飛機(jī)草鏈格孢毒素的培養(yǎng)條件、分離及活性測(cè)定

李雨龍　張宇　楊葉　趙磊　符旖晴

摘要：【目的】對(duì)鏈格孢菌株LGB100401的產(chǎn)毒培養(yǎng)條件及毒素的除草活性進(jìn)行評(píng)估，為飛機(jī)草的生物防治提供理論依據(jù)。【方法】以從海南田間染病的飛機(jī)草上分離到的鏈格孢菌LGB100401菌株為材料，采用以生物測(cè)定為導(dǎo)向的乙酸乙酯萃取和硅膠柱層析等方法對(duì)LGB100401菌株所產(chǎn)毒素進(jìn)行分離純化及產(chǎn)毒條件研究，并采用離體葉片針刺接種法測(cè)定38種植物對(duì)LGB100401菌株所產(chǎn)毒素的敏感性?！窘Y(jié)果】LGB100401菌株可產(chǎn)生毒素并導(dǎo)致飛機(jī)草葉片枯死，最適產(chǎn)毒條件為25 ℃、pH 4～6、光暗交替培養(yǎng)15 d。LGB100401菌株分泌的毒素對(duì)供試38植物具有選擇毒性，其中，供試雜草對(duì)鏈格孢粗毒素不敏感（NS）的有17種、稍敏感（LS）4種、敏感（MS）7種、極敏感（SS） 4種，表現(xiàn)為極敏感的雜草為飛機(jī)草、馬唐、羽芒菊和賽葵；供試的6種作物中只有水稻表現(xiàn)為敏感（MS），其他5種作物不敏感或表現(xiàn)輕微癥狀?！窘Y(jié)論】飛機(jī)草鏈格孢毒素對(duì)飛機(jī)草具有較高的抑制活性，具有較高的生防潛力。

關(guān)鍵詞： 飛機(jī)草；鏈格孢毒素；產(chǎn)毒條件；分離純化；除草活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S451；S476 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）01-0087-05

Abstract：【Objective】The research evaluated toxin production cultural conditions for Alternaria alternata strain LGB100401 and herbicidal activity of the toxin， in order to provide theoretical basis for biological control of Chromolaena odorata. 【Method】A. alternata strain LGB100401 isolated from infected C. odorata in field in Hainan was taken as material. The bioassay-guided ethyl acetate extract and silica gel column chromatographic separation were used to isolate， purify the toxin and research the toxin production conditions. Sensitivity of 38 species of plants to the toxin was tested using detached leaf puncture inoculation method. 【Result】Results showed that LGB100401 could produce toxins which led to necrosis of C. odorata leaf. The optimal cultural conditions for producing toxin were temperature 25 °C， pH 4-6， cultured period 15 d under alternation of light and dark. The toxin had selective toxicity towards the 38 species of plants. Sixteen species were not sensitive（NS） to the toxin， four species were slightly sensitive（LS）， eight species were sensitive（MS） and four species were very sensitive（SS）. The four species which were very sensitive were C. odorata， Digitaria sanguinalis， Tridax procumbent and Malvastrum coromandelianum. Among the six tested crops， only rice was sensitive（MS） to the toxin， the rest five crops were not sensitive or only showed slight symptom. 【Conclusion】Alternaria alternata toxin from C. odorata has strong inhibitory effect on C. odorata. It may be useful for biological control of C. odorata.

