藤椒及其干燥品的急性毒性和胃腸動力學比較研究

林夢嫻，饒朝龍

(1.成都中醫(yī)藥大學 藥學院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院藥食同用中藥效用與安全研究中心，四川 成都 611137；3.西南特色中藥資源國家重點實驗室(籌)，四川 成都 611137)

藤椒又名竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)，為蕓香科花椒屬植物[1]，性溫，微苦[2]，始載于《本草圖經(jīng)》，有小毒，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中名為“蜀菽”“蜀椒”,被歸為下品，主邪氣咳逆，溫中，寒濕痹痛，下氣。目前國內(nèi)外的研究者已經(jīng)從藤椒中分離鑒定出60多種化學成分，主要含酰胺、黃酮、生物堿、甾體、三萜和木脂素等成分[3-4]，初步研究發(fā)現(xiàn)藤椒具有抑菌消炎[5]、保肝[6]、降血脂血糖[7-9]、抗癌[10]、增強免疫與抑制血小板聚集[11]等藥理作用。藤椒是傳統(tǒng)藥食兩用資源，含有豐富的活性物質(zhì)，具有多種生理功能，是集食用、藥用和生態(tài)價值于一體的經(jīng)濟作物。

藤椒現(xiàn)已被廣泛應用在日常生活中，涉及藥用、食用以及生活日化等多個方面。在藥用方面，藤椒可用于治療發(fā)熱、感冒、咳嗽、消化不良、牙疼和一些慢性疾病。在食用方面，藤椒因具有豐富的香味和麻味被作為日常香辛料在川渝地區(qū)廣泛應用，用于輔助菜肴增味和提鮮[12]，是傳統(tǒng)香料之一，也有地區(qū)將新鮮藤椒作為泡菜食用。同時，基于藤椒廣泛的生物活性和豐富的資源，其應用領(lǐng)域已逐漸從食品和藥品拓展出來，目前市面上已有如藤椒抑菌皂、藤椒滅蚊液等日化產(chǎn)品。

藤椒的運用已經(jīng)越來越廣泛，但迄今為止，藤椒的安全性或毒性尚未見有明確的研究，其食用和藥用安全性無法評價，在合理、安全的使用藤椒時缺少理論依據(jù)。因此，本研究通過小鼠經(jīng)口急性毒性試驗評價，明確藤椒的具體毒性表現(xiàn)與中毒劑量范圍，并與其干燥品進行毒性對比，初步明確藤椒干燥前后毒性的變化，為合理、安全應用藤椒提供參考。同時，本課題組首次針對藤椒對胃腸動力的作用進行研究，為藤椒在胃腸道方面的使用提供依據(jù)。

1 實驗材料與設備

1.1 藥物制備

鮮藤椒購買自四川省眉山市洪雅縣，一部分鮮品冷藏，一部分自然晾曬24 h，然后裝篩放入烘箱，烘烤溫度60℃，烘烤至藤椒含水量小于10%時取出，去除雜質(zhì)后得到干藤椒，儲存于干燥陰涼處。

分別稱取鮮藤椒、干藤椒，按料液比1∶10加入蒸餾水，浸泡0.5 h后用水蒸氣蒸餾裝置提取5 h得到水提液，水提液經(jīng)真空抽濾后濃縮至浸膏狀，將所得浸膏稱重后分裝保存于-20℃冰箱備用。

1.2 動物

SPF級ICR小鼠190只，體質(zhì)量(20±2)g，6周齡，雌雄各半。購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(川)2015-030。小鼠被安置在標準環(huán)境下(溫度為25℃，濕度為50%，光照/黑暗周期為12 h)，給予標準動物飼料，自由攝食和飲水。

1.3 試劑

3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑(北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號：R10140)、嗎丁啉(西安楊森制藥有限公司，批號：190328099)、ALT、AST、UREA、CREA、TG檢測試劑盒(深圳雷杜生命科學股份有限公司，貨號：S03030、S03040、S03036、S03076、S03027)、GLU檢測試劑盒(長春匯力生物技術(shù)有限公司，貨號：C050)。

