Nestin的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性研究

張 昊 王 勇

（大理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大理671000）

Nestin屬于中間絲蛋白家族，是一種由胚胎期神經(jīng)前體細(xì)胞一過性表達(dá)的Ⅵ型中間絲蛋白，目前作為神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。現(xiàn)就Nestin的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 Nestin的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1．1 發(fā)現(xiàn)

1985年，Hockfield與Mckay首先發(fā)現(xiàn)，在胚胎大鼠脊髓神經(jīng)管神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的一種蛋白，被nestin抗體特異性識(shí)別。因?yàn)榭贵w識(shí)別的細(xì)胞具有神經(jīng)前體細(xì)胞的特征，所以nestin陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是神經(jīng)前體細(xì)胞［1］。1990 年 Lendahl［2］等克隆出編碼nestin基因，在該基因編碼的蛋白中發(fā)現(xiàn)，其中間段-α螺旋桿結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已知的其它所有5類中間絲蛋白有16%～29%的相似性，而被歸為中間絲蛋白。通過基因氨基酸序列分析表明，它與其他幾種中間絲蛋白有明顯不同，將其單獨(dú)歸為第Ⅵ類中間絲蛋白，并將其命名為Nestin（巢蛋白）。

1．2 結(jié)構(gòu)

1992年Dahlstrand［3］等最早分離了人類的巢蛋白基因，通過檢測(cè)和比較發(fā)現(xiàn)，人和大鼠巢蛋白基因在羧基端重復(fù)區(qū)域和內(nèi)含子的位置保守性較高，并且在3個(gè)內(nèi)含子中的兩個(gè)是與神經(jīng)絲共享的，充分表明nestin在從其他中間絲分離出來之后和神經(jīng)絲來自同一祖先的可能，而且也是神經(jīng)絲分支中分離出的最早一員。

Nestin的結(jié)構(gòu)與其他中間絲蛋白很相似，其氨基酸殘基數(shù)為1821，蛋白質(zhì)分子量為240，000。含有一個(gè)307個(gè)氨基酸的保守核心區(qū)，其中有一個(gè)α螺旋是由7個(gè)氨基酸特征序列構(gòu)成的，殘基a和d處于疏水；這個(gè)特征序列被認(rèn)為具有促進(jìn)絲形成時(shí)卷曲螺旋的相互作用，同時(shí)7個(gè)氨基酸特征序列由保守性不強(qiáng)的間隔序列分開［4］。作為第Ⅵ類中間絲蛋白，與其它5類中間絲蛋白的相比較，其基因的內(nèi)含子位置，蛋白的N端（頭，較短，只有11個(gè)氨基酸）、C端（尾，較長(zhǎng)，有479個(gè)氨基酸，且含有許多電荷密度高的氨基酸重復(fù)序列）以及在組織細(xì)胞內(nèi)的分布等方面均有區(qū)別。

2 Nestin的生物學(xué)活性

2．1 Nestin的表達(dá)

Nestin在細(xì)胞內(nèi)位于細(xì)胞質(zhì)，主要在未分化，具有分裂能力的細(xì)胞中表達(dá)，且具有嚴(yán)格的時(shí)空順序，其表達(dá)與其它中間絲成員的表達(dá)有密切關(guān)系。例如，在CNS發(fā)育中，當(dāng)神經(jīng)胚形成時(shí)，Nestin開始在神經(jīng)板皮層細(xì)胞表達(dá)，神經(jīng)細(xì)胞遷移基本完成后，Nestin的表達(dá)量下降，vimentin開始表達(dá)，隨后兩者共存。一旦神經(jīng)前體細(xì)胞朝終末方向分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞（如星形膠質(zhì)細(xì)胞）時(shí)，Nestin就停止表達(dá)，被α-internexin、神經(jīng)絲或外周蛋白代替［5］。這種表達(dá)模式在骨骼肌和心肌發(fā)育中得以進(jìn)一步的證實(shí)。巢蛋白在骨骼肌母細(xì)胞和心肌細(xì)胞中最先高表達(dá)，出生后表達(dá)明顯降低。隨后是vimentin和結(jié)蛋白表達(dá)，三方共存于骨骼肌母細(xì)胞和心肌細(xì)胞［6］?？梢姡琋estin的表達(dá)有著嚴(yán)格的時(shí)空順序，保證了神經(jīng)前體細(xì)胞執(zhí)行其內(nèi)在的功能，與朝終末方向分化成相應(yīng)的成熟細(xì)胞相匹配。

