Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討重骨顆粒治療肝腎虧虛型膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

程麗麗 尚雙雙 戈揚(yáng) 湯忠富 徐昌萍 李明 黃傳兵*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥 230012

2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,安徽 合肥 230031

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是易發(fā)生在中老年人群體中的常見關(guān)節(jié)疾病,主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退行性改變,繼發(fā)關(guān)節(jié)邊緣骨贅及滑膜慢性炎癥[1]。臨床上以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、畸形和活動(dòng)受限為主癥,極大地影響了患者生活質(zhì)量。目前臨床上KOA治療多使用非甾體類抗炎藥,糖皮質(zhì)激素和軟骨保護(hù)劑,嚴(yán)重時(shí)采用手術(shù)方法,臨床療效并不持久,此外因無法根本解決這一問題,病情發(fā)展也不易控制。研究表明,Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)傳導(dǎo)通過直接作用于軟骨和滑膜組織而在骨與關(guān)節(jié)病理中發(fā)揮調(diào)控KOA的作用,因此可作為骨關(guān)節(jié)炎治療干預(yù)的靶標(biāo)[2]。謝晚晴等[3]曾對(duì)基于 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的中醫(yī)藥干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)行綜述,眾多臨床研究表明,中藥包括單味中藥提取物、經(jīng)典成方、臨床效方等基于調(diào)節(jié) Wnt經(jīng)典信號(hào)通路改善了OA預(yù)后,并發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin 通路的途徑包括上調(diào) Wnt 蛋白促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖;下調(diào) Wnt 蛋白抑制Wnt/β-catenin 通路,下調(diào)其下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶( MMPs) 和聚蛋白多糖酶( aggrecanases) ,抑制Ⅱ型膠原、蛋白多糖的降解,起到治療 OA 的作用。

KOA屬中醫(yī)“骨痹”范疇,以肝腎虧虛型居多,臨床治療主要以補(bǔ)益肝腎為主[4]。既往研究表明,補(bǔ)益肝腎類中藥復(fù)方(如獨(dú)活寄生湯、少陽膝痹方等)可以多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的對(duì)KOA發(fā)揮明顯的療效[5-6]。本研究主要基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討重骨顆粒治療肝腎虧虛型KOA患者的臨床療效及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1診斷標(biāo)準(zhǔn):西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1995年ACR制定的KOA標(biāo)準(zhǔn)[7];中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(shí)(2015年版)》中醫(yī)辨證肝腎虧虛證[8]。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn):①符合中、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn);②近1個(gè)月內(nèi)未口服非甾體抗炎藥或其他改善病情藥物,未接受物理療法等治療;③簽署知情同意書者。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn):①心腦血管疾病或消化系疾病等;②其他原因的骨關(guān)節(jié)炎或者繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎;③對(duì)鹽酸氨基葡萄糖膠囊及重骨顆粒過敏者;④哺乳期或者育齡期女性;⑤依從性差,不能堅(jiān)持治療者。

1.1.4一般資料:選擇60例于2021年12月至2022年12月期間在安徽省中醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院治療或者門診就診的KOA患者,隨機(jī)分為氨基葡萄糖組與重骨顆粒組各30例。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核(倫理號(hào):2021AH-76)通過。

1.2 方法

1.2.1基礎(chǔ)治療:參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)《骨關(guān)節(jié)炎診療指南(2018版)》[9]中的基礎(chǔ)治療方案對(duì)兩組患者進(jìn)行健康宣教,注意心情的調(diào)攝,飲食起居有節(jié)、避免關(guān)節(jié)負(fù)重;建議運(yùn)動(dòng)治療,適當(dāng)?shù)墓δ苠憻?例如八段錦、五禽戲等;建議行動(dòng)輔助等。

1.2.2藥物治療:氨基葡萄糖組(GLU組)給予鹽酸氨基葡萄糖片(江蘇正大清江制藥有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字號(hào)H20060647,規(guī)格0.75 g)口服,每次1片,每日2次。重骨顆粒組(CGG組)予以口服重骨顆粒方(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供,由杜仲10 g、骨碎補(bǔ)9 g、桑寄生10 g、牛膝10 g、海螵蛸10 g、千年健10 g、鹿銜草10 g組成),每日1付,兩次分服,溫開水送服,飯后服用。治療8周。

1.2.3臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[10]制定療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。顯效:膝關(guān)節(jié)基本處于活動(dòng)狀態(tài),無疼痛感及僵硬感;有效:膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度顯著改善,輕度疼痛感及僵硬感;無效:膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度限制,疼痛明顯,嚴(yán)重影響生活。