半固體營養(yǎng)糊制備：取10 g羧甲基纖維素鈉，溶于250 mL蒸餾水中，分別加入16 g奶粉、8 g糖、8 g淀粉和2 g活性炭末，攪拌均勻，配制成300 mL約300 g的黑色半固體糊狀物。

1.4 主要儀器

全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司，Chemray 800)；全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BC-2800vet)

2 實驗方法

2.1 急性毒性試驗

根據(jù)前期預實驗得知，將藤椒浸膏配制成最大濃度以最大給藥體積灌胃小鼠，鮮藤椒、干藤椒水提液均可引起動物死亡，且鮮藤椒灌胃小鼠的0%致死量(Dn)和100%致死量(Dm)分別為2.00 g/kg、6.00 g/kg，干藤椒灌胃小鼠的0%致死量(Dn)和100%致死量(Dm)分別為3.53 g/kg、7.00 g/kg，故進行改良Bliss法LD50實驗。小鼠110只，適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分為11組，給藥前12 h禁食。給藥當天使用2% Tween-80溶液配制藥液，鮮藤椒組根據(jù)Dn、Dm計算組間劑量比(r=0.76),繼而得到各組給藥劑量(1～5組依次為生藥量2.00 g/kg、2.60 g/kg、3.40 g/kg、4.50 g/kg、6.00 g/kg)，干藤椒組間劑量比(r=0.84)，各組給藥劑量(1～5組依次為生藥量3.53 g/kg、4.20 g/kg、5.00 g/kg、5.96 g/kg、7.10 g/kg)，對照組給予等體積的2% Tween-80溶液。試驗當天對小鼠進行多次觀察，此后每日觀察并記錄小鼠的存活情況、體質(zhì)量、飲食和運動，連續(xù)觀察14 d后小鼠禁食12 h，摘眼球取血后處死，部分血液加入抗凝劑，用于血常規(guī)檢驗；剩余血液4℃低溫離心得到血清，用于測定血生化。處死后，分離肝、心、脾、肺、腎并稱重，將各臟器的重量與其體重相比得到各臟器系數(shù)。

2.2 藤椒對小鼠胃腸動力的影響試驗

80只小鼠隨機分為對照組，陽性藥組(嗎丁啉3.90 mg/kg)、鮮藤椒干藤椒高中低劑量組(1.48 g/kg、0.74 g/kg、0.37 g/kg)，每組10只。各組按照0.1 mL/10 g體質(zhì)量灌胃給藥，第6 d給藥后禁食不禁水24 h。

于第7天再給受試物1次，給藥半小時后，每只小鼠灌胃0.8 mL營養(yǎng)糊。20 min 后，處死并打開腹腔，去除與整個胃部和腸道相連的系膜，結(jié)扎胃賁門和幽門后從兩端剪斷，拭干后稱量，剪開胃體，用提前預冷的生理鹽水洗去胃內(nèi)容物，拭干后再次稱量，兩次結(jié)果之差和所灌糊重的百分比為胃內(nèi)殘留率；剪取胃幽門至回盲部的腸管，直鋪于白瓷盤上，從幽門至黑色腸管前端的長度與腸管全長的百分比即為小腸推進率。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 實驗結(jié)果

3.1 急性毒性試驗

3.1.1 半數(shù)致死量(LD50)測定

鮮藤椒水提液灌胃小鼠的LD50為3.70 g/kg，95%置信區(qū)間為3.20～4.40 g/kg。干藤椒水提液灌胃小鼠的LD50為5.03 g/kg，95%置信區(qū)間為4.76～6.00 g/kg，詳見表1。

