涼血活血軟膠囊水提醇沉工藝研究*

★　吳雪　張偉　　張?jiān)汽?（.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院　濟(jì)南50355；.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)　山東青島66034）

涼血活血軟膠囊水提醇沉工藝研究*

★吳雪1張偉2張?jiān)汽?*（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院濟(jì)南250355；2.青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)山東青島266034）

目的：優(yōu)選涼血活血軟膠囊中白茅根、赤芍、當(dāng)歸、獨(dú)活、羌活五味藥材的水提醇沉最佳提取工藝。方法：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以芍藥苷提取率與干膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察煎煮時(shí)間（A）、煎煮次數(shù)（B）、加水量（C）三個(gè)因素對(duì)水提工藝的影響，以芍藥苷保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察藥液含醇量（A）、靜置時(shí)間（B）、藥液相對(duì)密度（C）三個(gè)因素對(duì)醇沉工藝的影響。結(jié)果：水提工藝各因素影響大小依次為煎煮次數(shù)＞煎煮時(shí)間＞加水量，其中煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間對(duì)提取有顯著影響（P＜0.05），其他因素影響不顯著（P＞0.05）；醇沉工藝各因素影響大小依次為藥液相對(duì)密度＞靜置時(shí)間＞藥液含醇量，其中藥液相對(duì)密度對(duì)提取有顯著影響（P＜0.05），其他因素影響不顯著（P＞0.05）；結(jié)論：最佳水提工藝條件為8倍量的水加熱回流提取3次，每次1h；最佳醇沉工藝條件為加入乙醇使藥液含醇量達(dá)55%，藥液相對(duì)密度1.15，靜置時(shí)間16h。

涼血活血軟膠囊；芍藥苷；干膏率；正交試驗(yàn)法

1　材料

1.1儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器，四元低壓梯度泵，柱溫箱，紫外檢測(cè)器；美國(guó)Agilent公司）；BS224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2原料白茅根、赤芍、當(dāng)歸、羌活和獨(dú)活取自本院中藥飲片庫(kù)，經(jīng)我院中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室張偉主任鑒定，白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindrica Beauv.var.major（Nees）C.E.Hubb.的干燥根莖；赤芍為毛莨科植物芍藥Paeonia lacti flora Pall.的干燥根。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（O－ liv1.）Diels的干燥根；羌活為傘形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang的干燥根莖及根、獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescens Maxim.f.biserrta Shan at Yuan；芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110736-200320）。

1.3試劑乙醇（分析純，煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；甲醇（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

2　方法與結(jié)果

2.1水提工藝優(yōu)選

2.1.1因素水平的確定根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定煎煮時(shí)間（A）、煎煮次數(shù)（B）、加水量（C）為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平確定正交設(shè)計(jì)方案，見表1。

表1　因素水平表

表2　水提L9（34）正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

2.1.2水提液的制備按處方中各藥材的比例，稱取赤芍、白茅根各3g，當(dāng)歸1.5g，獨(dú)活、羌活各0.9g，混合均勻，共取9份，按表2分別進(jìn)行加熱回流提取，提取液濾過(guò)，合并，用水分別定容至250μL，并編號(hào)得水提液1～9，重復(fù)3次。

2.1.3芍藥苷含量的測(cè)定

2.1.3.1對(duì)照品溶液的配制精密稱取芍藥苷對(duì)照品0.465mg置于10μL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，振搖使溶解，得濃度為46.5μg/μL的對(duì)照品溶液，將該溶 液 稀 釋 得 濃 度 分 別 為 34.875，23.25，13.95，9.30，4.65μg/μL的對(duì)照品溶液，濾過(guò)。

2.1.3.2供試品溶液的制備從2.1.2中的水提液中精密移取1μL蒸干，用甲醇溶解定容至5μL，濾過(guò)。

2.1.3.3色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（16：84）；流速：1μL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm

2.1.3.4線性關(guān)系的考察將對(duì)照品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Y=22.31X+23.003，r= 0.9991。結(jié)果表明芍藥苷在4.65～46.5μg/μL范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3.5供試品液含量測(cè)定按供試品制備方法對(duì)2. 1.2中各個(gè)水提液進(jìn)行處理得供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μL，測(cè)得芍藥苷峰面積，計(jì)算芍藥苷提取率。

2.1.4干膏率的測(cè)定精密吸取2.1.2中制得的水提液50μL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3h，移至干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量，以浸出物與原生藥量之比作為干膏收率。

2.1.5正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。綜合權(quán)重按芍藥苷提取率60%、干膏率40%折算，進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

各因素影響大小依次為B＞A＞C，其中因素B、A對(duì)提取有顯著影響（P＜0.05），因素C影響不顯著（P＞0.05）。故從芍藥苷提取率高、節(jié)約溶劑、節(jié)約時(shí)間等方面考慮，確定赤芍、白茅根、當(dāng)歸、羌活、獨(dú)活的最佳提取工藝條件為A1B3C1，即8倍量水提取3次，每次1h。

表3　方差分析表

2.2醇沉工藝條件的優(yōu)選

2.2.1因素水平的確定根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定藥液含醇量（A）、靜置時(shí)間（B）、藥液相對(duì)密度（C）為實(shí)驗(yàn)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平確定正交設(shè)計(jì)方案，見表4。

