• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高效液相色譜法同時定量分析紫蘇不同部位的植物代謝物

    2023-03-07 11:44:22張紅玉王丹吳春劍侯天宇趙亞娜張志軍雷娜娜李河
    現(xiàn)代食品科技 2023年2期
    關(guān)鍵詞:紫蘇葉紫蘇芹菜

    張紅玉,王丹,吳春劍,侯天宇,趙亞娜,張志軍,雷娜娜,李河*

    (1.中北大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,山西太原 030051)(2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641) (3.香港中文大學(xué)化學(xué)院,中國香港 999077)

    紫蘇(Perilla frutescensL.)是一種唇形科草本植物,是國家衛(wèi)生部首批頒布的藥食同源的60種中藥之一[1]。在東南亞地區(qū)分布廣泛,尤其在中國、日本、韓國種植歷史更加悠久[2]。我國早有利用新鮮紫蘇葉處理以避免食用蝦蟹中毒的傳統(tǒng),日本將紫蘇當(dāng)做代表性的風(fēng)味食品,韓國利用紫蘇制作泡菜和烤肉包 裝[3],因此,紫蘇在食品工業(yè)上應(yīng)用廣泛。

    紫蘇代謝物在其生長和自我防御機(jī)制中形成,主要包括黃酮類、脂肪酸類、酚酸類[4]、植物甾醇類及精油[5,6],具有多種生理功能[3]。研究表明,紫蘇提取物有極強(qiáng)的抗氧化性[7-9]。紫蘇油可改善糖尿病性小鼠的高甘油三酸酯血癥和腸道營養(yǎng)不良[10]、淀粉樣蛋白β誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙[11]和炎癥反應(yīng)[12];紫蘇葉提取物對脂肪細(xì)胞分化和高脂飲食小鼠有抗肥胖作用[13],也有降血糖活性[14];紫蘇醛可調(diào)節(jié)大鼠的α-抑制蛋白減輕其抑郁行為[15];紫蘇籽多糖可抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長[16]。

    研究表明迷迭香酸是紫蘇葉中含量最高的化合 物[3]。薛姣[17]分離純化了紫蘇迷迭香酸,并研究了它的抗氧化和抗菌性能;楊馥菡等[18]利用高速逆流色譜分離純化了紫蘇葉中的迷迭香酸和咖啡酸。何彥康[19]利用高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)以及核磁共振光譜(NMR)確認(rèn)了紫蘇中花色苷和主要黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu);Assefa等[9]利用超高效液相色譜-電噴霧電子-飛行時間-質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-ESI-TOF-MS)定性分析了73種紫蘇樣品中酚類化合物。Yan等[7]提取測定了冷榨紫蘇子粉中的總多酚含量,并評估了其中的抗氧化性能;上述對紫蘇代謝物的研究多基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),且以定性為主。在對紫蘇代謝物定量分析的研究中,史月姣等[20]和艾鑫衛(wèi)等[21]利用LC-MS分別測定了紫蘇水煎液和各生長期紫蘇中的酚類物質(zhì)含量;代沙等[22]利用HPLC測定了不同品系紫蘇中的8種酚類物質(zhì);落艷嬌等[23]測定了不同栽培年份和采收期紫蘇葉中的2種酚酸和6種黃酮的成分含量。此外,5-羥甲基糠醛(HMF)和糠醛等呋喃環(huán)衍生物也被報道為植物代謝物,在中藥中廣泛存在[24,25],然而在紫蘇中的分布尚未見報道。