1.2.4中醫(yī)癥狀積分標(biāo)準(zhǔn):治療前后參照《膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(shí)(2015年版)》制定的中醫(yī)癥候評(píng)分細(xì)則對(duì)患者的中醫(yī)證候進(jìn)行評(píng)分,中醫(yī)證候評(píng)分:主癥:膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬;次癥:腰膝酸軟、行動(dòng)不利、全身無力、頭暈耳鳴、失眠多夢(mèng);舌脈:舌淡紅或黯、苔薄白或少苔、脈細(xì)無力。依據(jù)患者各癥狀表現(xiàn)評(píng)級(jí)為無、輕、中、重各等級(jí),并記錄為 0、1、2、3 分,舌苔脈象不予以評(píng)分。統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)得分之和。

1.2.5視覺模擬量表(visualanalogue scale,VAS)評(píng)分:患者將自己自身感受到的疼痛強(qiáng)度在10 cm長的標(biāo)尺上相適宜的點(diǎn)標(biāo)明,分值大小與疼痛程度呈正相關(guān)。

1.2.6西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Western Ontario and McMaster Universities Arthritis Index,WOMAC)量表評(píng)分[11]:WOMAC 量表分為3個(gè)部分,分別為疼痛、僵直、關(guān)節(jié)功能,共計(jì)24個(gè)條目,每個(gè)條目最高分為10分,0分至10分指標(biāo)評(píng)分與嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。治療前后記錄患者的WOMAC評(píng)分總和。

1.2.7Lysholm評(píng)分:用Lysholm量表來評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)的功能[12]。這個(gè)量表包括8個(gè)部分,其中痛苦、不安定度部分最高均為25;閉鎖感最高分15分;腫脹度最高10分;跛行最多5分;樓梯攀爬最高10分,蹲姿最高5分;采用支撐物的分值上限為5分,總計(jì)100,得分越高表示膝關(guān)節(jié)功能就越好。

1.2.8檢測(cè)指標(biāo):治療前和治療后收集兩組空腹靜脈血,采用魏氏法測(cè)定ESR、全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定hs-CRP,ELISA法測(cè)定IL-6和IL-1β的水平,RT-PCR法測(cè)定Wnt1、β-catenin和GSK3β mRNA的表達(dá)量。

1.2.9安全性觀察:分別于第1周、第2周、第4周、第8周對(duì)患者進(jìn)行電話通知、門診隨訪觀察,監(jiān)測(cè)血常規(guī),尿常規(guī)以及肝腎功能,同時(shí)密切注意治療期間患者可能發(fā)生的各種不良反應(yīng),若有異常情況發(fā)生,則及時(shí)進(jìn)行記錄和對(duì)癥治療。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組受試患者基線結(jié)果

本研究共納入男 21例,女 39例,60名受試者均完成試驗(yàn),兩組患者的性別、年齡等基本信息差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,組間具有可比性(P>0.05)。

表1 兩組受試者的基線比較

2.2 臨床療效評(píng)價(jià)比較

兩組患者臨床療效分布比較,CGG組有效率(86.7 %)優(yōu)于GLU組(56.7 %)(P<0.05)。

表2 兩組受試者的臨床療效評(píng)價(jià)比較[n(%)]

2.3 中醫(yī)癥狀積分比較

重骨顆粒組和氨基葡萄糖組在治療前中醫(yī)癥狀積分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),2組治療后中醫(yī)癥狀積分均比治療前明顯降低,重骨顆粒組中醫(yī)證候積分(09.90±2.72)明顯低于氨基葡萄糖組(20.06±2.98)(P<0.05)。

表3 兩組患者的中醫(yī)癥狀積分比較

2.4 VAS評(píng)分比較

兩組患者治療前的VAS評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),經(jīng)過8周治療后兩組VAS評(píng)分均低于治療前(P<0.05)。重骨顆粒組治療后VAS評(píng)分表改善較氨基葡萄糖組稍明顯(P<0.05)。

2.5 WOMAC評(píng)分比較

兩組患者治療前的WOMAC指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),經(jīng)過8周治療后兩組WOMAC疼痛、僵硬、關(guān)節(jié)功能積分均降低(P<0.05)。重骨顆粒組治療后WOMAC評(píng)分均低于氨基葡萄糖組(P<0.01)。

