不同品種靈芝子實體及孢子粉元素成分分析及重金屬安全性評價

潘少香，趙岑，閆新煥，李洪霄，劉雪梅，宋燁，吳茂玉，馬超，熊永星*，鄭曉冬*

（1.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心，山東濟南 250014）

（2.聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東聊城 252000）

靈芝（Ganoderma lucidum）是擔子菌綱（Homobasidiomycetes）多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）真菌，是一種食藥兩用的真菌，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用[1,2]。靈芝孢子粉是靈芝生長成熟時從菌蓋彈射出來的淡霧狀的極其微小的孢子，主要含有多糖類、三萜類、甾醇類和生物堿類等活性成分，具有抗癌、保肝、降血脂、降血糖、抗缺氧、抗炎、清除自由基以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用[3-5]。我國是世界上靈芝主要的生產(chǎn)國和出口國，2019年靈芝產(chǎn)量18.55萬t，占全球產(chǎn)量的75%。目前靈芝的種植以人工栽培為主，我國靈芝種植主要分為四大種植區(qū)域，分別為閩浙的武夷山及龍泉區(qū)域、東北吉林長白山區(qū)域、安徽一帶大別山區(qū)域和山東魯西區(qū)域，這四大區(qū)域的孢子粉產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的 60%以上[6]。赤芝、美芝、新大片是目前市場主栽的靈芝品種，藏芝、香血芝因其價值較高在山東魯西區(qū)域逐漸被引進種植。

靈芝子實體和孢子粉中含有鈣、鎂、鐵、鋅、銅、硒等豐富的微量元素，其中豐富的硒元素越來越引起學(xué)者的關(guān)注[7]。靈芝孢子粉作為保健品，越來越受到人們的青睞，其安全性也倍受關(guān)注。由于近年來環(huán)境污染嚴重，靈芝孢子粉易受污染，特別是有害重金屬的蓄積問題[8,9]。靈芝孢子細胞壁極為堅固，由幾丁質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)組成，直接服用很難被胃酸消化，在實際應(yīng)用中，將靈芝孢子粉破壁后食用，或破壁提取靈芝孢子粉有效成分食用是主流服用方式[10]。目前主要工業(yè)應(yīng)用的靈芝孢子粉破壁加工方法是機械破壁法[11]，機械方法常會增加破壁靈芝孢子粉金屬元素含量，甚至造成超標[6,11-13]，因此對于破壁靈芝孢子粉的金屬元素含量評估是非常重要的。

本研究針對我國魯西地區(qū)主栽靈芝品種，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定靈芝子實體及孢子粉中元素及重金屬含量，開展元素質(zhì)量及安全分析評價，同時研究目前破壁孢子粉企業(yè)廣泛應(yīng)用的擠壓破壁方式對孢子粉重金屬含量的影響，以期為靈芝子實體及孢子粉的生產(chǎn)和深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

美芝、赤芝、新大片、香血芝、藏芝等靈芝子實體、孢子粉及破壁孢子粉樣品均從魯西地區(qū)靈芝生產(chǎn)基地采取，美芝、赤芝、新大片、香血芝、藏芝等靈芝子實體均為代料栽培靈芝，赤芝粉、美芝粉、新大片粉均為代料栽培靈芝孢子粉，赤芝椴木粉為椴木栽培靈芝孢子粉。

1.2 儀器與設(shè)備

WX-8000微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；ICAP電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，德國默克密理博有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 元素檢測方法

1.3.1.1 微波消解條件

稱取0.3 g樣品，于微波消解內(nèi)罐中，加入5 mL純硝酸，搖勻，放入微波消解儀中，按微波消解程序進行消解（見表1）。消解完成后，將消解罐轉(zhuǎn)移至電熱板上趕酸，趕酸至近干，加水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，搖勻[14]。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion program

1.3.1.2 儀器工作參數(shù)

ICP-MS法儀器工作參數(shù)為：功率1 550 W，冷卻氣流量14.0 L/min，霧化氣流量1.0 L/min，輔助氣流量0.8 L/min，樣品提升量4.0 L/min，采樣深度7.8 mm，重復(fù)采樣3次[14]。