    綜上所述,目前對紫蘇代謝物的研究主要集中在迷迭香酸、咖啡酸和部分黃酮上,原料以紫蘇葉為主。鮮有報道紫蘇桿、殼、葉中代謝物同時定量分析方法的研究。與HPLC-MS相比,HPLC價格相對便宜,在各高校實驗室及公司研發(fā)質(zhì)檢部門普遍配備,因此,本實驗以山西不同品種的紫蘇為研究對象,利用HPLC法系統(tǒng)分析紫蘇不同部位的19種代謝物的含量和分布,以期為紫蘇代謝物的定量分析及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    紫蘇葉、紫蘇桿、紫蘇殼(山西省晉中市)均來源于本課題組實驗田種植所得,品種分別為1#、3#、4#、27#、28#、混1#、晉紫蘇2#、晉紫蘇3#、白蘇、雙面紫。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純,均購自上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司。無水乙醇、沒食子酸(GA)、迷迭香酸(RosA)、蘆丁(RT)購自北京索萊寶科技有限公司。5-羥甲基糠醛(HMF)、糠醛(F)、原兒茶酸(PCA)、對羥基苯甲酸(ρ-HBA)、兒茶素(C)、咖啡酸(CA)、對香豆酸(ρ-CA)、野黃芩苷(SG)、阿魏酸(FA)、楊梅素(MC)、白藜蘆醇(RVT)、木犀草素(LTL)、槲皮素(QC)、芹菜素(AGN)、山奈酚(KMF)均購自上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司,芹菜素-7-O-葡萄糖苷(AG)購自上海紫霞生物科技有限公司。19種植物代謝物的詳細(xì)信息見表1。

    表1 19種植物代謝物的詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of 19 plant metabolites

    1.2 儀器與設(shè)備

    Ultimate 3000高效液相色譜儀,美國熱電公司;超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀,Aanquish超高效液相系統(tǒng),TSQ Altis三重四極桿質(zhì)譜,美國熱電公司;SB25-12DTD超聲波清洗器,寧波新芝生物科技股份有限公司;CTL550低速離心機(jī),湖南湘立儀器有限公司;XW-80A渦旋混合器,上海馳唐電子有限公司;ZYCGF-III-20T超純水制備系統(tǒng),四川卓越水處理設(shè)備有限公司;BCD-576WDPU冰箱,海爾公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

    準(zhǔn)確稱取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、糠醛、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、兒茶素、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、迷迭香酸、楊梅素、白藜蘆醇、木犀草素、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg,分別用甲醇溶解并定容到10 mL容量瓶中,得到每種標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。利用含0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈:水=1:1,V/V)對貯備液進(jìn)行梯度稀釋,得到一系列不同濃度梯度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,同時稀釋各標(biāo)準(zhǔn)貯備液,得到單獨標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

    1.3.2 色譜分析條件

    采用高效液相色譜法對19種物質(zhì)進(jìn)行測定,其中單獨標(biāo)準(zhǔn)品用于定性分析,混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析,色譜條件如下:(1)色譜柱:Atlantic C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm);(2)柱溫,25 ℃;(3)流動相:A,0.1%甲酸乙腈、B,0.1%甲酸水;(4)洗脫程序:0~15 min,95%~90% B;15~30 min,90%~70% B;30~50 min,70%~60% B;50~51 min,60%~0% B;51~54 min,0% B;54~55 min,0~95% B;55~65 min,95% B。(5)進(jìn)樣量,20 μL;(6)流速,1.0 mL/min;(7)檢測波長見表1。

    1.4 未知物定性分析

    經(jīng)甲醇水溶液提取之后,樣品色譜圖中有2個色譜峰i和ii(圖2b、2c、2d)與19種標(biāo)品化合物的保留時間均對應(yīng)不上,但其含量相對較高,為了進(jìn)一步對這兩種化合物進(jìn)行定性分析,利用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-TOF-MS)對其質(zhì)譜碎片離子進(jìn)行確定,色譜條件同1.3.2,進(jìn)入質(zhì)譜時通過分流將流速設(shè)為0.3 mL/min,質(zhì)譜條件如下:電噴霧電子(ESI)電離,負(fù)離子模式,全掃描,掃描范圍:100~1 000m/z,離子傳輸管溫度:300 ℃,霧化室溫度:350 ℃,載氣40 arb;輔助氣:10 arb。