近年來實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在成年大鼠和成人基底前腦隔-斜角帶復(fù)合體和海馬可見許多nestinir神經(jīng)元．這些nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和神經(jīng)元核蛋白（NeuN），但不與膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）共存，提示這些nestin陽(yáng)性細(xì)胞為成熟的神經(jīng)元，從而推論這是一類較恒定的神經(jīng)元。雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，nestin-ir神經(jīng)元與輔酶Ⅱ依賴性黃遞酶神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元相間分布，但不呈交叉反應(yīng)，因此認(rèn)為，nestin-ir神經(jīng)元可能是MSDB中區(qū)別于膽堿能、GABA能神經(jīng)元的新神經(jīng)元，是與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的第3類神經(jīng)元［7］。通過Nestin免疫熒光與EdU熒光雙標(biāo)觀察及Nestin與DCX常規(guī)免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示基底前腦的nestin陽(yáng)性神經(jīng)元不表達(dá)DCX，從而證實(shí)不是新生的神經(jīng)元，而是一種成熟的神經(jīng)元［8］。通過單細(xì)胞RT-PCR、免疫熒光及電生理研究證實(shí)，基底前腦的nestin陽(yáng)性細(xì)胞是膽堿能神經(jīng)元的一種亞型［9，10］，而不是別于膽堿能神經(jīng)元的新神經(jīng)元。以上表明，基底前腦巢蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元是成熟膽堿能神經(jīng)元的一種功能狀態(tài)，而不是一種新生的神元。推測(cè)可能是Nestin讓膽堿能神經(jīng)元被賦予了特殊的功能，使神經(jīng)元具備了更強(qiáng)的生理活性和可塑性。

2．2 Nestin表達(dá)的基因調(diào)控

Nestin轉(zhuǎn)基因研究揭示，巢蛋白基因內(nèi)有3個(gè)內(nèi)含子，其中第1和第2內(nèi)含子中分別有一個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞型特異調(diào)節(jié)因子，分別指導(dǎo)報(bào)告基因在發(fā)育中的肌肉細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)。Nestin基因在第1個(gè)內(nèi)含子內(nèi)有兩個(gè)E-盒模體（E-box motif），表現(xiàn)為螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)，有調(diào)控骨骼肌母細(xì)胞表達(dá)巢蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。第2個(gè)內(nèi)含子中決定巢蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的結(jié)構(gòu)元件就存在于3′端保守區(qū)［11］。研究證實(shí)，Nestin基因的第2個(gè)內(nèi)含子具有決定Nestin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的兩個(gè)增強(qiáng)子，分別為CNS增強(qiáng)子和區(qū)域特異性增強(qiáng)子［12］。在該增強(qiáng)子中，有一段長(zhǎng)達(dá)30個(gè)堿基的結(jié)構(gòu)域（Nes30），包含有核激素受體，轉(zhuǎn)錄因子SOX和轉(zhuǎn)錄因子POU的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)揮核心控件的特性［13］。在Nestin的第2個(gè)內(nèi)含子中POU轉(zhuǎn)錄因子和位于POU轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上游的轉(zhuǎn)錄因子SOX的協(xié)同作用對(duì)增強(qiáng)子的激活起著關(guān)鍵性作用，這說明在Nes30中，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用在很大程度上反應(yīng)了對(duì)巢蛋白神經(jīng)增強(qiáng)子的調(diào)控。此外，Nestin的表達(dá)還受細(xì)胞周期蛋白素依賴性激酶（Cdk5）和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子等內(nèi)部因素調(diào)控，表明巢蛋白是上述因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用的一個(gè)重要的靶基因［14］。而外部因素，如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族、腦源性生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞抑制因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3、血小板源性生長(zhǎng)因子等也對(duì)Nestin表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