Key words： Chromolaena odorata； Alternaria alternata toxin； toxin production condition； separation and purification； herbicidal activity

0 引言

【研究意義】飛機(jī)草[Chromolaena odorata （L.） King & Robinson]是國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局和中國(guó)科學(xué)院聯(lián)合公布的我國(guó)首批16種外來(lái)入侵物種之一，在海南省廣泛分布，對(duì)當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)林牧業(yè)、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)安全造成了嚴(yán)重危害。由于飛機(jī)草生長(zhǎng)繁衍快且具有灌木的特性，化學(xué)防除和機(jī)械防除效果有限。利用天然活性化合物研發(fā)新一代除草劑是當(dāng)前除草劑研究熱點(diǎn)之一（程亮和郭青云，2015）。眾多研究表明，與直接利用病原真菌作為生物除草劑相比，微生物代謝產(chǎn)物提供了更廣闊的生物除草前景。目前，真菌毒素作為一種環(huán)保型農(nóng)藥被廣泛研究，植物病菌所產(chǎn)生的毒素也是獲得除草活性化合物及研究開(kāi)發(fā)新型除草劑的重要來(lái)源。【前人研究進(jìn)展】在真菌產(chǎn)生的毒素中，鏈格孢屬（Alternaria）產(chǎn)生的毒素備受關(guān)注，其中，交鏈格孢[A. alternata（Fr.） Keissler]是一類(lèi)分布廣泛的真菌，其寄主植物超過(guò)380種（Mirhosseini et al.，2015）。研究表明，來(lái)源于不同罹病植物的鏈格孢可產(chǎn)生多種毒素成分，對(duì)多種雜草具有除草活性（Ghorbani et al.，2000；Mohan Babu et al.，2003；Ostry，2008），是已知病原菌中產(chǎn)生毒素最多的種類(lèi)。從紫莖澤蘭上分離獲得的鏈格孢能產(chǎn)生有致病作用的毒素，并從其代謝產(chǎn)物中分離到細(xì)交鏈格孢菌酮酸（簡(jiǎn)稱TeA毒素），該毒素主要通過(guò)抑制紫莖澤蘭葉片光系統(tǒng)II的電子傳遞從而對(duì)其產(chǎn)生毒害作用（Chen et al.，2005；Qiang et al.，2006）。此外，鏈格孢產(chǎn)生的鏈格孢菌毒素（AAC毒素）具有廣譜和快速除草活性，其效果與百草枯相似（Qiang et al.，2010）；引起番茄莖枯病的鏈格孢菌產(chǎn)生的AAL毒素對(duì)龍葵、曼陀羅具有抑制活性（Abbas et al.，1995）。不同來(lái)源菌株所產(chǎn)生的毒素存在明顯差異，植物病原菌在寄主體外產(chǎn)生的毒素還與其培養(yǎng)條件密切相關(guān)，不同培養(yǎng)條件下其毒素活性大小、分泌物質(zhì)種類(lèi)、含量多少等均不盡相同（萬(wàn)佐璽等，2001；Varej o et al.，2013）。【本研究切入點(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)利用本土植物病原真菌所產(chǎn)生毒素防除飛機(jī)草的研究尚無(wú)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用從海南田間染病的飛機(jī)草上分離到的1株高毒力鏈格孢菌，采用硅膠柱層析等方法分離毒素，并采用離體葉片法對(duì)其產(chǎn)毒適宜條件及粗毒素的殺草活性進(jìn)行測(cè)定，旨在為飛機(jī)草的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

鏈格孢菌株LGB100401（GenBank登錄號(hào)KT2095-

89）從海南省自然發(fā)病的飛機(jī)草葉片上分離獲得。包括飛機(jī)草在內(nèi)的38種植物材料（其中雜草32種、作物6種，表1）用于生物測(cè)定，植物材料從海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院教學(xué)基地及?？诮紖^(qū)采集。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 粗毒素制備 選用PSK培養(yǎng)液（30 g蔗糖、1 g K2HPO4、1000 mL蒸餾水）進(jìn)行液體培養(yǎng)。將菌株LGB100401于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，取菌塊（直徑=5 mm）轉(zhuǎn)接到200 mL的PSK培養(yǎng)液中（500 mL三角瓶），每瓶5個(gè)菌塊，低轉(zhuǎn)速（90 r/min，6 h/d）振蕩與靜置結(jié)合培養(yǎng)，分別置于不同條件（不同培養(yǎng)時(shí)間、不同培養(yǎng)溫度、不同pH的培養(yǎng)液和不同光照）下培養(yǎng)。采用真空抽濾法使菌絲與培養(yǎng)液完全分離，獲得無(wú)菌含毒濾液。將含毒濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮獲得粗毒素。將純化的粗毒素用無(wú)菌水稀釋為1 mg/mL的待測(cè)液。

