阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中乳酸菌分離鑒定及多樣性研究

史迪，黨娜，武岳，馬騰，劉文俊，張和平

（內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室農業(yè)部奶制品加工重點實驗室內蒙古乳品生物技術與工程重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引 言

阿尤恩位處非洲是一個擁有熱帶海洋氣候的荒漠小鎮(zhèn)，當地畜牧業(yè)和畜產品貿易興盛，具有獨特的氣候特征和豐富的生物資源。這種獨特的氣候特征孕育著豐富的微生物資源，采集當地特色的自然發(fā)酵牛乳樣品，研究其特有的乳酸菌菌群結構對于野生型乳酸菌的保護和利用具有實際意義，對于豐富不同自然發(fā)酵乳制品中乳酸菌多樣性信息也有理論意義和研究價值。

自然發(fā)酵乳制品歷史悠久，酸牛乳、奶酪、酸駝奶等乳制品是我國內蒙古、新疆等地重要的飲食組成部分。自然發(fā)酵乳的特點是在自然的發(fā)酵過程中營養(yǎng)并沒有流失，同時又富含氨基酸、維生素等代謝產物，在增強口感和風味的同時，更有利于人體的吸收。目前，關于酸牛乳對乳糖不耐癥的緩解、維持人體腸道平衡等益生保健的作用均有報道[1]。乳球菌屬中，乳酸乳球菌經常被作為奶酪的發(fā)酵劑菌種，其次也被添加到發(fā)酵牛乳中，以促進酸牛乳濃郁的酪香味[2-4]；乳桿菌屬中，干酪乳桿菌1889年被分離出，是工業(yè)化生產中有應用價值的菌種之一[5]；鏈球菌屬中，檢出頻率較高的嗜熱鏈球菌，被認為是在工業(yè)化應用中重要的乳品發(fā)酵劑[6-8]。

本文通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法揭示了阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳樣品中的乳酸菌組成，對于后期優(yōu)良乳酸菌菌種的篩選提供了菌種資源；同時結合PacBio SMRT技術探索了阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳的細菌組成，對揭示該地區(qū)自然發(fā)酵牛乳樣品中的細菌多樣性有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與運輸

本文的5份自然發(fā)酵牛乳樣品于2018年10月采集自阿尤恩市周邊牧區(qū)，如表1。采集5份樣品于2 mL無菌凍存管中，用于乳酸菌的分離。再次采集5份自然發(fā)酵牛乳樣品于50 mL無菌離心管中，每個樣品采集20 mL，采集后加入10～15 mL的DNA TaKaRa保護液，用于宏基因組DNA提?。徊杉臉悠放R時存放4℃采樣箱中，一周內送達實驗室進行實驗操作[9]。

表1 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳樣品采集信息表

1.2 試劑與儀器

DNA保護液，大連TaKaRa公司；MRS培養(yǎng)基、M 17培養(yǎng)基，英國OXOID公司；TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit，美國OMEGA公司；SMRTbellTMTemplate Prep Kit試劑盒，Life Technologies公司；HiFi Hot Start Ready Mix PCR Kit，美國KAPA公司。

DYY-12電泳儀，上海一恒科技有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器，日本KAGOSHIMA SEISAKUSYO公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；梯度基因擴增儀，美國Life Technologies公司；UVPGDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國UVP公司；ND-1000微量紫外分光光度計，美國Nanodrop公司；PacBio RS II測序儀，美國Pacific Biosciences公司。

1.3 樣品乳酸菌計數

5份自然發(fā)酵牛乳樣品的乳酸菌計數選取生理鹽水作為稀釋液（濃度為0.85%NaCl）進行10倍梯度稀釋，采用傾注法對阿尤恩地區(qū)的5份自然發(fā)酵牛乳樣品進行乳酸菌計數[10]，5份樣品均選取10-5、10-6、10-7作為乳酸菌計數梯度，吸取1 mL 5份樣品的10-5、10-6、10-7梯度稀釋液于滅菌的90 m L玻璃培養(yǎng)皿中，傾倒25～30 mL加入瓊脂（1.2%Agar Powder/100 mL）的55℃MRS培養(yǎng)基和M 17培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基完全凝固后倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)48 h，活菌計數即每毫升樣品的乳酸菌菌落總數。