表4　因素水平表

2.2.2醇沉液的制備按處方中各藥材的比例，分別稱取赤芍、白茅根各60g，當(dāng)歸30g，獨(dú)活、羌活各18g，混合均勻，按水提最佳工藝提取，水提液濃縮至2500μL，取1μL按2.1.3.2項(xiàng)下方法處理，得水提液供試品，其余濃縮至相對(duì)密度為1.20，等分為3份，分別加水調(diào)節(jié)相對(duì)密度為1.10、1.15和1.20，再各自等分為3等份，編號(hào)為1～9，分別置于250μL錐形瓶中。按表5在1～9號(hào)藥液中加入相應(yīng)量的95%乙醇，靜置相應(yīng)時(shí)間，分別抽濾，濃縮或稀釋至200μL，取1μL 按2.1.3.2項(xiàng)下方法處理，得醇沉液供試品1～9。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.3芍藥苷保留率的測(cè)定將2.2.2中的水提液供試品、醇沉液供試品按色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μL，測(cè)得芍藥苷峰面積，計(jì)算芍藥苷含量。以水提液中芍藥苷含量與醇沉液中芍藥苷含量之比作為芍藥苷的保留率。

表5　醇沉L9（34）正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表6　方差分析表

2.2.4正交試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果及分析見表2-3。結(jié)果顯示：各因素影響大小依次為C＞B＞A，其中因素C對(duì)提取有顯著影響（P＜0.05），因素A、B影響不顯著（P＞0.05）。故從芍藥苷保留率高、節(jié)約溶劑、節(jié)約時(shí)間等方面考慮，確定赤芍、白茅根、當(dāng)歸、獨(dú)活、羌活的醇沉最佳提取工藝條件為A1B2C2，即藥液相對(duì)密度1.15，使藥液含醇量達(dá)55%，靜置16h。

2.3水提醇沉最佳工藝驗(yàn)證按優(yōu)選工藝進(jìn)行了3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即取2倍處方量的藥材共3批進(jìn)行試驗(yàn)，水提工藝中芍藥苷提取率分別為1.512%，1.591%，1.564%；干膏率分別為47.09%，45.96%，46.53%；醇沉工藝芍藥苷保留率分別為97.26%，98.73%，99.01%。均高于正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，表明該工藝是可行的。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)以赤芍、白茅根、當(dāng)歸、獨(dú)活、羌活五味藥材為研究對(duì)象，在水提工藝中以芍藥苷提取率和干膏率為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，以考察提取是否完全，鑒于芍藥苷提取率比干膏率能更好地反映藥物提取情況，故在設(shè)計(jì)權(quán)重系數(shù)時(shí)，芍藥苷提取率權(quán)重系數(shù)較大，二者的權(quán)重系數(shù)設(shè)計(jì)為6：4，這樣相對(duì)合理些；經(jīng)查閱文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定出水提工藝的主要影響因素煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、加水量，并采用L9（34）正交試驗(yàn)表，進(jìn)行了多次試驗(yàn)，最后綜合結(jié)果分析，得到最佳水提工藝，即8倍量水加熱回流提取3次，每次1h。

在醇沉工藝中以芍藥苷保留率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，以考察除雜工藝對(duì)有效成分的影響，本方各味中藥含多糖、淀粉量較高，干膏率也高，裝膠囊量偏大，故必須進(jìn)行除雜工藝研究；在醇沉工藝研究中，藥液的相對(duì)密度實(shí)際操作不易控制，先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出藥液相對(duì)密度為1.20時(shí)，藥材量與藥液的體積比為1.2，相對(duì)密度為1.15時(shí)，體積比為1.05，相對(duì)密度為1.1時(shí)，體積比為0.9，利用藥材量與藥液的體積比控制藥液的相對(duì)密度，方便實(shí)用；經(jīng)查閱文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定出醇沉工藝的主要影響因素藥液含醇量、靜置時(shí)間、藥液相對(duì)密度，并采用L9（34）正交試驗(yàn)表，進(jìn)行了多次試驗(yàn)，最后綜合結(jié)果分析，得到最佳醇沉工藝，即藥液相對(duì)密度1.15，使藥液含醇量達(dá)55%，靜置16h。

正交試驗(yàn)優(yōu)選的水提醇沉工藝條件經(jīng)驗(yàn)證，表明是可行的，有效的保證了涼血活血軟膠囊內(nèi)在質(zhì)量和臨床療效的穩(wěn)定性。

［1］謝曉梅，余長(zhǎng)柱，徐衡，等.赤芍飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究：芍藥苷的含量測(cè)定［J］.中國(guó)中藥雜志，2004，29（8）：759-762.

R283.6

A涼血活血軟膠囊是由我院臨床使用的涼血活血湯改變劑型而研制的新藥，有涼血、活血、清熱解毒之功效，用于血熱型銀屑病。白茅根、赤芍、當(dāng)歸、羌活和獨(dú)活五味藥是涼血活血軟膠囊主要組成藥物，為保證涼血活血軟膠囊質(zhì)量和臨床療效，更好地應(yīng)用于臨床且便于儲(chǔ)運(yùn)及服用，根據(jù)藥材成分、藥理作用、中藥用藥習(xí)慣和臨床療效，本文將采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以芍藥苷提取率、干膏率、芍藥苷保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)涼血活血軟膠囊的水提醇沉工藝進(jìn)行考察，優(yōu)選出最佳工藝條件。

青島市2011年度中醫(yī)科研計(jì)劃（2011-zyz002）。

（2014－08－28）編輯：曾文雪