    1.5 樣品前處理

    分別對不同品種紫蘇葉、桿及殼取樣,經(jīng)自然風(fēng)干后攪碎,然后過60目篩,得到各部位的粉末狀樣品,取樣部位及樣品見圖1。準(zhǔn)確稱取0.50 g粉末樣品至50 mL塑料離心管中,加入10 mL酸化甲醇水溶液(甲醇:水=60:40,0.1%甲酸),渦旋振蕩1 min,超聲萃取20 min后,5 000 r/min離心15 min,收集上清液。殘渣繼續(xù)用10 mL上述甲醇水溶液繼續(xù)萃取1次,重復(fù)超聲和離心步驟,收集上清液,過0.22 μm濾膜后,待HPLC分析。對于紫蘇葉樣品中的迷迭香酸,因其含量較高(出現(xiàn)平頭峰,圖2b),進(jìn)樣前需進(jìn)行10倍稀釋。

    圖1 紫蘇取樣部位圖Fig.1 Sampling sites of Perilla

    1.6 方法學(xué)考察

    1.6.1 檢出限與定量限

    紫蘇桿樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后得到信噪比(S/N)為3時對應(yīng)的濃度為樣品的檢出限(LOD),以信噪比為10時對應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。具體方法為:在紫蘇桿樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)過前處理之后,濃度為C,HPLC分析得到信噪比為n,則此時利用以下公式計算得到理論的LOD和LOQ:

    注:

    LOD——樣品的檢出限;

    LOQ——定量限;

    C——紫蘇桿樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)前處理之后的濃度;

    n——信噪比。

    以計算得到的LOD和LOQ為參考,加入濃度越來越低的標(biāo)準(zhǔn)溶液,直到實際測得信噪比為3或10時,對應(yīng)的濃度即為實際的LOD和LOQ(實際值一般比理論值偏高)。

    1.6.2 線性方程與范圍

    利用外標(biāo)法對植物樣品中19種物質(zhì)進(jìn)行定量。分別配置濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.3.2色譜條件下進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo),以峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于各物質(zhì)響應(yīng)有差異,其對應(yīng)的線性范圍見表2。

    1.6.3 回收率和精密度

    精確稱取紫蘇桿樣品0.50 g,加入19種混合標(biāo)準(zhǔn)品適量,使其濃度分別達(dá)到2.0、10.0和50.0 mg/L,每個濃度平行6次,各物質(zhì)的回收率通過以下公式計算:

    式中:

    R——回收率,%;

    m總——各物質(zhì)加標(biāo)和樣品的總含量,mg;

    m樣品——樣品本身各物質(zhì)的含量,mg;

    m加標(biāo)——加入各物質(zhì)的含量,mg。

    回收率6次平行的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)作為方法的精密度。

    1.7 統(tǒng)計分析

    除了回收率平行6次外,其余結(jié)果均為三次檢測均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行整理與初步分析,SPSS 21.0進(jìn)行方差分析,Origin 2018進(jìn)行作圖以及擬合處理。置信區(qū)間為95%,即P<0.05視為數(shù)據(jù)之間有顯著性差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HPLC檢測19種植物代謝物

    采用HPLC對紫蘇不同部位的19種植物代謝物進(jìn)行檢測,在1.3.2的色譜條件下,19種物質(zhì)在55 min實現(xiàn)完全分離,峰型和分離度均較理想。三種紫蘇不同部位的樣品中,19種物質(zhì)種類與含量的分布差異較大。圖2為19種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和典型的紫蘇葉、紫蘇桿、紫蘇殼樣品液相色譜圖。由圖可知,在無需凈化的過程中,樣品中19種化合物的峰型干擾不影響定量積分。

    圖2 19種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品及典型樣品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 19 mixed standard compounds and typical samples

    2.2 未知物的定性分析

    如圖2b、2c、2d所示,利用UPLC-TOF-MS對色譜峰i和ii進(jìn)行定性分析,結(jié)果見圖3。對于化合物i,負(fù)離子模式下,脫氫后質(zhì)荷比為m/z637.151 00,未觀察到可能的碎片離子,根據(jù)質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)對 照[9,19],判斷i化合物為木犀草素-7-O-二葡萄糖苷;對于化合物ii,負(fù)離子模式下,脫氫后質(zhì)荷比為m/z621.121 03,較高的碎片離子為m/z351.167 05,應(yīng)為黃酮骨架上脫去一個葡萄糖苷酸基團(tuán)(177 u)和一個苯酚基團(tuán)(93 u),將其質(zhì)譜信息與已發(fā)表的文獻(xiàn)對比[4,9],可確定化合物ii為芹菜素-7-O-二葡萄糖苷,由于這兩種苷類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品很難商業(yè)購買,本文利用芹菜素-7-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品對它們進(jìn)行定量分析。

