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    高效液相色譜法同時定量分析紫蘇不同部位的植物代謝物

    2023-03-07 11:44:22張紅玉王丹吳春劍侯天宇趙亞娜張志軍雷娜娜李河
    現(xiàn)代食品科技 2023年2期
    關(guān)鍵詞:紫蘇葉紫蘇芹菜

    張紅玉,王丹,吳春劍,侯天宇,趙亞娜,張志軍,雷娜娜,李河*

    (1.中北大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,山西太原 030051)(2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641) (3.香港中文大學(xué)化學(xué)院,中國香港 999077)

    紫蘇(Perilla frutescensL.)是一種唇形科草本植物,是國家衛(wèi)生部首批頒布的藥食同源的60種中藥之一[1]。在東南亞地區(qū)分布廣泛,尤其在中國、日本、韓國種植歷史更加悠久[2]。我國早有利用新鮮紫蘇葉處理以避免食用蝦蟹中毒的傳統(tǒng),日本將紫蘇當(dāng)做代表性的風(fēng)味食品,韓國利用紫蘇制作泡菜和烤肉包 裝[3],因此,紫蘇在食品工業(yè)上應(yīng)用廣泛。

    紫蘇代謝物在其生長和自我防御機(jī)制中形成,主要包括黃酮類、脂肪酸類、酚酸類[4]、植物甾醇類及精油[5,6],具有多種生理功能[3]。研究表明,紫蘇提取物有極強(qiáng)的抗氧化性[7-9]。紫蘇油可改善糖尿病性小鼠的高甘油三酸酯血癥和腸道營養(yǎng)不良[10]、淀粉樣蛋白β誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙[11]和炎癥反應(yīng)[12];紫蘇葉提取物對脂肪細(xì)胞分化和高脂飲食小鼠有抗肥胖作用[13],也有降血糖活性[14];紫蘇醛可調(diào)節(jié)大鼠的α-抑制蛋白減輕其抑郁行為[15];紫蘇籽多糖可抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長[16]。

    研究表明迷迭香酸是紫蘇葉中含量最高的化合 物[3]。薛姣[17]分離純化了紫蘇迷迭香酸,并研究了它的抗氧化和抗菌性能;楊馥菡等[18]利用高速逆流色譜分離純化了紫蘇葉中的迷迭香酸和咖啡酸。何彥康[19]利用高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)以及核磁共振光譜(NMR)確認(rèn)了紫蘇中花色苷和主要黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu);Assefa等[9]利用超高效液相色譜-電噴霧電子-飛行時間-質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-ESI-TOF-MS)定性分析了73種紫蘇樣品中酚類化合物。Yan等[7]提取測定了冷榨紫蘇子粉中的總多酚含量,并評估了其中的抗氧化性能;上述對紫蘇代謝物的研究多基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),且以定性為主。在對紫蘇代謝物定量分析的研究中,史月姣等[20]和艾鑫衛(wèi)等[21]利用LC-MS分別測定了紫蘇水煎液和各生長期紫蘇中的酚類物質(zhì)含量;代沙等[22]利用HPLC測定了不同品系紫蘇中的8種酚類物質(zhì);落艷嬌等[23]測定了不同栽培年份和采收期紫蘇葉中的2種酚酸和6種黃酮的成分含量。此外,5-羥甲基糠醛(HMF)和糠醛等呋喃環(huán)衍生物也被報道為植物代謝物,在中藥中廣泛存在[24,25],然而在紫蘇中的分布尚未見報道。