1. 2. 2 LGB100401毒素生物活性測(cè)定 采用離體葉片針刺接種法測(cè)定毒素對(duì)飛機(jī)草葉片的生物活性。取離體健康的飛機(jī)草葉片用自來(lái)水沖洗，用1.5%次氯酸鈉溶液表面消毒1 min，再用無(wú)菌水沖洗并晾干，用無(wú)菌解剖針針刺葉片造成輕微傷口（只刺破下表皮）。將10 μL待測(cè)液滴到葉片刺傷處，葉片置于含有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃保濕培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量病斑直徑。以無(wú)菌水為對(duì)照，根據(jù)病斑直徑比較毒素產(chǎn)量及活性。每處理3次重復(fù)。

1. 2. 3 LGB100401最佳產(chǎn)毒條件篩選

1. 2. 3. 1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)LGB100401產(chǎn)毒的影響 將接種有菌塊的培養(yǎng)液于28 ℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為5、10、15、20、25和30 d，按1.2.1的方法制備含毒濾液及純化毒素，通過(guò)生物測(cè)定確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1. 2. 3. 2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)LGB100401產(chǎn)毒的影響 將接種有菌塊的培養(yǎng)液分別置于15、20、25、30和35 ℃培養(yǎng)15 d后取樣，按1.2.1方法制備含毒濾液及純化毒素，通過(guò)生物測(cè)定確定最佳培養(yǎng)溫度。

1. 2. 3. 3 不同pH的培養(yǎng)液對(duì)LGB100401產(chǎn)毒的影響 用10% NaOH和10% HCl分別將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至3、4、5、6、7、8、9和10，分別接入菌塊，置于25 ℃培養(yǎng)15 d后取樣，按1.2.1方法制備含毒濾液及純化毒素，通過(guò)生物測(cè)定確定培養(yǎng)液最佳pH。

1. 2. 3. 4 不同光照處理對(duì)LGB100401產(chǎn)毒的影響 將接種菌塊的培養(yǎng)液分別于24 h光照、24 h黑暗、12 h光照/12 h黑暗3種條件下25 ℃培養(yǎng)15 d后取樣，按1.2.1方法制備含毒濾液及純化毒素，通過(guò)生物測(cè)定確定最佳光照條件。

1. 2. 4 毒素的柱層析分離 在500 mL具存儲(chǔ)球四氟乙烯層析柱中，控制大孔吸附樹(shù)脂（DA201型）與無(wú)菌培養(yǎng)濾液樣量比例為1∶10，流速為2 mL/min；將無(wú)菌濾液上柱后用90%乙醇洗脫至流出液無(wú)色，收集洗脫液，常溫下減壓濃縮為浸膏，大量獲得粗毒素。

100～200目硅膠于110 ℃下烘干2 h后放干燥器中備用。將毒素粗品與硅膠拌樣（毒素∶硅膠=1∶2），在60 ℃水浴濃縮成粉末樣品。采用干法裝柱并上樣，取40 g處理好的樣品緩慢、均勻撒向?qū)游鲋詈笤跇悠繁砻婢徛齼A倒一層石英砂。先用3～4 L的石油醚淋洗柱子，使柱內(nèi)硅膠均勻覆蓋以徹底清除氣泡，同時(shí)沖走油狀雜質(zhì)。再按極性由弱到強(qiáng)的順序用不同的溶劑進(jìn)行梯度洗脫，分別收集。取10 μL洗脫液，采用離體葉片針刺接種的方法檢測(cè)LGB100401毒素對(duì)飛機(jī)草的生物活性，將有活性組分的洗脫液根據(jù)洗脫系統(tǒng)和極性進(jìn)行合并，并再次檢測(cè)其活性。洗脫系統(tǒng)：A、B、C分別按石油醚∶乙酸乙酯=5∶1、5∶3、1∶1混合，D為乙酸乙酯單劑，E、F分別按乙酸乙酯∶甲醇=5∶2、1∶1混合，G為甲醇單劑。