    圖3 兩種未知物i和ii的TOF-MS圖Fig.3 TOF-MS spectrum two unknown compounds: i and ii

    2.3 提取溶劑的優(yōu)化

    由于純有機(jī)試劑對待測物的溶解性大于流動相,使用純有機(jī)試劑(如甲醇)對樣品進(jìn)行提取,會導(dǎo)致進(jìn)入色譜柱的待測物在溶劑和流動相之間分配不均,出現(xiàn)部分物質(zhì)色譜峰前置拖尾的現(xiàn)象,從而影響分離度。因此在對提取溶劑選擇時,本文參照文獻(xiàn)及課題組研究經(jīng)驗[23,26],比較了甲醇、乙腈、乙醇水溶液(40%體積水)對19種待測物的提取回收率,結(jié)果見圖4。如圖4所示,三種溶劑對糠醛和楊梅素的回收率均較低,相比之下,甲醇水溶液更為理想。乙醇對對羥基苯甲酸、對香豆酸、迷迭香酸和白藜蘆醇的回收率均超過100%,可能由于乙醇極性較低,提取了較多的雜質(zhì);乙腈對沒食子酸和蘆丁的回收率偏低;綜上所述,本研究最終選擇甲醇水溶液作為提取溶劑。

    圖4 三種溶劑對19種化合物回收率的影響(n=3)Fig.4 Effects of three extract solvents on the recoveries of 19 compounds (n=3)

    2.4 方法學(xué)認(rèn)證

    2.4.1 檢出限、定量限與標(biāo)準(zhǔn)曲線

    根據(jù)1.6方法學(xué)考察,采用峰面積外標(biāo)法定量,以質(zhì)量濃度1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0 mg/L為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,19種化合物的保留時間、檢出限、定量限與標(biāo)準(zhǔn)曲線等信息見 表2。19種物質(zhì)在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)在0.997 6~0.999 9之間,檢出限在0.10~ 0.40 mg/L之間。史月姣等[20]利用LC-MS測定了紫蘇水煎液的部分代謝物,但未報道檢出限;艾鑫衛(wèi)等[21]建立了高靈敏度的HPLC-MS測定紫蘇不同生長期代謝物的方法,但僅能測定5種多酚,且質(zhì)譜價格昂貴,較難普及。代沙等[22]建立了HPLC測定紫蘇中分類的方法,也沒有報道方法的檢出限。雖然與LC-MS相比較,本研究的靈敏度較低,但僅就高效液相色譜而言,本方法具有更廣泛的適用范圍,能滿足紫蘇中代謝物定性和定量分析的要求。

    表2 19種植物代謝物的保留時間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Retention time, linear range and equation, correlation coefficient, limit of detection (LOD) and limit of qualification (LOQ) of 19 plant metabolites

    2.4.2 回收率和精密度

    由表3可知,19種植物代謝物的加標(biāo)回收率在61.65%~111.42%之間,RSD在1.02%~17.20%之間。由于糠醛類物質(zhì)粘度較大,且在紫蘇中含量極少,在加標(biāo)量較少時,其回收率較低。由于本文采用的HPLC法同時測定多種含紫外吸收基團(tuán)的化合物,在提取中無法避免共洗脫的干擾,歐盟委員會規(guī)定,當(dāng)加標(biāo)量較低時,回收率在-50%到+20%之間可以接受[27]。因此,在沒有質(zhì)譜輔助的情況下,該方法在實驗室及工業(yè)檢測同時定量19種化合物時是可行的。

    表3 19種化合物加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precision of 19 compounds (n=6)