    綜上所述,目前對紫蘇代謝物的研究主要集中在迷迭香酸、咖啡酸和部分黃酮上,原料以紫蘇葉為主。鮮有報道紫蘇桿、殼、葉中代謝物同時定量分析方法的研究。與HPLC-MS相比,HPLC價格相對便宜,在各高校實驗室及公司研發(fā)質(zhì)檢部門普遍配備,因此,本實驗以山西不同品種的紫蘇為研究對象,利用HPLC法系統(tǒng)分析紫蘇不同部位的19種代謝物的含量和分布,以期為紫蘇代謝物的定量分析及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    紫蘇葉、紫蘇桿、紫蘇殼(山西省晉中市)均來源于本課題組實驗田種植所得,品種分別為1#、3#、4#、27#、28#、混1#、晉紫蘇2#、晉紫蘇3#、白蘇、雙面紫。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純,均購自上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司。無水乙醇、沒食子酸(GA)、迷迭香酸(RosA)、蘆丁(RT)購自北京索萊寶科技有限公司。5-羥甲基糠醛(HMF)、糠醛(F)、原兒茶酸(PCA)、對羥基苯甲酸(ρ-HBA)、兒茶素(C)、咖啡酸(CA)、對香豆酸(ρ-CA)、野黃芩苷(SG)、阿魏酸(FA)、楊梅素(MC)、白藜蘆醇(RVT)、木犀草素(LTL)、槲皮素(QC)、芹菜素(AGN)、山奈酚(KMF)均購自上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司,芹菜素-7-O-葡萄糖苷(AG)購自上海紫霞生物科技有限公司。19種植物代謝物的詳細(xì)信息見表1。

    表1 19種植物代謝物的詳細(xì)信息Table 1 Detailed information of 19 plant metabolites

    1.2 儀器與設(shè)備

    Ultimate 3000高效液相色譜儀,美國熱電公司;超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀,Aanquish超高效液相系統(tǒng),TSQ Altis三重四極桿質(zhì)譜,美國熱電公司;SB25-12DTD超聲波清洗器,寧波新芝生物科技股份有限公司;CTL550低速離心機(jī),湖南湘立儀器有限公司;XW-80A渦旋混合器,上海馳唐電子有限公司;ZYCGF-III-20T超純水制備系統(tǒng),四川卓越水處理設(shè)備有限公司;BCD-576WDPU冰箱,海爾公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

    準(zhǔn)確稱取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、糠醛、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、兒茶素、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、迷迭香酸、楊梅素、白藜蘆醇、木犀草素、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg,分別用甲醇溶解并定容到10 mL容量瓶中,得到每種標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。利用含0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈:水=1:1,V/V)對貯備液進(jìn)行梯度稀釋,得到一系列不同濃度梯度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,同時稀釋各標(biāo)準(zhǔn)貯備液,得到單獨標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

    1.3.2 色譜分析條件

    采用高效液相色譜法對19種物質(zhì)進(jìn)行測定,其中單獨標(biāo)準(zhǔn)品用于定性分析,混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析,色譜條件如下:(1)色譜柱:Atlantic C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm);(2)柱溫,25 ℃;(3)流動相:A,0.1%甲酸乙腈、B,0.1%甲酸水;(4)洗脫程序:0~15 min,95%~90% B;15~30 min,90%~70% B;30~50 min,70%~60% B;50~51 min,60%~0% B;51~54 min,0% B;54~55 min,0~95% B;55~65 min,95% B。(5)進(jìn)樣量,20 μL;(6)流速,1.0 mL/min;(7)檢測波長見表1。

    1.4 未知物定性分析

    經(jīng)甲醇水溶液提取之后,樣品色譜圖中有2個色譜峰i和ii(圖2b、2c、2d)與19種標(biāo)品化合物的保留時間均對應(yīng)不上,但其含量相對較高,為了進(jìn)一步對這兩種化合物進(jìn)行定性分析,利用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-TOF-MS)對其質(zhì)譜碎片離子進(jìn)行確定,色譜條件同1.3.2,進(jìn)入質(zhì)譜時通過分流將流速設(shè)為0.3 mL/min,質(zhì)譜條件如下:電噴霧電子(ESI)電離,負(fù)離子模式,全掃描,掃描范圍:100~1 000m/z,離子傳輸管溫度:300 ℃,霧化室溫度:350 ℃,載氣40 arb;輔助氣:10 arb。