1.4 乳酸菌的分離純化及保存

選取與1.3中乳酸菌活菌計數相同的3個稀釋梯度，每個梯度吸取0.2 mL的稀釋液于與活菌計數相同成分的培養(yǎng)基上，使用涂布棒順時針均勻涂布，完成操作后選擇與1.3中相同的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)；培養(yǎng)結束后選擇形態(tài)不同的單菌落進行劃線純化，將革蘭氏染色陽性呈紫色、過氧化氫酶試驗顯示陰性、沒有芽孢且形態(tài)唯一的純培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)；將傳至三代的分離株進行菌種保藏，吸取以脫脂乳粉與酵母粉混合的保護劑800μL（8 g脫脂乳粉、2g酵母粉/100 mL），分裝在5支滅菌安瓿管和3支滅菌螺口凍存管中，（50μL/每支安瓿管、200μL/每支螺口凍存管），液氮速凍安瓿管和螺口凍存管后，將分離出的111株乳酸菌菌種于-80℃超低溫冰箱保存[9]。

1.5 菌株DNA提取與擴增

傳至二代的純培養(yǎng)物經3 800 rpm低速離心8 min后，棄液體培養(yǎng)基；加入3 mL配制好的0.85%生理鹽水，經3 800 rpm低速離心10 min后，棄上清液（重復此操作）；完成上述操作后，再吸取1 mL 0.85%生理鹽水，振蕩混勻后轉移至1.5 mL離心EP小管中，1 200 rpm離心2 min，吸凈1.5 mL EP管中的殘留液體后，使用TIANamp Bacteria DNA Kit（離心柱型）細菌基因組DNA試劑盒提取DNA，具體操作參照說明書中的11個步驟依次進行提取；提取后使用ND-1000微量紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳實時檢測濃度、純度以及完整程度。

PCR擴增體系：將111株符合濃度和純度的DNA作為擴增模板2μL；正、反引物（27F（5'-AGAGTT TGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACCTTGTTACGACTT-3'））各1.5μL；10×PCR Buffer(含Mg2+離子)5μL；d NTP 4μL；Taq DNA polymerase 0.5μL；dd H2O 35.5μL[1]。擴增條件為：95℃，預變性5 min；95℃，變性30 s；58℃，退火45 s；72℃，延伸1 min(進行30個循環(huán))，72℃，末端延伸10 min[10]。

1.6 自然發(fā)酵牛乳中乳酸菌菌株的鑒定

將條帶清晰、明亮無拖尾的PCR產物放于裝有冰袋的泡沫箱郵寄，由上海美吉生物科技有限公司接收并完成111個PCR產物的雙向測序工作。在NCBI數據庫中的BLAST下比較111株分離株的同源性，根據同源性結果在LPSN數據庫中下載與分離株同源性＞98%的模式株序列，采用Mega7.0軟件數據庫中的鄰接法構建進化樹[11]。

1.7 自然發(fā)酵牛乳樣品宏基因組DNA的提取

提取樣品DNA前需將5份樣品充分混勻，參照說明書的42個步驟使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取樣品DNA；提取后使用ND-1000微量紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗樣品DNA的濃度、純度及完整程度，將OD260/280為1.8～2.0之間，DNA濃度＞20 ng/μL且片段化程度小的DNA置于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆肹12]。

1.8 細菌16S rRNA基因片段全長擴增

DNA的擴增需要加入16個堿基長度的核苷酸序列（Barcode）用于區(qū)分5份自然發(fā)酵牛乳樣品。PCR反應擴增體系為：正向、反向通用引物(27F 1492R)各1.5μL，KAPA體系25.0μL，DNA模板1.5μL，dd H2O 20.5μL。PCR反應條件為：95℃預變性3 min，98℃變性20 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，（進行30次循環(huán)），72℃末端延伸2 min[13]。

1.9 PacBio SMRT三代測序及生物信息學分析

檢測合格的PCR產物，使用試劑盒(Pacific Biosciences SMRT bellTMTemplate Prep Kit)構建文庫，按產品說明書使用PacBio RS II儀器進行上機測序；將測序得到的原始序列依據最小循環(huán)次數為5次，預測準確度為90%，DNA插入片段為1 800 bp進行質量控制[10]；在QIIME平臺上對符合要求的序列進行分析；首先利用PyNAST軟件對每個序列進行排齊操作，其次在相似度為97%的條件下劃分OUT，再次使用RDP、Silva和Greengenes數據庫對代表性序列進行比對，并確定門、屬、種等水平的分類學信息，并在此基礎上計算分析α多樣性常用的超1指數、香農指數、發(fā)現(xiàn)物種數、和辛普森指數比較5份自然發(fā)酵牛乳樣品中的微生物種類和相對豐度；最后采用Origin軟件對摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳樣品的多樣性結果進行可視化處理。本研究中涉及的序列數據已提交至MG-RAST數據庫，序列號為no.mgp95102。

