高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品、保健食品中2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非

農(nóng)毅清，劉珈伶，袁光蔚，韋 環(huán)，廖 強(qiáng)，覃文霞，劉欣宜

（廣西－東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西 南寧 530001）

近年來，在一些宣稱具有補(bǔ)腎壯陽、增強(qiáng)性功能特效的抗疲勞類食品及保健食品中檢出包括西地那非、他達(dá)拉非等磷酸二酯酶5抑制劑（phosphodiesterase5，PDE－5）。PDE－5抑制劑是治療勃起功能障礙的一線經(jīng)典處方藥［1］。但PDE－5抑制劑的用藥及用量有嚴(yán)格要求和限制，尤其是心臟病患者、對處方中的成分過敏者及正在服用任何形式硝酸鹽類藥物的患者禁止服用［2］。因此，該類藥物必須在醫(yī)生指導(dǎo)下服用。若脫離醫(yī)生指導(dǎo)，長期過量食用含有該類物質(zhì)的保健食品會存在健康風(fēng)險，可能對心血管病患者帶來潛在的危害，對服用者的健康和生命安全將造成威脅。但一些不法分子牟利心切，在中藥保健品中大量添加有壯陽功能的非食用化學(xué)物質(zhì)，對人體造成了很大危害。為規(guī)范市場秩序，國家食品藥品監(jiān)督管理局一面高壓打擊此類違法行為，另一方面不斷發(fā)布非法添加物的相關(guān)補(bǔ)充檢驗方法，其中壯陽類非法添加物已補(bǔ)充檢驗方法涉及13種PDE－5 抑制劑［3－6］。然而不法生產(chǎn)者為了規(guī)避檢查，在食品和保健食品中添加現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測范圍之外的其他類似物，如添加羥基紅地那非［7］、二乙氨基前他達(dá)拉非［8－9］、2－羥乙基去甲基他達(dá)拉非［10－11］、甲羥基豪莫西地那非［12－13］等新型壯陽類非食用化學(xué)物質(zhì)。這些衍生物與已經(jīng)批準(zhǔn)上市的PDE－5抑制劑藥物具有相同的母核，結(jié)構(gòu)差異小，幾乎沒有藥理和毒理方面的研究信息，對公眾健康構(gòu)成了潛在的巨大威脅［14］。這些物質(zhì)除了在保健酒、牡蠣粉等保健食品中添加外，還添加到茶葉、糖果、咖啡等食品中。層出不窮的新型衍生物，花樣翻新的添加方式給監(jiān)管和檢驗工作帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，有必要開展食品、保健食品中新型那非類衍生物檢驗方法的研究，加強(qiáng)對存疑產(chǎn)品的檢查力度。

目前，檢測保健品中非法添加物質(zhì)的方法主要有薄層色譜法 （TLC）［15－16］、高效液相色譜法（HPLC）［17－18］及高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）［19－20］等。由于 TLC 法和 HPLC 法定性能力較弱，假陽性率較高，已逐步被靈敏度高、特異性強(qiáng)的HPLC－MS/MS法所取代［21］。HPLC－MS/MS法具有特異性好和靈敏度高的特點(diǎn)，集高效液相色譜法的高分離能力和質(zhì)譜法的高靈敏度、高性能于一體，成為現(xiàn)代檢測研究領(lǐng)域中強(qiáng)有力的分析工具之一，在打擊非法添加行為方面發(fā)揮著重要的作用。我國目前執(zhí)行的檢驗標(biāo)準(zhǔn)中均以液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測食品、保健食品中非法添加壯陽類非食用化學(xué)物質(zhì)，并以質(zhì)譜檢測結(jié)果作為判定依據(jù)。針對最新發(fā)現(xiàn)的一種新型他達(dá)拉非衍生物——2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非（2－Hydroxypropyl nortadalafil），結(jié)構(gòu)式如圖1所示［22］，本實(shí)驗采用HPLC－MS/MS法建立了多種食品基質(zhì)中該物質(zhì)的檢測方法，為食品監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，使違法添加無所遁形，保障人民飲食用藥安全。

圖1 2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非的結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗材料

1.1 儀器 Xevo TQ－XS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、Heraeus Multifuge X3R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；S180H型超聲波清洗機(jī)（超聲頻率37 kHz，德國Elma公司）；ML204型分析天平（感重 0.0001 g，瑞士 Mettler－Toledo 公司）；Milli－Q超純水器（美國Millipore公司）。