    2.5 實際樣品的檢測

    應(yīng)用所建立的方法對10種不同品種紫蘇的葉、殼、桿進(jìn)行定量分析,檢測結(jié)果見表4。通過對結(jié)果分析(圖5),12種樣品中,含量較大的化合物為咖啡酸、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、迷迭香酸和芹菜素,在0.04~24.05 mg/g之間,含量差異跨度較大,不同紫蘇部位的化合物含量分布也不同。結(jié)果顯示,28#紫蘇殼中共檢出11種物質(zhì),含量在0.08~0.57 mg/g之間;21種化合物中,酚酸類如咖啡酸和迷迭香酸;黃酮及黃酮苷類,如木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素在12種樣品中均有檢出,其中迷迭香酸為紫蘇葉中含量最高的物質(zhì),這與前人的研究一致[17,28],其次為野黃芩苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷。胡惠軍等[26]報道了紫蘇葉中咖啡酸、迷迭香酸和野黃芩苷的含量,其含量分別在0.10~0.49、0.29~9.58和0.26~4.38 mg/g之間;落艷嬌等[23]測定了51個紫蘇葉樣品中咖啡酸、迷迭香酸和6種黃酮苷的含量,發(fā)現(xiàn)迷迭香酸含量為為2.13~33.97 mg/g;其次是木犀草素-7-O-二葡萄糖苷,含量為1.31~14.80 mg/g;芹菜素-7-O-二葡萄糖苷含量為2.68~7.60 mg/g;芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量為0.56~1.00 mg/g;咖啡酸含量最少,為0.11~0.68 mg/g。造成含量差異的原因可能與紫蘇品種、生成環(huán)境、水分含量及提取溶劑等有關(guān)。此外,本文中原兒茶酸和對羥基苯甲酸在部分樣品中也有檢出。木犀草素在紫蘇殼和桿中有檢出,含量較少,在0.05~0.18 mg/g之間,但在紫蘇葉中沒有檢出。值得注意的是,本文在紫蘇殼中檢出了HMF和糠醛兩種呋喃環(huán)衍生物。

    表4 12種不同紫蘇品種殼、葉、桿中植物代謝物的含量(n=3)Table 4 Contents of 21 studied compounds in seed shell, leaf and stem of 12 different types ofPerilla (n=3)

    圖5 21種化合物在不同品種紫蘇不同部位的分布圖Fig.5 Distribution of 21 compounds in different parts of different varieties of Perilla

    3 結(jié)論

    本實驗基于高效液相色譜-紫外檢測儀建立了不同品種紫蘇不同部位中19種植物代謝物同時檢測的方法,19種化合物保留時間穩(wěn)定,峰型和分離度良好。方法的檢出限在0.05~0.40 mg/L之間,回收率和精密度分別在61.65%~111.42%和1.02%~17.20%之間。在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用該方法對不同品種分不同部位的紫蘇進(jìn)行了檢測。19種化合物在不同紫蘇部位中的含量差異極大,其中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素等含量較大,在12個樣品中均有檢出,含量在0.05~24.05 mg/g之間。28#紫蘇殼中共檢出11種物質(zhì),含量在0.08~0.57 mg/g之間;紫蘇殼和桿中均有木犀草素檢出,含量在0.05~0.18 mg/g之間;紫蘇葉中化合物含量順序為迷迭香酸>野黃芩苷>芹菜素-7-O-葡萄糖苷。此外,本實驗在紫蘇殼中檢出HMF和糠醛兩種呋喃環(huán)衍生物。