2 結果與分析

2.1 樣品乳酸菌計數結果

阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵中乳樣品中乳酸菌計數如表2。

表2 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳樣品中乳酸菌計數結果

本文5份自然發(fā)酵牛乳樣品的乳酸菌活菌數在5.89×105～8.33×106CFU/mL之間。呼斯楞[14]研究呼倫貝爾地區(qū)酸牛乳發(fā)現(xiàn)，6份酸牛乳樣品活菌數都達到106CFU/mL以上，由于本文5份自然發(fā)酵牛乳樣品與呼倫貝爾地區(qū)酸牛乳樣品采集后的貯存方式、以及運輸的時間大致相同，因此不同地區(qū)自然發(fā)酵乳的活菌數可能與樣品的貯存、運輸的時間有關。

2.2 分離株的表型特征

本文對阿尤恩地區(qū)5份自然發(fā)酵牛乳進行乳酸菌的分離鑒定，根據革蘭氏四步染色、過氧化氫酶的試驗，初步將革蘭氏染色陽性呈紫色、過氧化氫酶試驗顯示陰性、沒有芽孢且顯微鏡下形態(tài)唯一的111分離株暫定為乳酸菌，如圖1所示，111株分離株菌落顏色呈白色或淡黃色，表面呈粗糙或光滑形態(tài)，并且在顯微鏡下均勻分布。

圖1 分離菌株在熒光顯微鏡下圖片

2.3 乳酸菌分離株16S rRNA基因序列擴增結果

將質量濃度＜200 ng/μL，純度值（A260/A280）均在1.8～2.0之間的111株分離株進行16S rRNA基因序列擴增。圖2顯示在1 500 bp處有完整性較好的明亮條帶，因此PCR擴增產物滿足實驗要求。

圖2 部分16SrRNA基因的PCR凝膠電泳圖

2.4 自然發(fā)酵牛乳中乳酸菌分離菌株鑒定結果

5份摩洛哥阿尤恩地區(qū)的自然發(fā)酵牛乳中分離出111株乳酸菌菌株，鑒定為5個屬，10個種。

將每個分離株的16S rRNA序列與模式株整合后，應用MEGA7.0軟件構建部分菌株與模式株的系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。IMAU 98277、IMAU 98255與Lactobacillus paracasei ATCC 25302T(D 79212.1)模式株聚為一類；IMAU 98296與Lactobacillus plantarum ATCC 14917T(AF 404710.1)模式株聚為一類；IMAU 98291與Lactobacillus kefiri ATCC 35411T(AJ621553.1)模式株聚為一類；IMAU 98339與Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291T(X 195979.1)模式株聚為一類；IMAU 98211與Lactobacillus helveticus ATCC 15009T(FR 683085.1)模式株聚為一類；IMAU 98275與Lactobacillus kefiranofaciens ATCC 43761T(AJ575259.1)模式株聚為一類；IMAU 98151與Enterococcusitalicus DSM 15952T（AJ582753.1）模式株聚為一類；IMAU 98249與Enterococcus faecium ATCC 19434T(AB012213.1)模式株聚為一類；IMAU 98205與Streptococcusthermophilus ATCC 19258T(X 68418.1)模式株聚為一類；IMAU 98172、IMAU 98164與Lactococcus lactis ATCC 19435T(AB100803.1)模式株聚為一類；且分離株的基因序列與模式株的同源性均大于99%。

表3 阿尤恩自然發(fā)酵牛乳中乳酸菌分離鑒定結果

圖3 乳酸菌分離株16SrRNA基因序列進化樹

2.5 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中的多樣性分析

通過SMRT測序，5份阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳樣品一共獲得了33492條序列，平均每份自然發(fā)酵牛乳樣品有6698條DNA序列。通過劃分序列，一共獲得2270個具有代表性的OTUs，其中樣品MLG10獲得的代表性OTUs最少，為179條；樣品MLG7獲得的代表性OTUs最多，為667條；平均每個樣品獲得454條代表性序列。分析阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳樣品的稀疏曲線和香農曲線發(fā)現(xiàn)，MLG7樣品和MLG8樣品的稀疏曲線和香農曲線是基本重合的，并且測定的樣品中OTUs數量隨著測序深度的增加而增加，當測序量達到6 000時，一些樣品中還有物種被檢測到。在測序量為4 000時香農曲線已經趨于飽和，說明在此測序量下，5份樣品中的多樣性信息被充分的展示如圖4，表4。