1.3.2 孢子粉破壁率

孢子粉破壁率檢測方法參照NY/T 1677-2008《破壁靈芝孢子粉破壁率的測定》[15]。

在進行施工準備工作前，一定要積極配合建設(shè)單位進行組織設(shè)計的交底工作，對于施工的設(shè)計文件一定要進行仔細的審核，也要結(jié)合實際的工程需要，進行必要的驗證以及補測。對于可能發(fā)生塌方的區(qū)域，必須要做好一定的必要準備，在施工的過程中，必須做好相對應(yīng)的預(yù)防措施。在必要的情況下，采取相對的應(yīng)急措施以消除各種不利因素的影響。只有這樣，才可以避免塌方的產(chǎn)生。由于隧洞的地質(zhì)條件相對比較復(fù)雜，對于質(zhì)量的監(jiān)控以及地址預(yù)報的工作必須要做好。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（mean±SD，n=3），每個樣品重復(fù)3次，取平均值。實驗數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行分析，方差分析（ANOVA）用于顯著性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；點線圖由Origin 9.0軟件繪制完成，聚類熱圖由R軟件分析完成，聚類方式采用歐氏距離法。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種靈芝子實體元素差異分析

利用ICP-MS法對赤芝、美芝、新大片、香血芝、藏芝5種靈芝子實體樣品中K、Ca、Na、Mg、Al、Fe、Cu、Zn、Mn、Se、Ni、B、Ti、V、Co、Sr、Ba17種元素進行測定，測定結(jié)果見表2。除K、Ca、Na、Mg四種常量元素外，F(xiàn)e、Cu、Zn、Mn 4種微量元素在5種靈芝子實體中含量相對較高，這與閆征等[16]、何晉浙等[17]研究結(jié)果一致。將5種靈芝子實體樣品元素含量進行z-score標準化，消除各元素間量綱差異后做聚類熱圖，見圖1。由圖1可知，不同品種靈芝子實體樣品中元素含量差異明顯，藏芝和香血芝樣品元素含量明顯高于赤芝、美芝和新大片樣品元素含量。

由表2可知，5種子實體常量元素含量差異顯著，K含量范圍1 178~5 999 mg/kg，Ca元素含量范圍為186~1 235 mg/kg，Na元素含量范圍62.3~113 mg/kg，Mg元素含量范圍173~1 283 mg/kg。在Fe、Cu、Zn、Mn、Se、B、V、Co、Sr9種人體必需微量元素中，除B、Cu、Sr 3種元素外，藏芝子實體中其余6種微量元素含量均為最高，F(xiàn)e元素含量達到234 mg/kg、Zn元素含量達到57.9 mg/kg、Se達到0.309 mg/kg。香血芝子實體樣品B、Cu、Sr 3種元素含量最高，分別為5.75、54.1、3.60 mg/kg。5種靈芝子實體中赤芝子實體Fe、Cu、Se、Sr 4種微量元素含量相對較低，新大片子實體Zn、Mn、V、Co 4種元素含量相對較低；美芝子實體9種微量元素含量均高于赤芝和新大片樣品，低于藏芝和香血芝子實體樣品。由表2和圖1可知，赤芝、美芝、新大片3種靈芝子實體微量元素含量低于藏芝和香血芝子實體，這可能是因為赤芝、美芝、新大片品種是經(jīng)多年培育的產(chǎn)孢子粉靈芝品種，子實體元素品質(zhì)質(zhì)量稍差。

表2 不同品種靈芝子實體元素分布Table 2 Element content of different varieties of Ganoderma lucidum

圖1 不同品種靈芝子實體元素聚類熱圖Fig.1 Cluster heat map of elements of different varieties of Ganoderma lucidum

2.2 不同品種靈芝孢子粉元素差異性分析

選取赤芝粉、美芝粉、新大片粉3種目前魯西地區(qū)主要的靈芝孢子粉樣品，同時以赤芝椴木粉為對照，分析赤芝粉、美芝粉、新大片粉3種孢子粉元素營養(yǎng)質(zhì)量。4種孢子粉17種元素含量見表3。由表3可知，靈芝孢子粉中元素分布規(guī)律與靈芝子實體中元素分布規(guī)律相似，微量元素中Fe、Cu、Zn、Mn 4種微量元素含量較高，與程齊來等[18]研究結(jié)果一致。不同品種孢子粉元素含量差異顯著，赤芝粉常量元素K、Ca含量較高，美芝粉常量元素Na、Mg含量較高，赤芝椴木粉常量元素Ca含量低于赤芝粉、美芝粉、新大片粉3種孢子粉，赤芝椴木粉K、Na、Mg 3種元素含量介于赤芝粉、美芝粉、新大片粉3種孢子粉之間。