1. 2. 5 植物敏感性測(cè)試 選取健康、長(zhǎng)勢(shì)良好的供測(cè)38種植物成熟葉片，以1 mg/mL毒素溶液按1.2.2的方法接種，于28 ℃培養(yǎng)7 d后，檢查病斑，并以病斑直徑作為植物敏感性指標(biāo)。敏感性分級(jí)（谷祖敏等，2009）：NS為無(wú)病斑，不敏感；LS為刺傷點(diǎn)有輕微的侵染，病斑直徑≤2 mm，輕度敏感；MS為刺傷點(diǎn)有侵染并有擴(kuò)展，病斑直徑3～6 mm，敏感；SS為嚴(yán)重侵染，病斑直徑>6 mm，極敏感。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行單因子分析，利用Tukeys test進(jìn)行均數(shù)間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 培養(yǎng)條件對(duì)LGB100401菌株產(chǎn)毒的影響

液體培養(yǎng)初期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，LGB100401菌株的菌絲快速增長(zhǎng)，產(chǎn)毒能力逐漸增強(qiáng)（圖1-A）。培養(yǎng)至15 d時(shí)，菌絲生長(zhǎng)濃密，培養(yǎng)液變色明顯；生物活性測(cè)定結(jié)果表明，此時(shí)粗毒素導(dǎo)致的病斑直徑最大，與第5、10、25和30 d的病斑直徑存在顯著差異（P<0.05，下同），說(shuō)明此時(shí)菌株的產(chǎn)毒量最多。培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)15 d后，病斑直徑逐漸減小，表明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)菌株產(chǎn)毒量逐漸減少，毒素致病力緩慢下降。

培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)毒有較大影響（圖1-B），培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)毒素導(dǎo)致的病斑直徑最大，與其他溫度處理存在顯著差異，說(shuō)明最適宜LGB100401產(chǎn)毒的溫度為25 ℃。

培養(yǎng)液pH在5～8時(shí)毒素的活性最強(qiáng)，4個(gè)處理的病斑直徑差異不顯著（P>0.05），表明培養(yǎng)液pH在5～8時(shí)有助于LGB100401菌株產(chǎn)毒（圖1-C）。

光暗交替培養(yǎng)下LGB100401菌株產(chǎn)生毒素活性最強(qiáng)，以全光照處理最差，兩處理間存在顯著差異（圖1-D）。

2. 2 柱層析結(jié)果

LGB100401菌株洗脫劑系統(tǒng)每500 mL收集1次，洗脫系統(tǒng)A～G分別收集12、11、10、10、10、11和6瓶洗脫組分。以離體葉片針刺法對(duì)每一瓶組分進(jìn)行生物活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)主要活性集中在洗脫系統(tǒng)B的第5～7瓶組分、洗脫系統(tǒng)C的第3～4瓶組分、洗脫系統(tǒng)E的第2～8瓶組分、洗脫系統(tǒng)F的第1～5瓶組分，分別將上述洗脫液合并后接種飛機(jī)草，3 d后洗脫系統(tǒng)B、C、E、F洗脫液均能使飛機(jī)草離體葉片產(chǎn)生明顯病斑，其中以E系統(tǒng)（乙酸乙酯∶甲醇=5∶2）洗脫液處理產(chǎn)生的病斑最大，對(duì)飛機(jī)草的抑制效果最佳（圖2）。因此，E洗脫系統(tǒng)為最佳洗脫劑，采用硅膠柱層析梯度洗脫法可大量分離純化鏈格孢毒素。