2.6 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳的細菌群落結構

5份自然發(fā)酵牛乳樣品鑒定歸屬于8個細菌門、66個菌屬、131個菌種、細菌門水平，8個菌門分別是Firmicutes、Proteobacteria、Deinococcus-Thermus、Actinobacteria、Acidobacteria、Bacteroidetes、Fusobacteria、TM 7，其 中Firmicutes（69.63%）和Proteobacteria（29.77%）是主要菌門，其他菌門的相對含量均較低（表5）。

細菌屬水平，共檢測到66個細菌屬，如圖5（a），相對含量較高的細菌屬有：Lactococcus（31.80%）、Streptococcus（18.64%）、Lactobacillus（18.35%）等。MLG10中Streptococcus含量最多，達到90.33%；MLG13中的Lactococcus的含量最高（53.26%），MLG14中的Lactobacillus含量最高（43.51%）。

細菌種水平共檢測到131個細菌菌種，如圖5（b），主要菌種為Lactococcus lactis（22.95%）、Streptococcus thermophilus（18.05%）、Lactobacillus helveticus（10.26%）；相對含量高于1%的菌種還有Lactococcus chungangensis（7.53%）、Lactobacillus kefiranofaciens（4.32%）、Lactobacillus paracasei（1.88%）、Lactobacillus kefiri（1.42%）；進一步對自然發(fā)酵牛乳樣品中的主要菌種進行相對分析發(fā)現(xiàn)，5份樣品中不同菌種的相對含量存在明顯的差異，Lactococcus lactis是MLG13、MLG14樣品中的優(yōu)勢菌種，相對含量達到50.52%；Streptococcus thermophilus是MLG10樣品中的優(yōu)勢菌種，相對含量高達90.23%；Lactococcus chungangensis是MLG7、MLG8的優(yōu)勢菌種，相對含量為18.76%。

圖4 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳稀疏曲線及香農曲線

表4 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中序列信息和α多樣性指數

表5 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中細菌門水平的相對含量

根據表6發(fā)現(xiàn)，PacBio SMRT測序方法捕捉到5份自然發(fā)酵乳純培養(yǎng)方法分離到的全部菌株，其中5份樣品全部分離出Lactococcus lactis，共分離到51株，占總分離株的45.95%，SMRT測序方法測得Lactococcus lactis相對含量為22.95%，說明Lactococcus lactis為阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中的絕對優(yōu)勢菌種。

圖5 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中主要乳酸菌相對含量

表6 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵乳中純培養(yǎng)與PacBio測序方法鑒定結果

結合分離鑒定結果（表3）發(fā)現(xiàn)，樣品MLG7、MLG8分離到的菌株類別較為單一，主要分離出Lactococcus lactis；樣品MLG10主要分離出Streptococcus thermophilus；樣品MLG13和MLG14分離的菌株類別比較豐富，分離出Lactococcus lactis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus casei等菌種。

2.7 OTU水平菌群結構分析

OTU對α多樣性分析有重要的指導意義，5份自然發(fā)酵牛乳共產生1673個OTU（如圖6），其中僅出現(xiàn)在一份樣品中的OTU共有1217個，所包含的序列數為3422條，分別占OTU總數和質控合格序列數的72.74%和10.22%。

同時，5份樣品中均可能存在特有的OTU，MLG14樣品特有OTU最少（9個），MLG10樣品特有OTU最多（54個）。MLG7樣品特有乳酸菌為Lactobacillus gasseri，MLG8樣品特有乳酸菌為Lactococcus taiwanensis，MLG10樣品特有乳酸菌為Streptococcus salivarius，MLG13樣品特有乳酸菌為Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus zeae，MLG14特 有 乳 酸 菌 為Lactobacillus otakiensis。5份樣品還存在非乳酸菌菌種，MLG7樣品 特 有 菌 種 為Acinetobacter soli、Enterobacter asburiae，MLG8樣品特有菌種為Acinetobacter junii，MLG13樣品特有菌種為Arcobacter butzleri，MLG14樣品特有菌種為Enterobacter hormaechei。

