30 min靜推PDTC(100mg／kg)，余方法同IR組，對照組僅與第一對角支起點以下1 cm處穿線，不結(jié)扎。實驗結(jié)束后取IR組及PDTC組左室前壁缺血部位及C組相應(yīng)部位心肌組織，存于10％中性甲醛液及液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2實驗材料

原位細胞凋亡試劑盒堿性磷酸酶法(TUNEL)購于德國Roche公司，NF-kB免疫組化試劑盒購于美國Neomarkers公司，PDTC購于美國Sigma公司。

1．3左室整體及局部功能測量

使用美國GE公司Vivid7超聲儀，探頭頻率3.5 MHz，分別采集并儲存三組犬心尖四腔、兩腔和左室長軸切面的三個完整心動周期的動態(tài)組織速度圖，啟動應(yīng)變率分析軟件，將取樣點置于心內(nèi)膜下心肌組織中，以同步心電圖波形劃分收縮期和舒張期。Simpson's雙平面法測量左室射血分數(shù)。每幅圖像測三次取平均值。

1．4TUNEL法測心肌細胞凋亡

取三組甲醛固定24 h后心肌組織，石蠟切片厚5 μm，按照Roche公司試劑盒步驟檢測細胞凋亡，鏡下觀察，每張玻片上隨機選取5個區(qū)域，每個區(qū)域計數(shù)100個細胞，計算每100個細胞中的凋亡細胞數(shù)，即凋亡指數(shù)(AI)。

1．5免疫組化法測NF-kB表達

將待檢心肌標本用10％中性緩沖甲醛液固定18 h。脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋。切片厚4μm，脫蠟至水。3％H₂O₂室溫10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5 min，95℃微波10 min修復(fù)抗原活性，5％血清封閉，滴加1：200抗犬NF-kB抗體，4℃孵育過夜。PBS洗5 min，滴加熒光素化相應(yīng)二抗，37℃孵育20 min，PBS洗5 min，加鏈霉素一熒光素一過氧化物酶復(fù)合物，37℃孵育20min，PBS洗5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。每張玻片上隨機選取5個區(qū)域，每個區(qū)域計數(shù)100個細胞，計算每100個細胞中的陽性細胞數(shù)，即陽性細胞指數(shù)。

1．6蛋白印跡分析(Western-blot)定量檢測NF-kB的表達

按參考文獻方法行核蛋白提取，F(xiàn)orlin-酚蛋白定量法行蛋白濃度測定。取50 μg核蛋白行10％SDS-PAGE蛋白電泳并將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)移后的NC膜于封閉液中37℃封閉2 h，一抗為兔抗犬NF-kB抗體(1：200)，二抗為辣根過氧化物酶標化的羊抗兔抗體(1：10000)，最后通過DAB顯色。計算機掃描，采用圖象分析軟件(Lab－work3.0)比較目的條帶吸光度值(A Value)。

1．7統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件系統(tǒng)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(χ±s)表示，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較選用q檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1左室心功能

C組左室前壁中間段的收縮期峰值應(yīng)變率(SRpeak)為負值，表示心肌縮短。IR組左室前壁收縮期SRpeak峰值明顯減低，幾乎呈直線水平，與對照組比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，PDTC組左室前壁中間段的SRpeak值明顯增高，與IR組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。射血分數(shù)在三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2．2TUNEL標記的凋亡細胞數(shù)

C組各視野偶見TUNEL陽性標記的細胞。IR組缺血區(qū)TUNEL凋亡指數(shù)顯著增加，與C組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；PDTC組心肌TUNEL凋亡指數(shù)較c組差異雖具有統(tǒng)計學(xué)意義，但與IR組比較已明顯減少(P＜0.05)。

2．3免疫組化法測NF-kB的表達

與C組比較，IR組NF-kB陽性細胞指數(shù)明顯增加(P＜0.01)，而PDTC組的陽性細胞指數(shù)與c組比較差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但PDTC組與IR組比較已明顯減少(P＜0.05)。

2．4Western-blot法定量NF-kB的表達

IR組核蛋白NF-kB表達增加[吸光度值：(38.7±8.2)us(62.3±10.3)，q=4.43，P＜0.01]；PDTC抑制NF-kB活化[(62.3±10.3)us(31.9±6.5)，g=5.62，P＜0.01]。

3討論

在哺乳動物細胞中已發(fā)現(xiàn)NF-kB蛋白家族五個成員：RelA(p65)、c-Rel、RelB、NF-kB1(p50／p105)和NF-kB2(p52／p100)。NF-kB蛋白家族通常以同源或異源二聚體形式存在于大多數(shù)細胞漿中。在靜息狀態(tài)下，NF-kB通常以無活性狀態(tài)與其抑制蛋白IkB結(jié)合存在于細胞漿中。當(dāng)細胞受到各種刺激(包括細胞因子、缺氧、病毒、細菌感染等)后，IkB磷酸化，從而使NF-kB活化，由胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，與基因操縱子的NF-kB特異性位點結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄。Li等用凝膠電泳遷移率變化分析缺血-再灌流模型大鼠和對照組大鼠心肌的NF-kB DNA結(jié)合活性發(fā)現(xiàn)，對照組只有低水平的DNA結(jié)合活性；而實驗組在心肌缺血-再灌流15 min至3 h均出現(xiàn)NF-kB的結(jié)合活性增高。本實驗發(fā)現(xiàn)，急性心肌缺血．再灌流可以激活NF-kB，產(chǎn)生細胞核表達，定量NF-KB蛋白表達明顯增加，這與Altavilla等的研究結(jié)果相符。目前，關(guān)于NF-kB在缺血－再灌流細胞凋亡中的作用不明確。Ionoue等研究認為，再灌流后激活NF-kB，具有抗凋亡作用，但是Shou等認為NF-kB還具有促凋亡的作用。由于NF-kB的靶基因上存在眾多功能性的kB結(jié)合位點，激活后可能誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達，也可能誘導(dǎo)促凋亡基因的表達，至于誘導(dǎo)哪一類基因，依賴于刺激信號的差異和細胞類型的不同。筆者的研究顯示缺血一再灌流后心肌細胞大量凋亡并伴有缺血區(qū)域局部心肌功能的障礙。應(yīng)用PDTC抑制NF-kB的活性后則明顯減少再灌注心肌細胞凋亡數(shù)，改善心功能。提示NF-kB可能是參與調(diào)控急性缺血-再灌流細胞凋亡的重要因子。

臨床研究中以抑制NF-kB活化為目的減輕急性缺血-再灌流損傷是目前從基因水平上探索的新途徑。眾多研究人員發(fā)現(xiàn)，許多藥物包括肝素、腺苷、水楊酸制劑、維生素E樣抗氧化劑、吡咯烷甲基四環(huán)素等都通過各種途徑不同程度的阻斷NF-kB的激活，從而起到預(yù)防缺血-再灌注心肌損傷的作用，減少心肌細胞凋亡，改善心功能。

本研究證實，急性心肌缺血-再灌流NF-kB激活，心肌細胞凋亡可能為其早期的病理改變，并且與心肌局部收縮功能密切相關(guān)。適度干預(yù)NF-kB活化將會減少細胞凋亡改善心功能，其作用具體的分子生物學(xué)機制還有待于進一步研究。