    1.5 樣品前處理

    分別對不同品種紫蘇葉、桿及殼取樣,經(jīng)自然風(fēng)干后攪碎,然后過60目篩,得到各部位的粉末狀樣品,取樣部位及樣品見圖1。準(zhǔn)確稱取0.50 g粉末樣品至50 mL塑料離心管中,加入10 mL酸化甲醇水溶液(甲醇:水=60:40,0.1%甲酸),渦旋振蕩1 min,超聲萃取20 min后,5 000 r/min離心15 min,收集上清液。殘渣繼續(xù)用10 mL上述甲醇水溶液繼續(xù)萃取1次,重復(fù)超聲和離心步驟,收集上清液,過0.22 μm濾膜后,待HPLC分析。對于紫蘇葉樣品中的迷迭香酸,因其含量較高(出現(xiàn)平頭峰,圖2b),進(jìn)樣前需進(jìn)行10倍稀釋。

    圖1 紫蘇取樣部位圖Fig.1 Sampling sites of Perilla

    1.6 方法學(xué)考察

    1.6.1 檢出限與定量限

    紫蘇桿樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后得到信噪比(S/N)為3時對應(yīng)的濃度為樣品的檢出限(LOD),以信噪比為10時對應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。具體方法為:在紫蘇桿樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)過前處理之后,濃度為C,HPLC分析得到信噪比為n,則此時利用以下公式計算得到理論的LOD和LOQ:

    注:

    LOD——樣品的檢出限;

    LOQ——定量限;

    C——紫蘇桿樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)前處理之后的濃度;

    n——信噪比。

    以計算得到的LOD和LOQ為參考,加入濃度越來越低的標(biāo)準(zhǔn)溶液,直到實際測得信噪比為3或10時,對應(yīng)的濃度即為實際的LOD和LOQ(實際值一般比理論值偏高)。

    1.6.2 線性方程與范圍

    利用外標(biāo)法對植物樣品中19種物質(zhì)進(jìn)行定量。分別配置濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.3.2色譜條件下進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x,mg/L)為橫坐標(biāo),以峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于各物質(zhì)響應(yīng)有差異,其對應(yīng)的線性范圍見表2。

    1.6.3 回收率和精密度

    精確稱取紫蘇桿樣品0.50 g,加入19種混合標(biāo)準(zhǔn)品適量,使其濃度分別達(dá)到2.0、10.0和50.0 mg/L,每個濃度平行6次,各物質(zhì)的回收率通過以下公式計算:

    式中:

    R——回收率,%;

    m總——各物質(zhì)加標(biāo)和樣品的總含量,mg;

    m樣品——樣品本身各物質(zhì)的含量,mg;

    m加標(biāo)——加入各物質(zhì)的含量,mg。

    回收率6次平行的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)作為方法的精密度。

    1.7 統(tǒng)計分析

    除了回收率平行6次外,其余結(jié)果均為三次檢測均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行整理與初步分析,SPSS 21.0進(jìn)行方差分析,Origin 2018進(jìn)行作圖以及擬合處理。置信區(qū)間為95%,即P<0.05視為數(shù)據(jù)之間有顯著性差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HPLC檢測19種植物代謝物

    采用HPLC對紫蘇不同部位的19種植物代謝物進(jìn)行檢測,在1.3.2的色譜條件下,19種物質(zhì)在55 min實現(xiàn)完全分離,峰型和分離度均較理想。三種紫蘇不同部位的樣品中,19種物質(zhì)種類與含量的分布差異較大。圖2為19種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和典型的紫蘇葉、紫蘇桿、紫蘇殼樣品液相色譜圖。由圖可知,在無需凈化的過程中,樣品中19種化合物的峰型干擾不影響定量積分。

    圖2 19種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品及典型樣品的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 19 mixed standard compounds and typical samples