表3 不同品種靈芝孢子粉元素分布Table 3 Element content of different varieties of Ganoderma lucidumspore power

2.3 靈芝子實體和孢子粉重金屬安全性評價

對藏芝、赤芝、美芝、香血芝、新大片5種靈芝子實體和赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4種孢子粉樣品中As、Pb、Hg、Cr、Cd 5種重金屬進行檢測，結(jié)果如圖2。由圖2可知，5種子實體樣品中Hg元素均低于檢出限（0.001 mg/kg），As元素含量范圍為0.068 8~0.639 mg/kg，Pb元素含量范圍為0~ 0.268 mg/kg，Cr元素含量范圍為0.110~2.08 mg/kg，Cd元素含量范圍為0.023~0.364 mg/kg。目前靈芝子實體重金屬限量沒有國家標準和行業(yè)標準，團體標準T/68C 002-2019《靈芝干品》[19]中僅對As、Pb、Hg 3種元素設(shè)定了限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg），團體標準T/JZLZ 003-2019《金寨靈芝》[20]中對As、Pb、Hg 3種元素也設(shè)定了限量要求（As≤0.9 mg/kg、Pb≤1.8 mg/kg、Hg≤0.1 mg/kg）。從5種靈芝子實體檢測結(jié)果來看，Pb、Hg 2種重金屬含量遠低于相關(guān)團體標準限量要求，安全性較高，藏芝、香血芝As元素含量較高，具有一定的安全性風(fēng)險。

圖2 不同品種靈芝子實體及孢子粉重金屬含量Fig.2 Heavy metal content in different varieties of Ganoderma lucidum and spore powder

4種孢子粉重金屬檢測結(jié)果見圖2，由圖2可知，赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4種孢子粉樣品中Hg元素均低于檢出限（0.001 mg/kg），As元素含量范圍為0.063 7~0.689 mg/kg，Pb元素含量范圍為0~0.291 mg/kg，Cr元素含量范圍為0.035~0.204 mg/kg，Cd元素含量范圍為0.043~0.144 mg/kg。目前靈芝孢子粉尚無國家標準，行業(yè)標準中只有供銷行業(yè)標準GH/T 1335-2021《靈芝孢子粉》[21]，但標準中無對重金屬的限量要求。團體標準如T/68C 002-2019《靈芝干品》[18]、T/JZLZ 003-2019《金寨靈芝》[19]對孢子粉中重金屬限量與子實體一致，從4種孢子粉重金屬As、Pb、Hg檢測結(jié)果可知，孢子粉中Pb、Hg 2種重金屬含量遠低于相關(guān)團體標準限量要求，安全性較高，這與胡曉等[22]研究結(jié)果一致。新大片孢子粉中As元素含量較高，為0.698 mg/kg，具有一定的安全性風(fēng)險。

2.4 破壁對孢子粉重金屬含量的影響

對輥式擠壓破壁技術(shù)是目前企業(yè)最常用的靈芝孢子粉破壁技術(shù)之一，實驗對美芝、新大片、赤芝孢子粉原料及經(jīng)對輥式擠壓破壁的破壁孢子粉中As、Pb、Hg、Cd、Cr、Cu、Ni 7種重金屬元素含量進行檢測，三種孢子粉破壁后破壁率分別為96%、97%、96%，元素檢測結(jié)果如圖3。從圖3可知，Hg元素在所有樣品中均未檢出，安全性較好。新大片孢子粉樣品除As、Pb、Cd 3種元素破壁前后無顯著性差異外，其余重金屬含量均顯著提高，重金屬含量變化與沐華等[13]研究結(jié)果一致。其余孢子粉樣品經(jīng)對輥式擠壓破壁后6種重金屬元素含量變化與厲炯等[23]、鄒小龍等[12]研究一致，均發(fā)生了顯著提高。

圖3 破壁對孢子粉金屬元素含量的影響Fig.3 Effect of broken wall on the heavy metal element content of Ganoderma lucidum spore powder