表4 兩組受試者的VAS指數(shù)評(píng)分比較

2.6 Lysholm評(píng)分比較

兩組患者治療前的Lysholm各項(xiàng)評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),經(jīng)過8周治療后,除了氨基葡萄糖組在改善腫脹度方面差異不明顯外,其余兩組在疼痛、不安定度、閉鎖感、跛行、樓梯攀爬、蹲姿、使用支撐物方面均較治療前有所改善(P<0.05),而重骨顆粒組較氨基葡萄糖組而言,在除使用支撐物方面無明顯差異外,其余均較氨基葡萄糖組改善明顯(P<0.05或P<0.01)。

表5 兩組患者的WOMAC指數(shù)評(píng)分比較Table 5 Comparison of WOMAC index scores between the two

表6 兩組患者的Lysholm評(píng)分比較Table 6 Comparison of Lysholm scores between the two

2.7 兩組患者治療前后ESR、hs-CRP、IL-6、IL-1β水平比較

治療前兩組ESR、hs-CRP、 IL-1β、IL-6指標(biāo)對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療后兩組指標(biāo)均較治療前下降(P<0.01),相較于對(duì)照組,重骨顆粒組降低ESR、 hs-CRP、IL-1β、IL-6更為顯著(P<0.05)。

表7 兩組患者ESR、hs-CRP、IL-6、IL-1β比較Table 7 Comparison of ESR, hs-CRP, IL-6 and IL-1β between the two

2.8 兩組患者治療前后Wnt1 、β-catenin、GSK3β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

如下表所示,治療前兩組患者血清中Wnt1、GSK3β、β-catenin mRNA水平相比較具有可比性(P>0.05),治療后兩組患者GSK3β的水平均明顯上升(P<0.01),Wnt1、β-catenin的水平明顯下降(P<0.01);組間對(duì)比后,重骨顆粒組GSK3β的水平上升更顯著(P<0.05),Wnt1、β-catenin水平的下降也更為明顯(P<0.05)。

表8 兩組患者wnt1、GSK3β、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果Table 8 Relative expression levels of wnt1, GSK3β and β-catenin mRNA in two

2.9 安全性比較

在治療期間,兩組患者均未出現(xiàn)肝腎功能異常及其他不良反應(yīng)。

3 討論

KOA是最常見的關(guān)節(jié)炎形式,60歲以上的人中有三分之一受到影響,女性比男性更嚴(yán)重。KOA的患病率正在上升,部分原因是OA危險(xiǎn)因素的患病率增加,包括肥胖、缺乏身體活動(dòng)和關(guān)節(jié)損傷。OA相關(guān)的關(guān)節(jié)疼痛會(huì)導(dǎo)致功能限制、睡眠不佳、疲勞、情緒低落和失去獨(dú)立性[13]。Wnt/β-catenin是Wnt信號(hào)通路中經(jīng)典的一條,可以調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和疾病發(fā)病過程中的增殖、分化、再生、衰老和凋亡等。研究表明規(guī)范的Wnt/β-catenin在KOA發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。典型的Wnt通路通過調(diào)節(jié)β-catenin水平和β-catenin亞細(xì)胞定位觸發(fā)其信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞。β-catenin的水平在Wnt-off條件下幾乎保持平緩。β-catenin通過β-轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白重復(fù)蛋白(β-TrCP)介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)中泛素化降解。這一過程糖原合酶激酶3β(GSK3β)、支架蛋白Axin、大腸腺瘤病息肉病(APC)和酪蛋白激酶1α組成的“破壞復(fù)合物”被激活,共同以磷酸化依賴方式降解。在Wnt-on的情況下,Wnt配體與卷曲(FZD)蛋白和低密度脂蛋白受體(LRP)相關(guān)蛋白5或6相結(jié)合時(shí)會(huì)與上述“破壞復(fù)合物”相互作用,使β-catenin釋放易位至細(xì)胞核。細(xì)胞核內(nèi)β-catenin和TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合啟動(dòng)信號(hào)通路[2]。Wnt/β-catenin通路激活后,下游靶基因表達(dá)會(huì)受到影響,例如 MMP-13、IL-1β等,從而誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨炎癥,軟骨基質(zhì)退變,最終形成骨關(guān)節(jié)炎[15]。Wnt1作為Wnt通路相關(guān)的基因被證實(shí)是在OA中表達(dá)上調(diào)[16],Wnt1則會(huì)激活Wnt/β-catenin通路,使得GSK-3β表達(dá)下降,β-catenin的表達(dá)增加,進(jìn)而誘導(dǎo)KOA的發(fā)生發(fā)展。