表1 全水提液灌胃小鼠的LD50檢測結(jié)果

3.1.2 一般狀況

觀察給藥后小鼠的毒性反應，各劑量組小鼠均不同程度地出現(xiàn)活躍增加、呼吸頻率加快，深度變淺、四肢顫動等癥狀，大劑量給藥時，動物死亡出現(xiàn)在3～10 min之間，小劑量給藥時死亡時間稍有延長，但均在30 min內(nèi)死亡，死前均有抽搐、驚厥，甚至竄跳等反應。對死亡動物立即剖檢見胃內(nèi)大量殘留藥液，其余臟器均未見異常。存活動物于2 h后行動遲緩、伏地不能站立、少動并長時間僵住、精神萎靡、反應遲鈍，4 h后毒性反應逐漸減輕，活動增加，開始攝食，12 h內(nèi)基本恢復正常。14 d觀察期內(nèi)給藥組小鼠精神狀態(tài)、運動情況與對照組小鼠無明顯差異，整體生存狀態(tài)良好，正常飲食(P>0.05)，見圖1、圖2。對比對照組與藤椒各劑量組小鼠體質(zhì)量，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，保持逐漸升高的正常狀態(tài)，見圖 3。

3.1.3 臟器系數(shù)

解剖后通過肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，藤椒各劑量組小鼠臟器組織形態(tài)無腫大、出血、粘連等異常變化，與對照組相比無明顯器質(zhì)性病變。通過臟器系數(shù)計算，發(fā)現(xiàn)藤椒各給藥組肝臟、脾臟、胸腺的臟器系數(shù)與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；干藤椒3.53 g/kg、5 g/kg劑量組，鮮藤椒2 g/kg、2.6 g/kg劑量組心臟系數(shù)顯著升高(P<0.01)；鮮藤椒2 g/kg、3.4 g/kg劑量組肺臟系數(shù)顯著升高(P<0.01)；相比對照組，各藤椒給藥組腎臟系數(shù)均明顯增加(P<0.01)，見表2。

3.1.4 血常規(guī)與血生化

各劑量組小鼠全血中各指標與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；血清中各生化指標水平無明顯差異(P>0.05)，見表3、表4。

圖 1 各組小鼠平均攝食量

圖2 各組小鼠平均飲水量

圖3 各組小鼠體質(zhì)量變化

3.2 胃腸動力實驗結(jié)果

3.2.1 藤椒對小鼠胃排空功能的影響

如表5所示，與正常對照組小鼠比較，鮮藤椒組中胃殘留率下降只發(fā)生在低劑量組(P<0.05)，減少了8.72%，干藤椒高、中、低劑量組小鼠的胃殘留率均明顯減少(P<0.05)，依次減少了8.86%、7.86%、13.45%，說明各劑量的干藤椒均能促進胃排空，其中低劑量改善小鼠胃排空功能的效果更好，比嗎丁啉效果更明顯。同為低劑量條件下，干藤椒的效果較鮮藤椒明顯。

3.2.2 藤椒對小鼠小腸推進功能的影響

如表6所示，藤椒兩個低劑量組小鼠的小腸推進率與正常組相比均上升明顯(P< 0.01)，依次升高了13.99%、15.56%。干藤椒中劑量組也提高了11.79%(P<0.05)，鮮藤椒中劑量組無明顯差異。干藤椒與鮮藤椒均能明顯促進小鼠的腸推進，兩者均表現(xiàn)出低劑量促進小鼠小腸蠕動的效果更明顯，比陽性藥作用效果強。