《保健食品原料目錄破壁靈芝孢子粉》[24]原料技術(shù)要求中對破壁孢子粉中As、Pb、Hg、Cr、Cd、Ni 6中元素有明確限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.1 mg/kg、Cd≤0.5 mg/kg、Cr≤2.0 mg/kg、Ni≤ 1.0 mg/kg）。除《保健食品原料目錄破壁靈芝孢子粉》原料技術(shù)要求外，供銷行業(yè)標準GH/T 113-2017《靈芝破壁孢子粉》[25]對As、Pb、Hg三種元素也有明確限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.3 mg/kg），As、Pb限量與《保健食品原料目錄破壁靈芝孢子粉》原料技術(shù)要求一致，Hg限量較高。團體標準T/ZZB 0474-2018《靈芝破壁孢子粉》[26]中對Cd、Cr、Cu、Ni四種元素限量做出了明確要求，其中Cd≤0.5 mg/kg、Cr≤2.0 mg/kg、Cu≤20 mg/kg、Ni≤1.0 mg/kg，與《保健食品原料目錄破壁靈芝孢子粉》原料技術(shù)要求中限量要求一致。經(jīng)對輥式擠壓破壁后，新大片粉Cu元素由12.0 mg/kg提高至16.8 mg/kg；赤芝粉As、Pb、Cr、Cd 4種含量分別由0.112、0.239、0.108、0.070 9 mg/kg提高至0.600、0.870、0.870、0.113 mg/kg，美芝粉As、Pb、Cr、Cd、Cu、Ni元素含量也有一定程度提高。因此在對輥式擠壓破壁過程中孢子粉仍存在被重金屬污染的風(fēng)險，在實際應(yīng)用過程中要嚴格控制破壁力度、破壁時間等相關(guān)破壁條件，減少重金屬污染。

3 結(jié)論

藏芝和香血芝子實體大部分元素含量明顯高于赤芝、美芝和新大片樣品，特別是Fe、Cu、Zn、Mn、Se、B、V、Co、Sr 9種人體必需微量元素，新引品種藏芝和香血芝元素營養(yǎng)質(zhì)量相對較高；赤芝粉和赤芝椴木粉元素營養(yǎng)質(zhì)量高于美芝粉和新大片孢子粉元素營養(yǎng)質(zhì)量，特別是孢子粉中營養(yǎng)元素硒，赤芝粉和赤芝椴木粉中硒含量分別是美芝粉中硒含量的3倍和2倍。研究結(jié)果對于優(yōu)質(zhì)靈芝品種及孢子粉品種的引育及推廣具有重要的指導(dǎo)作用。

藏芝、赤芝、美芝、香血芝、新大片5種靈芝子實體及赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4種孢子粉樣品中，Pb、Hg兩種重金屬含量遠低于相關(guān)團體標準，安全性較高，藏芝、香血芝樣品樣品中As元素含量較高，說明藏芝、香血芝等引進品種在培育過程中對As元素的富集作用較強，具有一定的安全風(fēng)險，在種植過程應(yīng)嚴格控制培養(yǎng)基料中重金屬As的含量。

不同品種靈芝孢子粉對輥式擠壓破壁過程中As、Pb、Cd、Cr、Cu、Ni金屬元素含量均有不同程度的提高，其中變化最為明顯的赤芝粉經(jīng)破壁后As、Pb、Cr、Cd 4種含量分別由0.112、0.239、0.108、 0.070 9 mg/kg提高至0.600、0.870、0.870、0.113 mg/kg，因此在對輥式擠壓破壁過程中重金屬元素含量仍存在一定的風(fēng)險。破壁后孢子粉重金屬含量增加，是因為對輥式擠壓破壁機是由金屬部件組成，高強度的破壁擠壓會造成金屬部件的磨損，從而使設(shè)備中的重金屬進入孢子粉中。為避免重金屬污染，實際應(yīng)用過程中破壁功率、破壁時間等相關(guān)破壁條件還需進一步優(yōu)化研究，同時改進破壁工藝，開發(fā)材質(zhì)（如陶瓷）安全、易于推廣的破壁設(shè)備，減少破壁過程的二次污染，也是孢子粉破壁設(shè)備未來研發(fā)的主要方向。