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    線粒體ATP敏感性鉀通道、一氧化氮合酶在四氫生物蝶呤保護再灌注心肌中的作用

    2009-02-18 09:11鐘煥清陳海生
    中國實用醫(yī)藥 2009年1期

    鐘 標 鐘煥清 陳海生

    【摘要】目的 研究線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道(mitoKATP)、一氧化氮合酶(NOS)在四氫生物蝶呤(BH4)減輕心肌缺血再灌注損傷(MIRI)中的作用。 方法將64只成年大白兔隨機分成4組,建立Langendorff模型灌注其離體心臟,加入不同成分的K-H液灌流、停跳、復灌,觀察冠脈流量(CF),測定冠脈流出液肌酸激酶(CK)的含量以及心室肌NO含量。 結(jié)果用含BH4的K-H液灌注的組Ⅱ再灌注后的CF、心肌NO含量增加,冠脈流出液中CK的含量降低。使用含NOS抑制劑L-NAME或mitoKATP抑制劑5-HD預處理,使CF降低,冠脈流出液中CK的含量升高,同時L-NAME預處理后的心肌組織NO含量較其它組下降,各差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論外源性BH4具有抗MIRI的作用,而mitoKATP、NOS參與了這種作用。提高NOS的活性,促進內(nèi)源性NO的產(chǎn)生,mitoKATP的開放是保護作用的可能機制。

    【關鍵詞】四氫生物蝶呤;心肌缺血再灌注損傷; 三磷酸腺苷敏感性鉀通道;

    一氧化氮合酶

    Role of the tetrahydrobiopterin in Myocardial preconditioning: Possible Involvement of Mitochondrial KATP Channels and Nitric Oxide Synthase

    ZHONG Biao1, ZHONG Huan-qing2, CHEN Hai-sheng2.

    1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou, Guangdong Province, 516000, China

    2.Department of Cardiovascular Surgery, Gaozhou Peoples Hospital, Maoming, Guangdong Province, 525200, China

    【Abstract】ObjectiveTo study the effect of tetrahydrobiopterin(BH4),5-hydroxydecanoate (5-HD) and Nω- nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) on langendorff rabbit heart model. MethodsSixty-four mature rabbits were randomly divided into four groups. The hearts in vitro removed to Langendoff equipment, then perfused with different buffer solution base on the Krebs-Henseleit buffer(KHB) for 30min. Then cardiac arrest was induced for 30min followed by 60min reperfusion. Coronary flow(CF) was recorded. Coronary effluent solution was collected for CK measurion. The dynamic change of myocardial NO content was measured. ResultsBy the treatment with BH4, CF was significantly increased, and CK was decreased than other groups after reperfusion(P<0.05). By the pre-treatment with L-NAME, a specific inhibitor of nitric oxide synthase, or 5-HD, a specific inhibitor of mitochondrial ATP-sensitive potassium channel(mitoKATP channel), CF was significantly decreased, and CK was increased than other groups after reperfusion. By the pre-treatment with L-NAME, NO levels were decreased than other groups(P<0.05). ConclusionsThese findings suggest that BH4 has a cardioprotective effect against myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) in vitro. The protective effect of BH4 appeared to be involved in the opening of mitoKATP channels and the activating NOS then increase the NO production.

    【Key words】 Tetrahydrobiopterin; Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury; ATP-Sensitive Potassium Channels; Nitric Oxide Synthase

    BH4是所有NOS同功酶的輔助因子,具有穩(wěn)定NOS結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定NOS活性二聚體、增加L-精氨酸和NOS結(jié)合力、促進NO的合成與釋放等作用,與內(nèi)皮功能密切相關[1,2]。外源性補充BH4能保護缺血再灌注心肌[3],但是具體作用機制仍不清楚。本實驗通過觀察四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)、5-羥基癸酸鹽(5-hydroxydecanoate, 5-HD) 和左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)對缺血再灌注心臟冠脈流量(coronary flow, CF)、一氧化氮(nitric oxide, NO)含量、肌酸激酶(creatine kinase, CK)的影響,研究線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, mitoKATP) 、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)對四氫生物蝶呤減輕心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)作用的影響,探討四氫生物蝶呤保護缺血再灌注心肌作用的可能機制。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物與分組