2．3 Nestin的功能

目前Nestin的功能并不是十分清楚，近幾年，由于基因工程技術(shù)的發(fā)展，研究者通過轉(zhuǎn)基因以及基因敲除等手段研究Nestin的功能成為可能，并已取得了一些成果。

Nestin作為一種中間絲蛋白，可以和微管、微絲一起構(gòu)成細(xì)胞骨架而達(dá)到維持神經(jīng)前體細(xì)胞的正常形態(tài)，含有Nestin的細(xì)胞骨架有可能增加神經(jīng)細(xì)胞的伸縮性和彈性，這對(duì)于發(fā)育過程是必要的。體外中間絲組裝及轉(zhuǎn)基因研究表明，由于Nestin不能獨(dú)立、自行組裝成中間絲，必須依賴與其共存的vimentin或α-internexin共聚組裝成神經(jīng)前體細(xì)胞內(nèi)的中間絲，才能發(fā)揮細(xì)胞骨架的作用。

在胚胎期具有分裂能力的心肌細(xì)胞及骨骼肌母細(xì)胞所表達(dá)的巢蛋白，也可能以共聚的組裝方式與波形蛋白（vimentin）、結(jié)蛋白（desmin）一道形成中間絲發(fā)揮相應(yīng)的作用［15］。Nestin蛋白作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志，也是神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新所需［16］，因此Nestin可用于神經(jīng)干細(xì)胞的分離、鑒別、培養(yǎng)，跟蹤巢蛋白的表達(dá)來分析神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生過程。

3 展望

近年來研究證明，在胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌等上皮腫瘤中也存在Nestin的表達(dá)［17］，大部分人認(rèn)為檢測(cè)Nestin在腫瘤組織中的表達(dá)水平對(duì)于評(píng)價(jià)腫瘤的生物學(xué)行為和患者的預(yù)后有明顯幫助。這充分證明Nestin在腫瘤細(xì)胞及反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，可被作為前體細(xì)胞的標(biāo)志物或診斷低分化腫瘤的指標(biāo)；也可作為神經(jīng)系統(tǒng)病變和損傷的快速敏感診斷指標(biāo)之一。醫(yī)務(wù)工作者可以使用巢蛋白的熒光組化方法，通過檢測(cè)巢蛋白的表達(dá)情況，從而確定病變發(fā)生的部位。因此臨床上巢蛋白可作為疾病的診斷指標(biāo)。

Nestin作為中間纖維蛋白的第4個(gè)亞族，被眾多研究者當(dāng)作是神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的標(biāo)志物［18］，因此可用于分離神經(jīng)干細(xì)胞，通過跟蹤巢蛋白的表達(dá)來分析神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生過程。實(shí)驗(yàn)表明，神經(jīng)干細(xì)胞移植到阿爾茨海默?。ˋlzheimer）模型大鼠腦內(nèi)，不僅能夠存活、增殖，并且可替代丟失、受損或壞死的神經(jīng)細(xì)胞而重建神經(jīng)通路，修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力［19］。這表明，神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)治療如阿爾茨海默?。ɡ夏晷园V呆）、帕金森病、外傷性脊髓損傷等中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一種有利的新手段，從而解決了胚胎腦組織移植治療這些疾病中所遇到的眾多技術(shù)和倫理道德難題［20］。因此，如何通過Nestin的研究，有效激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，使其成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有效治療手段的研究成為當(dāng)今的熱點(diǎn)。隨著對(duì)Nestin表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的深入研究，Nestin在臨床應(yīng)用中越來越廣泛，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新思路。