    猜你喜歡
    紫蘇葉紫蘇芹菜
    緩解空調(diào)病你只需一種葉子
    夏天宜與紫蘇常相伴
    芹菜也會“變臉”
    紫蘇葉的營養(yǎng)價值及其產(chǎn)品加工研究進(jìn)展
    歲歲紫蘇
    文苑(2020年4期)2020-05-30 12:35:30
    孕婦可以用紫蘇葉 泡腳嗎?
    亦食亦藥話 芹菜
    芹菜百合
    青青紫蘇
    青青紫蘇
    丰满的人妻完整版| 少妇的逼水好多| 国产人妻一区二区三区在| 少妇被粗大猛烈的视频| 在线观看一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日本与韩国留学比较| 久久精品91蜜桃| 国内精品一区二区在线观看| 免费av观看视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲国产精品国产精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 成人一区二区视频在线观看| 看黄色毛片网站| 欧美+日韩+精品| 内射极品少妇av片p| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av五月六月丁香网| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲真实伦在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美在线一区亚洲| 亚洲精品影视一区二区三区av| 美女内射精品一级片tv| 欧美成人a在线观看| 免费观看的影片在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品永久免费网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产色爽女视频免费观看| 99热这里只有是精品50| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| a级一级毛片免费在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 色综合色国产| 九九在线视频观看精品| 神马国产精品三级电影在线观看| av在线观看视频网站免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久精品影院6| 我要看日韩黄色一级片| 69人妻影院| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产视频一区二区在线看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲自拍偷在线| 婷婷六月久久综合丁香| 99在线人妻在线中文字幕| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美在线一区亚洲| 1024手机看黄色片| 国产视频内射| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99热这里只有是精品50| 在线播放无遮挡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产老妇女一区| 久久久久久九九精品二区国产| 精品久久久久久久久亚洲| 久久中文看片网| 无遮挡黄片免费观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| videossex国产| 精品一区二区三区视频在线| 99热全是精品| 91精品国产九色| 亚洲在线自拍视频| 欧美高清成人免费视频www| 黄色一级大片看看| 国产精品一区二区性色av| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品久久久久久精品电影| 色综合站精品国产| 一区二区三区四区激情视频 | 一本一本综合久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品伦人一区二区| 观看免费一级毛片| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲成人久久性| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99在线人妻在线中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美成人a在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品伦人一区二区| 成人综合一区亚洲| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 成人欧美大片| 亚洲,欧美,日韩| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲精品亚洲一区二区| 一级a爱片免费观看的视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久久久国产a免费观看| 日本a在线网址| 国内精品宾馆在线| 干丝袜人妻中文字幕| 国产高清三级在线| 国产亚洲精品av在线| 国产精品1区2区在线观看.| 22中文网久久字幕| 美女大奶头视频| 亚洲av免费在线观看| 天美传媒精品一区二区| 最近手机中文字幕大全| 99热这里只有是精品在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美激情久久久久久爽电影| 悠悠久久av| avwww免费| 久久久精品欧美日韩精品| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 91精品国产九色| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美+日韩+精品| 亚洲专区国产一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日韩强制内射视频| 久久午夜福利片| 国产视频内射| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 99久久九九国产精品国产免费| 成人毛片a级毛片在线播放| 男女下面进入的视频免费午夜| 变态另类丝袜制服| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产日本99.免费观看| 精品久久久久久久久久久久久| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品亚洲一级av第二区| 色在线成人网| 亚洲熟妇熟女久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产精品久久久久久久久免| 国产精品野战在线观看| av福利片在线观看| 嫩草影视91久久| 久久这里只有精品中国| 99九九线精品视频在线观看视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 一个人看视频在线观看www免费| av在线蜜桃| 久久久成人免费电影| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 久久久久国产网址| 神马国产精品三级电影在线观看| 美女黄网站色视频| 超碰av人人做人人爽久久| 久久久国产成人免费| 特大巨黑吊av在线直播| 国产伦精品一区二区三区四那| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 丰满的人妻完整版| 一区二区三区四区激情视频 | 97在线视频观看| 精品久久久久久久末码| 女人被狂操c到高潮| av专区在线播放| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久成人免费电影| 91在线精品国自产拍蜜月| 午夜爱爱视频在线播放| 久久人妻av系列| 国产精品国产高清国产av| 男女啪啪激烈高潮av片| 99久久中文字幕三级久久日本| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久久久性生活片| 天堂网av新在线| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久精品国产亚洲网站| 男女那种视频在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲av成人av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产91av在线免费观看| 久久久久久久久中文| av在线蜜桃| 免费av毛片视频| 