表2 各組小鼠臟器系數(shù)比較

表3 各組小鼠血常規(guī)比較

表4 各組小鼠血生化比較

表5 藤椒對小鼠胃排空功能的影響

表6 藤椒對小鼠小腸推進功能的影響

4 討論

通過實驗結(jié)果可以看出，LD50的結(jié)果表明藤椒的急性毒性明顯，鮮藤椒的毒性大于干藤椒，經(jīng)過干燥后，可以明顯降低藤椒的毒性，提高安全性，可能是因為干燥過程中會損失藤椒的揮發(fā)油、枝葉和藤椒籽，減少的部分均具有一定的毒性。目前也有研究證實藤椒揮發(fā)油有顯著的驅(qū)蟲活性[13]，枝葉提取物對人宮頸癌細胞[14]、人乳腺癌細胞和結(jié)直腸癌細胞有細胞毒性[15]，可以印證干燥后毒性會降低的實驗結(jié)果。藤椒揮發(fā)油中含有萜類、酚類、酯類、醇類、黃酮及類黃酮類成分[16-17]，藤椒枝葉中也富含酚苷、木脂素等活性物質(zhì)[18-20]，兩者在干燥過程中被損失后改變了藤椒的化學物質(zhì)組成，從而影響藤椒的毒性，后續(xù)可以對其化學成分進行研究。相較于鮮藤椒，藤椒干燥品的安全性更高，在藤椒產(chǎn)品開發(fā)時，可以通過去籽、干燥等處理方式，達到對藤椒減毒、控毒的目的。從毒性表現(xiàn)來看，主要集中在呼吸、感官、神經(jīng)肌肉方面，藤椒給藥后刺激小鼠呼吸中樞使小鼠呼吸淺快，刺激小鼠軀體運動使其活動先增加后減少，麻痹小鼠感官使其僵住不動且反應遲鈍，小鼠四肢震顫、抽搐甚至竄跳是由于刺激神經(jīng)肌肉導致，藤椒所致毒性反應時間短而強烈，造成小鼠迅速死亡。仍存活的小鼠精神情況、運動和體態(tài)良好，飲食、體質(zhì)量與對正常小鼠比較也無明顯差異。作為反映藥物毒性的重要指標[21]，臟器系數(shù)與空白組比較，藤椒各給藥組肝、脾、胸腺三個器官的系數(shù)無明顯差異，心臟系數(shù)在干藤椒3.53 g/kg、5 g/kg劑量組，鮮藤椒2 g/kg、2.6 g/kg劑量組有明顯升高，鮮藤椒2 g/kg、3.4 g/kg劑量組肺臟系數(shù)增加，所有藤椒給藥組腎臟系數(shù)均明顯升高，提示藤椒有潛在的心臟、肺臟和腎臟毒性，但藤椒給藥后小鼠血常規(guī)與血生化各項指標卻無明顯變化。未改變的原因可能是由于毒性損傷處于早期，暫時沒有引起血液中指標的變化，同時，血液指標易受機體內(nèi)環(huán)境等多因素的影響。但由于解剖觀察時未出現(xiàn)肉眼可見的明顯病變，此次試驗未對臟器進行組織病理學檢查，無法觀察具體組織損傷情況。

藤椒有芳香健胃、消食通氣的功效，在民間常被用來治療胃氣不通，食欲不振[22]，但目前尚未有文獻明確指出藤椒對胃腸功能的作用，本次試驗采用接近小鼠糧食組成的半固體營養(yǎng)糊對小鼠腸推進和胃排空情況進行了研究，更能真實地反映小鼠胃腸運動變化[23]。結(jié)果表示，藤椒可以明顯促進小鼠的胃排空與腸推進。藤椒提取物在低劑量時對小鼠胃腸動力表現(xiàn)出更明顯的促進作用，可能是連續(xù)給藥后，劑量累積后較大，毒性蓄積，劑量越高，毒性越強，提示藤椒可能存在蓄積毒性并對胃腸道功能的調(diào)節(jié)作用可能存在毒效關(guān)系，尚待進一步證實，可以通過梯度稀釋給藥劑量并觀察作用效果來驗證。在同一低劑量給藥時，藤椒干燥品的促進效果要明顯強于鮮藤椒，證明藤椒通過干燥后可以達到減毒增效的目的，這可能也是與干燥后藤椒成分發(fā)生變化有關(guān)。

綜上，通過對藤椒的毒性研究，首次明確了藤椒的LD50，并與干燥品相對比，明確兩者毒性大小，確定其干燥的加工工藝對毒效的影響，為指導藤椒產(chǎn)品的加工利用提供理論依據(jù)，對藤椒產(chǎn)品的開發(fā)利用有現(xiàn)實性的指導意義。同時，首次針對藤椒對胃腸道動力的影響進行研究，發(fā)現(xiàn)藤椒對胃腸動力具有明顯的促進作用，為藤椒在調(diào)節(jié)胃腸功能方面的應用提供了數(shù)據(jù)支持，發(fā)掘出藤椒的潛在價值，對藤椒資源的全方面應用具有重要意義。