    2.2 未知物的定性分析

    如圖2b、2c、2d所示,利用UPLC-TOF-MS對色譜峰i和ii進(jìn)行定性分析,結(jié)果見圖3。對于化合物i,負(fù)離子模式下,脫氫后質(zhì)荷比為m/z637.151 00,未觀察到可能的碎片離子,根據(jù)質(zhì)譜信息與文獻(xiàn)對 照[9,19],判斷i化合物為木犀草素-7-O-二葡萄糖苷;對于化合物ii,負(fù)離子模式下,脫氫后質(zhì)荷比為m/z621.121 03,較高的碎片離子為m/z351.167 05,應(yīng)為黃酮骨架上脫去一個葡萄糖苷酸基團(tuán)(177 u)和一個苯酚基團(tuán)(93 u),將其質(zhì)譜信息與已發(fā)表的文獻(xiàn)對比[4,9],可確定化合物ii為芹菜素-7-O-二葡萄糖苷,由于這兩種苷類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品很難商業(yè)購買,本文利用芹菜素-7-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品對它們進(jìn)行定量分析。

    圖3 兩種未知物i和ii的TOF-MS圖Fig.3 TOF-MS spectrum two unknown compounds: i and ii

    2.3 提取溶劑的優(yōu)化

    由于純有機(jī)試劑對待測物的溶解性大于流動相,使用純有機(jī)試劑(如甲醇)對樣品進(jìn)行提取,會導(dǎo)致進(jìn)入色譜柱的待測物在溶劑和流動相之間分配不均,出現(xiàn)部分物質(zhì)色譜峰前置拖尾的現(xiàn)象,從而影響分離度。因此在對提取溶劑選擇時,本文參照文獻(xiàn)及課題組研究經(jīng)驗[23,26],比較了甲醇、乙腈、乙醇水溶液(40%體積水)對19種待測物的提取回收率,結(jié)果見圖4。如圖4所示,三種溶劑對糠醛和楊梅素的回收率均較低,相比之下,甲醇水溶液更為理想。乙醇對對羥基苯甲酸、對香豆酸、迷迭香酸和白藜蘆醇的回收率均超過100%,可能由于乙醇極性較低,提取了較多的雜質(zhì);乙腈對沒食子酸和蘆丁的回收率偏低;綜上所述,本研究最終選擇甲醇水溶液作為提取溶劑。

    圖4 三種溶劑對19種化合物回收率的影響(n=3)Fig.4 Effects of three extract solvents on the recoveries of 19 compounds (n=3)

    2.4 方法學(xué)認(rèn)證

    2.4.1 檢出限、定量限與標(biāo)準(zhǔn)曲線

    根據(jù)1.6方法學(xué)考察,采用峰面積外標(biāo)法定量,以質(zhì)量濃度1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0 mg/L為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,19種化合物的保留時間、檢出限、定量限與標(biāo)準(zhǔn)曲線等信息見 表2。19種物質(zhì)在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)在0.997 6~0.999 9之間,檢出限在0.10~ 0.40 mg/L之間。史月姣等[20]利用LC-MS測定了紫蘇水煎液的部分代謝物,但未報道檢出限;艾鑫衛(wèi)等[21]建立了高靈敏度的HPLC-MS測定紫蘇不同生長期代謝物的方法,但僅能測定5種多酚,且質(zhì)譜價格昂貴,較難普及。代沙等[22]建立了HPLC測定紫蘇中分類的方法,也沒有報道方法的檢出限。雖然與LC-MS相比較,本研究的靈敏度較低,但僅就高效液相色譜而言,本方法具有更廣泛的適用范圍,能滿足紫蘇中代謝物定性和定量分析的要求。

    表2 19種植物代謝物的保留時間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Retention time, linear range and equation, correlation coefficient, limit of detection (LOD) and limit of qualification (LOQ) of 19 plant metabolites