重骨顆粒是導(dǎo)師黃傳兵主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn),以培補(bǔ)肝腎為基本治則,針對(duì)肝腎虧虛型KOA患者創(chuàng)立的基本方,以杜仲、骨碎補(bǔ)為君藥,主補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效,臣藥輔以牛膝、桑寄生合用既可補(bǔ)充補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨之功,牛膝又能引藥下行,疏導(dǎo)藥性直達(dá)病所,佐以千年健、鹿銜草祛風(fēng)濕、止痹痛。補(bǔ)益肝腎則肝氣條達(dá),濡養(yǎng)氣血?jiǎng)t氣血通暢,強(qiáng)筋健骨則筋骨疏利。研究發(fā)現(xiàn)該方藥中杜仲、骨碎補(bǔ)、牛膝等均具有改善骨代謝的作用,且機(jī)制均與Wnt /β-catenin通路有關(guān)。例如張玉苗等[17]網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示杜仲主要調(diào)節(jié) Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。李琰等[18]發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)水煎液可以提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度,起到抗骨質(zhì)疏松的作用,其機(jī)制與激活 Wnt/β-catenin 經(jīng)典信號(hào)通路有關(guān)。楊豪等[19]發(fā)現(xiàn)牛膝多糖改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨代謝,其機(jī)制也與激活Wnt /β-catenin通路有關(guān)。

為了進(jìn)一步觀察重骨顆粒的臨床療效,評(píng)估方案選取了WOMAC評(píng)分、VAS評(píng)分、Lysholm評(píng)分等評(píng)價(jià)指標(biāo)。這些量表是目前臨床認(rèn)可度比較高的膝關(guān)節(jié)功能評(píng)價(jià)量表,雖然各種評(píng)分方法側(cè)重點(diǎn)不同,但均能客觀全面地反映患者的主觀狀態(tài),可靠性和靈敏度較高[20]。中醫(yī)評(píng)分系統(tǒng)選用了《骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(shí)(2015年版)》制定的中醫(yī)癥狀評(píng)分,該評(píng)分系統(tǒng)較新,能夠全面客觀地反映膝關(guān)節(jié)診治的中醫(yī)療效。另外為了初步探索重骨顆粒的療效及基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用機(jī)制,測(cè)量了兩組患者治療前后人體外周血中的Wnt1、GSK3β、β-catenin的mRNA表達(dá)量、炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6表達(dá)量以及炎癥指標(biāo)ESR、hs-CRP的水平。RNA在不同組織中是有差異的,不同組織具有不同的功能,自然會(huì)表達(dá)不同的mRNA。所以血液中RNA和組織中的RNA表達(dá)是有區(qū)別的。但考慮到倫理道德層面,患者軟骨組織較難獲取,因此選擇檢測(cè)患者血液中的基因相對(duì)表達(dá)量。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過8周治療后,與氨基葡糖組對(duì)比,重骨顆粒組中醫(yī)證候積分明顯降低、臨床有效率明顯提高,提示重骨顆粒能改善如腰膝酸軟,耳鳴等肝腎虧虛。此外,兩組對(duì)比,重骨顆粒組在WOMAC疼痛,僵硬,關(guān)節(jié)功能積分等比較病情一般活動(dòng)狀態(tài)指標(biāo)優(yōu)于氨基葡萄糖組,VAS指標(biāo)改善程度也高于氨基葡萄糖組(P<0.05),Lysholm評(píng)分組間對(duì)比還發(fā)現(xiàn)除了支撐物的使用方面以外,重骨顆粒組評(píng)分的改善程度均好于氨基葡萄糖組(P<0.05或P<0.01),并且在降低ESR、hs-CRP水平較為顯著(P<0.05),可證明重骨顆粒能夠更加有效地降低疾病活動(dòng)度和改善臨床癥狀。除此之外,重骨顆粒組GSK3β的水平上升,Wnt1、β-catenin水平的下降也更為明顯(P<0.05或P<0.01),IL-1β、IL-6的表達(dá)下降程度顯著,說明重骨顆粒可能抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路,降低了炎癥因子的表達(dá),因此可以認(rèn)為重骨顆?？捎行б种蒲装Y因子的釋放,從而減輕KOA的癥狀,抑制KOA的進(jìn)展。因此我們認(rèn)為基于培補(bǔ)肝腎法治療原則創(chuàng)立的重骨顆粒臨床治療肝腎虧虛型KOA療效確切,其作用機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān),值得深入探討。