2. 3 毒素的殺草譜和作物安全性評(píng)價(jià)結(jié)果

室內(nèi)離體葉片接種法測(cè)定結(jié)果（表1）表明，LGB100401菌株分泌的毒素對(duì)供試植物具有選擇毒性，1 mg/mL毒素溶液可引起寄主植物和部分非寄主植物葉片萎蔫和壞死。接種毒素后3 d，32種供試雜草中對(duì)鏈格孢粗毒素不敏感（NS）的有17種，占53.125%；稍敏感（LS）4種，占12.500%；敏感（MS）7種，占21.875%；極敏感（SS）4種，占12.500%，分別為飛機(jī)草、馬唐、羽芒菊和賽葵。供試的6種作物中只有水稻表現(xiàn)為MS，占16.667%，其他5種作物不敏感或表現(xiàn)輕微癥狀。表現(xiàn)較突出的是菊科植物，有4種表現(xiàn)為極敏感（SS）或敏感（MS）。測(cè)定結(jié)果表明，除飛機(jī)草外，LGB100401毒素對(duì)其他3種田間重要雜草馬唐、羽芒菊和賽葵也有較高的除草活性，具有潛在生物除草劑效能。

3 討論

據(jù)報(bào)道，一般真菌粗毒素含有脂類(lèi)、糖類(lèi)、蛋白類(lèi)、雜環(huán)等大量物質(zhì)，每種物質(zhì)極性不一，彼此間極可能存在拮抗或增效等作用，且不同植物對(duì)其組分敏感性不同；而粗毒素的有效成分一般由多種組分協(xié)同作用對(duì)植物造成傷害（Ostry，2008）。本研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌株LGB100401產(chǎn)生的毒素對(duì)飛機(jī)草具有較高的除草活性，對(duì)海南省常見(jiàn)的雜草羽芒菊、馬唐和賽葵也具有很強(qiáng)的毒性，且該粗毒素對(duì)大多數(shù)供試植物毒性低，表現(xiàn)出較高的選擇性，具有潛在的生防價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，鏈格孢菌株LGB100401產(chǎn)毒的最佳條件是25 ℃、pH 4～6、培養(yǎng)時(shí)間15 d及光暗交替培養(yǎng)，在培養(yǎng)15 d后毒素的產(chǎn)生量達(dá)峰值后隨著時(shí)間延長(zhǎng)漸漸減少。在不同培養(yǎng)條件下鏈格孢產(chǎn)毒能力顯著不同，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)及培養(yǎng)條件直接影響植物病菌的產(chǎn)毒及產(chǎn)生毒素的量，與前人的研究結(jié)論（Zonno et al.，2008；郭霞等，2009）一致。粗毒素經(jīng)過(guò)極性適宜的有機(jī)溶劑萃取和濃縮，可濾過(guò)除去大部分雜質(zhì)，同時(shí)其中包含的多種活性組分得以充分提取和富集，從而發(fā)生協(xié)同作用，使得對(duì)飛機(jī)草的活性增強(qiáng)。采用大孔樹(shù)脂對(duì)粗毒素進(jìn)行大量富集，再用硅膠柱層析梯度洗脫方法適用于鏈格孢毒素分離純化，與周兵等（2007）的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明， LGB100401菌株具有開(kāi)發(fā)為飛機(jī)草生物除草劑的潛力。該菌株潛在的應(yīng)用價(jià)值及安全性等深入研究及更詳細(xì)的信息有待今后進(jìn)一步探討。本研究結(jié)果有助于了解飛機(jī)草鏈格孢分泌的毒素對(duì)雜草的生物控制作用，為今后鏈格孢毒素的鑒定、開(kāi)發(fā)，以及飛機(jī)草的生物防治打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

飛機(jī)草鏈格孢菌株LGB100401可產(chǎn)生大量毒素，該毒素對(duì)飛機(jī)草具有較高的抑制活性，且對(duì)植物具有選擇作用特性。LGB100401菌株可作為飛機(jī)草生物防治的候選物加以研究。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）