    2.4.2 回收率和精密度

    由表3可知,19種植物代謝物的加標(biāo)回收率在61.65%~111.42%之間,RSD在1.02%~17.20%之間。由于糠醛類物質(zhì)粘度較大,且在紫蘇中含量極少,在加標(biāo)量較少時,其回收率較低。由于本文采用的HPLC法同時測定多種含紫外吸收基團(tuán)的化合物,在提取中無法避免共洗脫的干擾,歐盟委員會規(guī)定,當(dāng)加標(biāo)量較低時,回收率在-50%到+20%之間可以接受[27]。因此,在沒有質(zhì)譜輔助的情況下,該方法在實驗室及工業(yè)檢測同時定量19種化合物時是可行的。

    表3 19種化合物加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precision of 19 compounds (n=6)

    2.5 實際樣品的檢測

    應(yīng)用所建立的方法對10種不同品種紫蘇的葉、殼、桿進(jìn)行定量分析,檢測結(jié)果見表4。通過對結(jié)果分析(圖5),12種樣品中,含量較大的化合物為咖啡酸、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、迷迭香酸和芹菜素,在0.04~24.05 mg/g之間,含量差異跨度較大,不同紫蘇部位的化合物含量分布也不同。結(jié)果顯示,28#紫蘇殼中共檢出11種物質(zhì),含量在0.08~0.57 mg/g之間;21種化合物中,酚酸類如咖啡酸和迷迭香酸;黃酮及黃酮苷類,如木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素在12種樣品中均有檢出,其中迷迭香酸為紫蘇葉中含量最高的物質(zhì),這與前人的研究一致[17,28],其次為野黃芩苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷。胡惠軍等[26]報道了紫蘇葉中咖啡酸、迷迭香酸和野黃芩苷的含量,其含量分別在0.10~0.49、0.29~9.58和0.26~4.38 mg/g之間;落艷嬌等[23]測定了51個紫蘇葉樣品中咖啡酸、迷迭香酸和6種黃酮苷的含量,發(fā)現(xiàn)迷迭香酸含量為為2.13~33.97 mg/g;其次是木犀草素-7-O-二葡萄糖苷,含量為1.31~14.80 mg/g;芹菜素-7-O-二葡萄糖苷含量為2.68~7.60 mg/g;芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量為0.56~1.00 mg/g;咖啡酸含量最少,為0.11~0.68 mg/g。造成含量差異的原因可能與紫蘇品種、生成環(huán)境、水分含量及提取溶劑等有關(guān)。此外,本文中原兒茶酸和對羥基苯甲酸在部分樣品中也有檢出。木犀草素在紫蘇殼和桿中有檢出,含量較少,在0.05~0.18 mg/g之間,但在紫蘇葉中沒有檢出。值得注意的是,本文在紫蘇殼中檢出了HMF和糠醛兩種呋喃環(huán)衍生物。

    表4 12種不同紫蘇品種殼、葉、桿中植物代謝物的含量(n=3)Table 4 Contents of 21 studied compounds in seed shell, leaf and stem of 12 different types ofPerilla (n=3)

    圖5 21種化合物在不同品種紫蘇不同部位的分布圖Fig.5 Distribution of 21 compounds in different parts of different varieties of Perilla

    3 結(jié)論

    本實驗基于高效液相色譜-紫外檢測儀建立了不同品種紫蘇不同部位中19種植物代謝物同時檢測的方法,19種化合物保留時間穩(wěn)定,峰型和分離度良好。方法的檢出限在0.05~0.40 mg/L之間,回收率和精密度分別在61.65%~111.42%和1.02%~17.20%之間。在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用該方法對不同品種分不同部位的紫蘇進(jìn)行了檢測。19種化合物在不同紫蘇部位中的含量差異極大,其中咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷、野黃芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷和芹菜素等含量較大,在12個樣品中均有檢出,含量在0.05~24.05 mg/g之間。28#紫蘇殼中共檢出11種物質(zhì),含量在0.08~0.57 mg/g之間;紫蘇殼和桿中均有木犀草素檢出,含量在0.05~0.18 mg/g之間;紫蘇葉中化合物含量順序為迷迭香酸>野黃芩苷>芹菜素-7-O-葡萄糖苷。此外,本實驗在紫蘇殼中檢出HMF和糠醛兩種呋喃環(huán)衍生物。

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