1.2 受試品與試劑 酒（每瓶500 ml）、牡蠣蛋白粉（每袋 3 g）、咖啡（每袋 2 g）、袋泡茶（每袋 15 g）、海參牡蠣顆粒（每粒 0.2 g）、金花牡蠣顆粒（每粒0.2 g）、海參牡蠣壓片糖果（每片 0.5 g）、秋葵海參花片（每片500 mg）均為市售產(chǎn)品，隨機(jī)購自網(wǎng)店及市內(nèi)各超市藥店；2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)品（加拿大TLC藥物標(biāo)準(zhǔn)品有限公司，純度98.7%）；甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲醇（分析純，廣東光華化學(xué)有限公司）；實(shí)驗用水為Milli－Q純水儀制備的超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；除特殊注明外，本方法所用試劑均為分析純，所配制的溶液均為水溶液。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱定2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇溶解并稀釋至100 ml，搖勻，制成濃度為0.1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，－20℃保存。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5 ml，用甲醇稀釋至10ml，搖勻，制成5μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，－20℃保存。精密移取該標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，加空白基質(zhì)溶液稀釋，制成濃度分別為 2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，臨用新配。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCRHSST3（100 mm× 2.1 mm，1.8μm）；柱溫：40℃；流動相：A為 0.1%甲酸水溶液，B為 0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.300 ml/min；進(jìn)樣量：1 μl；梯度洗脫方式：0 ～0.5 min，95%A；0.5 ～3.5 min，95% ～10%A；3.5～6.0min，10%A；6.0～6.1min，10%～95%A；6.1～9.0min，95%A。

2.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣：N2；碰撞氣：He；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：1000L/h；錐孔反吹氣流速：150L/h；錐孔電壓：40.0V；撞能量：25 V；目標(biāo)化合物保留時間：3.02 min，定量離子對（m/z）：434.1＞312.1，定性離子對（m/z）：434.1＞261.9 和 434.1＞168.9。

2.4 樣品前處理方法

2.4.1 液體樣品 取適量搖勻，精確吸取1.0 ml于50 ml容量瓶中，加入甲醇40 ml，超聲提取10 min，放至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22μm有機(jī)相型濾膜過濾，取續(xù)濾液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，備用。

2.4.2 固體樣品 取適量樣品粉碎混勻，稱取1 g試樣（精確至 0.001 g），置于 250 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲提取10 min，放至室溫，再次稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，4 500 r/min離心5 min，用0.22μm有機(jī)相型濾膜過濾，取續(xù)濾液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理方法優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑選擇 實(shí)驗考察了甲醇、50%甲醇溶液、乙腈等不同有機(jī)溶劑對陽性樣品（目標(biāo)物濃度：100 mg/kg）的提取效果，結(jié)果如表1所示。

表1 不同溶劑的提取效果

結(jié)果顯示，50%甲醇溶液對該體系的提取效果較差，必須通過擴(kuò)大溶劑量才能提高提取效果；而乙腈價格較為昂貴且提取效果不及甲醇，甲醇提取較為完全。通過采用50 ml、100 ml和200 ml體積甲醇反復(fù)提取，其提取率分別為 98.1%、99.5%、99.7%，考慮到溶劑消耗量問題，因此采用50 ml甲醇作為提取溶劑。

3.1.2 超聲提取時間選擇 實(shí)驗還考察了不同超聲提取時間（0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、40 min）對陽性樣品（目標(biāo)物濃度：100 mg/kg）的提取效果，提取率隨時間變化關(guān)系如圖2所示。

圖2 2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非提取率隨時間變化曲線圖

結(jié)果顯示，采用超聲提取方式可顯著提高樣品中目標(biāo)物質(zhì)的提取率，超聲提取10 min后提取率基本穩(wěn)定，因此采用超聲提取樣品10 min。

將所購樣品的空白基質(zhì)及溶劑按本方法進(jìn)行分析，考察是否存在干擾。結(jié)果顯示，空白基質(zhì)基本無干擾，溶劑也無干擾，該方法特異性良好。

3.2 檢測條件優(yōu)化

3.2.1 液相色譜條件 那非類化學(xué)物質(zhì)質(zhì)譜電離模式一般為正離子模式，因此采用揮發(fā)性的甲酸來調(diào)節(jié)流動相pH值以提高離子化效率。以甲醇作為有機(jī)相時，目標(biāo)化合物會出現(xiàn)雙峰，積分時必須以雙峰進(jìn)行計算，易造成誤判。乙腈作為有機(jī)相，目標(biāo)化合物為單峰，既能縮短出峰時間也能減少基質(zhì)干擾。實(shí)驗考察了乙腈－水、乙腈－0.1%甲酸、0.1%乙腈－0.1%甲酸等流動相體系，目標(biāo)峰在0.1%的甲酸水溶液條件下，峰形較好，質(zhì)譜響應(yīng)較高。為保持酸性平衡，在有機(jī)相中也添加了0.1%的甲酸。

為了提高待測物的分離效果和檢測靈敏度，實(shí)驗比較了HSST3、C18AQ、SB－C18三種不同性能C18色譜柱對待測物的分離和響應(yīng)情況。結(jié)果表明，待測物在三種C18柱上均出峰，響應(yīng)強(qiáng)度較穩(wěn)定，其中HSST3柱為分析柱時，峰形較好，保留時間穩(wěn)定，效果最佳。故本標(biāo)準(zhǔn)采用具有耐高壓高強(qiáng)度的硅膠顆粒色譜柱HSST3柱為分析柱。由于保健食品多為復(fù)雜混合物，為保護(hù)色譜柱、提高分離效率，實(shí)驗采用梯度洗脫模式?？疾炝硕喾N梯度洗脫條件對待測物分離和響應(yīng)值的影響，確定了2.2項中的梯度洗脫程序。