［1］ Frederiksen K，McKay RDG．Proliferation and differentiation of rat neuroepi-thelial precursor cells in vivo［J］．Neurosci，1988，8：1144-1151．

［2］ Lendahl U，Zimmerman LB，McKay RDG．CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein［J］．Cell，1990，60：585-595．

［3］ Dahlstrand J，Zimmerman LB，McKay RD，et al．Characterization of the human nestin gene reveals a close evolutionary relationship to neurofilaments［J］．Cell Sci，1992，103（Part 2）：589-597．

［4］ 李雪玲．第Ⅵ 類中間絲蛋白-Nestin［J］．細(xì)胞生物學(xué)雜志，2003，25（1）：5-8．

［5］ Liem RKH．Molecular biology of neuronal intermediate filaments［J］．Curr Opin Cell Biol，1993，5（1）：12-16．

［6］ 郭靈，姚志彬．巢蛋白及其功能［J］．解剖學(xué)研究，2001，23（3）：229-231．

［7］ 朱建華，王勇．基底前腦巢蛋白免疫陽(yáng)性神經(jīng)元研究現(xiàn)狀及展望［J］．四川解剖學(xué)雜志，2010，18（4）：26-29．

［8］ 朱丹青，任新，朱建華等．基底前腦巢蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的來源探索［J］．解剖學(xué)研究，2014，36（1）：8-12．

［9］ Zhu J，Gu H，Yao Z，et al．The nestin-expressing and non-expressing neurons in rat basal forebrain display different electrophysiological properties and project to hippocampus［J］．BMC Neurosci，2011，12（1）：129．

［10］ Guo KH，Zhu JH，Yao ZB，et al．Chemical identification of nestin-immunoreactive neurons in the rat basal forebrain：A re-examination［J］．Neurochem Int，2010，56（5）：694-702．

［11］ Lothian C，Lendahl U．An Evolutionarily Conserved Region in the Second lntron of the Human Nestin Gene Directs Gene Exmession to CNS Progenitor Cells and to Early Neural Ciest Cells［J］．European Journal of Neuroscience，1997，9（3）：452-462．

［12］ Lothian C，Prakash N，Lendahl U，et al．Identification of both general and region-specific embryonic CNS enhancer elements in the nestin promoter［J］．Exp Cell Res．1999，248（2）：509-519．

［13］ Shiny a Tanaka，Yusuke Kamachi，Aki Tanouchi，et al．Interplay of SOX and POU Factors in Regulation of the Nestin Gene in Neural Primordial Cells［J］．Molecular and Cellular Biology，2004，24：8834-8846．

［14］ 王詩(shī)韻，張若煜，劉學(xué)紅．脊髓發(fā)育和損傷修復(fù)過程中巢蛋白的作用及機(jī)制［J］．中國(guó)組織工程研究，2013，17（24）：4539-4544．

［15］ 倪雪峰，德偉．巢蛋白的研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2004，10（4）：204-206．

［16］ Park D，Xiang AP，Mao FF，et al．Nestin is required for the proper self-renewal of neural stem cells［J］．Stem Cells，2010，28（12）：2162-2171．

［17］ Dhingra S，F(xiàn)eng W，Brown RE，et al．Clinicopathologic significance of putative stem cell markers，CD44and nestin，in gastric adenocarcinomav［J］．Int J Clin Exp Pathol，2011，4（8）：733-741．

［18］ 余天平，張鵬，李昱等．膠質(zhì)纖維酸性蛋白和巢蛋白在血管性癡呆大鼠海馬中的表達(dá)［J］．中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24（8）：911-914．

［19］ 楊春，周輝，白琳琳，等．神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬突觸素表達(dá)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］．中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（10）：1803-1807．

［20］ 谷海剛，龍大宏，李曉濱等，神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)老年癡呆模型鼠基底前腦小白蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元和學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］．中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（12）：2235-2239．