欧美zozozo另类| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩一区二区视频免费看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 最新中文字幕久久久久| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 三级国产精品欧美在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 国产成人a∨麻豆精品| 国产单亲对白刺激| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本熟妇午夜| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 永久网站在线| 男人舔奶头视频| 九九热线精品视视频播放| 麻豆成人午夜福利视频| 日本一本二区三区精品| h日本视频在线播放| 少妇被粗大猛烈的视频| 天美传媒精品一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 99热这里只有是精品50| 女同久久另类99精品国产91| 国内揄拍国产精品人妻在线| 天美传媒精品一区二区| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久欧美国产精品| 成人av一区二区三区在线看| 97超视频在线观看视频| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av成人精品一区久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 搡老岳熟女国产| 欧美色视频一区免费| 99久久精品一区二区三区| 在线看三级毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 嫩草影视91久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 又爽又黄无遮挡网站| 国产午夜精品论理片| 成人国产麻豆网| 毛片女人毛片| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品一区av在线观看| 美女内射精品一级片tv| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品无大码| 嫩草影院入口| 天堂网av新在线| av在线观看视频网站免费| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产人妻一区二区三区在| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲自拍偷在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品永久免费网站| 国内精品美女久久久久久| 免费高清视频大片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产伦在线观看视频一区| 午夜福利18| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲美女视频黄频| 久99久视频精品免费| 欧美高清成人免费视频www| 国产三级中文精品| 一夜夜www| 日本在线视频免费播放| 免费观看在线日韩| 18禁在线播放成人免费| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美一区二区亚洲| 亚洲天堂国产精品一区在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 午夜激情欧美在线| 亚洲性久久影院| 在线观看一区二区三区| 久久久国产成人免费| 日韩在线高清观看一区二区三区| 色在线成人网| 免费搜索国产男女视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲美女黄片视频| 六月丁香七月| 亚洲在线观看片| 日韩精品有码人妻一区| 可以在线观看的亚洲视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产三级中文精品| 超碰av人人做人人爽久久| a级毛片a级免费在线| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美激情国产日韩精品一区| 91av网一区二区| 国产欧美日韩一区二区精品| 91狼人影院| 午夜影院日韩av| 春色校园在线视频观看| 国产免费男女视频| 国产成年人精品一区二区| 日本一二三区视频观看| 特级一级黄色大片| 国产成年人精品一区二区| 美女高潮的动态| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久久久久九九精品二区国产| 九九热线精品视视频播放| 三级毛片av免费| 国产熟女欧美一区二区| 天堂动漫精品| 国产视频内射| 久久久久国产网址| 草草在线视频免费看| 久久久色成人| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 亚洲经典国产精华液单| 人人妻人人澡欧美一区二区| 免费观看人在逋| 亚洲人成网站在线播| 国产一级毛片七仙女欲春2| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品一区www在线观看| av在线亚洲专区| 在线观看一区二区三区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩欧美精品v在线| 超碰av人人做人人爽久久| 成人二区视频| 国内精品一区二区在线观看| 久久亚洲精品不卡| 99riav亚洲国产免费| 国产在线精品亚洲第一网站| 不卡一级毛片| 国产精品人妻久久久影院| 人妻少妇偷人精品九色| 99久久精品一区二区三区| 久久久午夜欧美精品| 国产黄色小视频在线观看| 久久草成人影院| 亚洲经典国产精华液单| 色吧在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产中年淑女户外野战色| 久久亚洲国产成人精品v| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产高清有码在线观看视频| 国产久久久一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 国产精品一区二区三区四区久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品欧美国产一区二区三| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产三级中文精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费人成视频x8x8入口观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日韩欧美国产在线观看| 身体一侧抽搐| 乱人视频在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日韩成人伦理影院| 精华霜和精华液先用哪个| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色欧美视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 麻豆国产97在线/欧美| 成人特级av手机在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲,欧美,日韩| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 在现免费观看毛片| 午夜视频国产福利| 欧美日本亚洲视频在线播放| av卡一久久| 亚洲在线观看片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩人妻高清精品专区| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲国产精品国产精品| 国产爱豆传媒在线观看| 日本a在线网址| 国内精品久久久久精免费| 搡老岳熟女国产| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩精品中文字幕看吧| 精品午夜福利在线看| 国产精品伦人一区二区| 亚洲成人久久性| videossex国产| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成人国产麻豆网| 国产精品一区www在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲18禁久久av| 精品久久久久久成人av| 国产高潮美女av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 