3.2.2 質(zhì)譜條件 2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非是以他達(dá)拉非為母核，以CH3CHOH－取代哌嗪二酮結(jié)構(gòu)中甲基的H。在ESI（＋）源強(qiáng)電場作用下容易質(zhì)子化，形成穩(wěn)定的［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰。實(shí)驗配制500 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液用針泵連續(xù)直接進(jìn)樣，采用正離子模式，MRM多反應(yīng)監(jiān)測，分別對毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔反吹氣流速、錐孔電壓、撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以確定化合物的母離子和子離子。實(shí)驗選擇離子豐度比最高且無干擾的離子作為定量離子，取另一個離子豐度較高、基線噪音低的離子作為定性離子對。標(biāo)準(zhǔn)溶液和陽性樣品（目標(biāo)物濃度：100 mg/kg）在實(shí)驗條件下的MRM色譜圖如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）和陽性樣品（b）的MRM色譜圖

3.3 分析方法評價

3.3.1 線性回歸方程和檢出限試驗 實(shí)驗比較了不同基質(zhì)在相同條件下基質(zhì)加標(biāo)曲線和甲醇溶劑配制曲線間的差異，采用以下公式計算基質(zhì)效應(yīng)（ME）：ME＝B/A×100%。其中式中B為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，A為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

結(jié)果顯示，目標(biāo)待測物的ME值為62.3%～80.0%，二者存在不同基質(zhì)中均有較大差異，說明檢測方法存在較大基質(zhì)效應(yīng)，因此選擇空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，每個濃度進(jìn)樣3次。以各組分峰面積與濃度作線性回歸，在質(zhì)量濃度為2～200 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999。在本實(shí)驗條件下，將標(biāo)曲濃度最低點(diǎn)溶液連續(xù)稀釋，以信噪比（S/N）為3時的濃度作為該化合物的檢出限，以信噪比（S/N）為10時的濃度作為定量限。2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限如表2所示。

表2 2-羥基丙基去甲他達(dá)拉非的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

3.3.2 回收率試驗 準(zhǔn)確吸取5μg/m l標(biāo)準(zhǔn)工作液0.02 ml、0.04 ml、0.2 ml，加入到空白基質(zhì)中，按樣品同法處理，最終定容至50 ml，各水平平行測定6次，回收率結(jié)果分析如表3所示。

表3 加樣回收率試驗（n＝6）

由表3可見，回收率范圍在80.98%～113.97%內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.0%～4.8%。表明采用本法測定2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非含量的回收率較高，使用本法檢測結(jié)果可靠。

3.3.3 精密度試驗 以標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液（濃度為：2.0 ng/ml、4.0 ng/ml、20.0 ng/ml） 連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣 6 次。同一樣品三個水平平行測定6次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 分別為 1.5%、2.3%、2.0%，表明采用本方法測定2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非含量的精密度較高，使用該方法所得檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性高。

3.4 樣品測定 采用本法對40種宣稱有抗疲勞功效的市售樣品進(jìn)行測定，每樣品平行測定3次，取平均值。樣品類型涉及酒、袋泡茶、牡蠣蛋白粉、保健顆粒片劑、咖啡、糖果等。其中3批次顆粒片劑、2批牡蠣蛋白粉和1批次糖果檢出2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非，占所有樣品的比例為15%。其中，某顆粒片劑的含量高達(dá)每片70 mg，而他達(dá)拉非的推薦劑量僅為10 mg。本次檢測結(jié)果顯示，國內(nèi)市場存在食品中非法添加2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非的違法行為，且手段多樣，用量巨大。因此，有必要加強(qiáng)對此類產(chǎn)品的檢查力度，以保障人民飲食用藥安全。

4 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜測定牡蠣蛋白粉等食品、保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非的檢測方法。以甲醇超聲提取提高了提取率，選擇耐高壓的高強(qiáng)度HSST3柱提高了分離效率，選擇0.1%乙腈－0.1%甲酸作為流動相，縮短了出峰時間，也減少了基質(zhì)干擾。利用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液來補(bǔ)償和消除色譜分析中存在的基質(zhì)效應(yīng)，選擇MRM模式增強(qiáng)了離子選擇性、抗干擾能力和專屬性。本方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，所得檢測結(jié)果滿意。由于尚未有關(guān)于2－羥基丙基去甲他達(dá)拉非藥理毒理活性數(shù)據(jù)的報道，無法預(yù)測其對人體健康的危害性。不法生產(chǎn)者將其添加到保健食品中，使消費(fèi)者面臨巨大的風(fēng)險。為依法治國，建立健全我國食品、保健食品檢驗標(biāo)準(zhǔn)，迫切需要建立該類新型壯陽類非食用化學(xué)物質(zhì)的準(zhǔn)確檢驗方法，為食品安全監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。