圖6 阿尤恩自然發(fā)酵牛乳中OTU出現(xiàn)次數和各樣品中特有OTU分析

2.8 自然發(fā)酵牛乳中菌群關聯(lián)性分析

圖7 阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中種水平細菌之間的相關性

為揭示自然發(fā)酵牛乳細菌之間的相關關系，本研究利用Spearman相關性檢驗對5份樣品中平均相對含量大于1%的核心乳酸菌群進行相關性分析。圖7展示了優(yōu)勢乳酸菌種之間的相關關系，種水平結果顯示：Lactobacillus kefiri與Lactobacillus kefiranofaciens呈顯著正相關（R=1，P＜0.001)，Leuconostoc mesenteroides與Lactococcus lactis呈顯著正相關（R=1，P＜0.001)，Lactobacillus helveticus與Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kefiranofaciens呈顯著正相關（R=0.91，R=0.91，P＜0.05)，Lactobacillus paracasei與Lactococcus chungangensis呈顯著負相關（R=-0.97，P＜0.001)。

3 討 論

本文研究發(fā)現(xiàn)，Lactococcus lactis、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus kefiranofacien被分離出的菌株數較多，其中Lactococcus lactis為阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵牛乳的最優(yōu)勢菌種。Lactococcus廣泛存在于各乳制品中，例如：Quigley[16]發(fā)現(xiàn)，Lactococcus是愛爾蘭原奶中優(yōu)勢菌屬；V Lafarge團隊[17]發(fā)現(xiàn)Lactococcus lactis是生牛乳中的優(yōu)勢菌；Liu等[18]對內蒙古自然發(fā)酵牛乳的研究發(fā)現(xiàn)，Lactococcus lactis subsp.Lactis、Lactobacillus casei、Lactobacillus helveticus是優(yōu)勢乳酸菌；Yu等[20]對蒙古國自然發(fā)酵乳的研究發(fā)現(xiàn)，Streptococcus thermophilus、Lactobacillus helveticus為優(yōu)勢菌，因此本文中最優(yōu)勢菌種Lactococcus lactis、Lactobacillus helveticus與上述文獻的研究有相同之處。由于自然發(fā)酵乳受地理、氣候、工藝等因素的影響，所以微生物組成有相同之處，同時也有差異之處[21]。

本文通過測序技術檢測到的細菌種覆蓋了傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法分離到的所有菌株，進一步證實了本文通過純培養(yǎng)方法得到的摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵乳的分離鑒定結論。測序技術的優(yōu)點之一是在種水平可檢測到樣品中活的或曾經存在過的微生物，例如本研究通過測序檢測到的Lactobacillus brevis、Lactobacillus gasseri等菌種，可能受菌落選擇、豐度較低、菌種已死亡等因素的限制，導致在純培養(yǎng)方法中未分離到。金樁等[22]認為短乳桿菌LB-02在1%接種量下，最佳培養(yǎng)條件是35℃24 h。因此測序結果可在一定程度上指導乳酸菌的分離鑒定。技術的局限性在一定程度上限制了傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法的應用，但此方法的優(yōu)勢在于可分離得到純培養(yǎng)物[23]。

因此，傳統(tǒng)的純培養(yǎng)分離方法與測序技術有效、緊密的結合，一方面可充分揭示自然發(fā)酵乳中的微生物多樣性，另一方面為豐富菌種資源庫奠定基礎。

4 結 論

本文運用純培養(yǎng)方法對摩洛哥阿尤恩地區(qū)的5份自然發(fā)酵牛乳制品進行分離鑒定，共分離出111株乳酸菌菌株，歸屬為5個屬，10個種，Lactococcus lactis占樣品總分離菌株的45.95%；應用宏基因組16S rRNA基因測序技術從5份自然發(fā)酵牛乳樣品中檢測出8個門，66個屬，131個種的細菌，其中含量較高的乳酸菌有Lactococcus lactis、Streptococcus salivarius、Lactobacillus taiwanensis、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus zeae、Lactobacillus otakiensis等菌種，優(yōu)勢菌種為Lactococcus lactis，相對含量為22.95%。結果表明，Lactococcus lactis為阿尤恩地區(qū)5份自然發(fā)酵牛乳樣品的優(yōu)勢菌種，并且細菌種類豐富，樣品間細菌組成存在相似性和差異性。