99久久精品一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品一区www在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 淫秽高清视频在线观看| 观看免费一级毛片| av在线观看视频网站免费| 国内精品宾馆在线| 大香蕉久久网| 精品久久国产蜜桃| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本一二三区视频观看| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产欧美日韩精品一区二区| 一区福利在线观看| 热99re8久久精品国产| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 男女之事视频高清在线观看| 成人欧美大片| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品电影一区二区三区| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲成人av在线免费| 免费大片18禁| 99久久精品一区二区三区| 一区福利在线观看| 热99re8久久精品国产| 看十八女毛片水多多多| 听说在线观看完整版免费高清| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲美女黄片视频| 亚洲国产色片| 高清午夜精品一区二区三区 | 岛国在线免费视频观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| eeuss影院久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 日本黄色视频三级网站网址| 天天躁日日操中文字幕| 日韩欧美国产在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 在线免费十八禁| 日本成人三级电影网站| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 亚洲av免费在线观看| 99热这里只有精品一区| 亚洲精品亚洲一区二区| 午夜精品在线福利| 亚洲av二区三区四区| 一个人免费在线观看电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 一进一出好大好爽视频| 性欧美人与动物交配| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本欧美国产在线视频| 亚洲色图av天堂| 天美传媒精品一区二区| 国产探花在线观看一区二区| 日韩制服骚丝袜av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 22中文网久久字幕| 成人无遮挡网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| or卡值多少钱| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲av美国av| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美丝袜亚洲另类| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 永久网站在线| 插阴视频在线观看视频| 看免费成人av毛片| 亚洲av一区综合| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 天堂动漫精品| 国产色爽女视频免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 99热这里只有精品一区| 91av网一区二区| 久久久国产成人精品二区| av在线观看视频网站免费| 午夜激情福利司机影院| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99在线视频只有这里精品首页| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成人无遮挡网站| 亚洲专区国产一区二区| 六月丁香七月| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 能在线免费观看的黄片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 最后的刺客免费高清国语| .国产精品久久| 日韩欧美精品免费久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久韩国三级中文字幕| 国内精品一区二区在线观看| 一个人免费在线观看电影| 亚洲无线观看免费| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 伦理电影大哥的女人| 免费观看人在逋| 亚洲无线观看免费| 日韩欧美免费精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲无线在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美一区二区国产精品久久精品| 免费人成在线观看视频色| 少妇的逼好多水| 啦啦啦韩国在线观看视频| 床上黄色一级片| 99精品在免费线老司机午夜| 国产黄a三级三级三级人| 99热精品在线国产| 亚洲国产欧美人成| a级一级毛片免费在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 联通29元200g的流量卡| АⅤ资源中文在线天堂| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| АⅤ资源中文在线天堂| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 免费高清视频大片| 日韩大尺度精品在线看网址| 天堂动漫精品| av专区在线播放| 久久久久久大精品| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲无线观看免费| 国产黄色小视频在线观看| 日本熟妇午夜| 男女视频在线观看网站免费| h日本视频在线播放| videossex国产| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 少妇人妻精品综合一区二区 | 成年版毛片免费区| 欧美成人a在线观看| 在线观看66精品国产| 午夜福利视频1000在线观看| 国产成人精品久久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| av天堂在线播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 黄片wwwwww| 日本在线视频免费播放| 高清日韩中文字幕在线| 成人美女网站在线观看视频| 波多野结衣高清作品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人一区二区在线| 两个人视频免费观看高清| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲va在线va天堂va国产| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久99久视频精品免费| av在线观看视频网站免费| 色av中文字幕| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 成人欧美大片| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 俺也久久电影网| 国产高潮美女av| 欧美丝袜亚洲另类| 最好的美女福利视频网| 校园春色视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲无线在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| av卡一久久| 精品一区二区三区人妻视频| aaaaa片日本免费| 少妇丰满av| 精品一区二区三区av网在线观看| 97在线视频观看| 日韩国内少妇激情av| 97热精品久久久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产男靠女视频免费网站| 亚洲av不卡在线观看| 色吧在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜亚洲福利在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 精品人妻熟女av久视频| 欧美日韩在线观看h|