    健康成熟的大白兔64只(廣東醫(yī)學院動物中心提供,體質(zhì)量2.0~2.5 kg,雄雌各半),隨機數(shù)字表法隨機分入對照組(組Ⅰ)和BH4組(組Ⅱ)、BH4+ L-NAME組(組Ⅲ)、BH4+5-HD組(組Ⅳ),每組16只。

    1.2 主要儀器和試劑

    自制Langendorff離體心臟灌注裝置,全自動生化分析儀(美國Beckman公司, CX-4 型),L-NAME、5-HD、BH4購自美國Sigma公司。NO檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司。

    1.3 離體心臟Langendorff灌流模型

    實驗動物3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,肝素鈉(150 IU/kg)抗凝后,迅速開胸取出心臟,立即浸入4℃ K-H液中,排盡殘血,連接于Langendorff模型灌注裝置上,以37℃ K-H液經(jīng)主動脈插管逆行灌注30 min,灌注壓恒定為70 cm H2O,灌注液持續(xù)通入95%O2-5%CO2混合氣(流量3 L/min)。停搏前20 min BH4+ L-NAME組(組Ⅲ)、BH4+5-HD組(組Ⅳ)分別用加入L-NAME、5-HD的K-H液進行灌注10min。停搏前10 min BH4組(組Ⅱ)、BH4+ L-NAME組、BH4+5-HD組均用加入BH4的K-H液灌10 min。經(jīng)30 min灌流后,灌注40 ml 4℃ St. Thomas心臟停搏液進行停搏,時間30 s。心臟停跳期間溫度保持在37℃~38℃。心臟缺血30 min后,以37℃ K-H液再灌注60 min。

    BH4、5-HD、L-NAME最終濃度為10、100、100 μmol/L。

    1.4 觀察指標及方法

    1.4.1 在灌注10min、再灌注10 min、再灌注30 min、再灌注60 min4個時點收集冠脈流出液記錄冠脈流量CF。

    1.4.2 全自動生化分析儀分析上述4個時點冠狀動脈流出液CK含量。

    1.4.3 分別取缺血30 min、再灌注60 min的心室肌,硝酸還原酶法測定心肌組織NO含量。

    1.5 統(tǒng)計學處理

    數(shù)據(jù)以均值±標注差( ±s)表示,用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間、組內(nèi)數(shù)據(jù)比較均用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1與對照組相比,用含BH4的K-H液灌注的組Ⅱ再灌注后的CF、心肌組織NO含量增加(P<0.05),冠脈流出液中CK含量降低(P<0.05)(表1-表3)。

    2.2使用含NOS抑制劑L-NAME(組Ⅲ)或mitoKATP抑制劑5-HD(組Ⅳ)預處理,與組Ⅱ相比,CF降低(P<0.05),冠脈流出液中CK的含量增加(P<0.05),同時組Ⅲ的心肌組織NO含量較其它組下降(P<0.05)( 表1-表3)。

    3 討論

    內(nèi)、外源性NO在缺血預適應(ischemia preconditioning, IP)心肌保護中(包括早期、第二期)起重要作用,不僅是觸發(fā)因子,也是效應因子[4]。機體內(nèi)產(chǎn)生的NO是由NOS催化非必需氨基酸左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)和O2生成的。BH4是所有NOS同功酶的輔助因子 [1-2]。內(nèi)源性NO的生成量嚴格依賴適當?shù)腂H4水平[5]。BH4水平的減少可導致NOS功能失調(diào),產(chǎn)生過量的氧自由基而代替NO的產(chǎn)生,進而導致內(nèi)皮和心肌細胞功能降低[6]。

    CK絕大部分存在于心肌細胞胞漿內(nèi),心肌細胞以外含量甚微,是一種心肌特異性酶。所以,檢測冠脈回流液中CK的含量可以反映心肌酶漏出的程度,間接反映心肌損傷程度[7]。CF的多少則可反映冠狀動脈的擴張程度,從而觀察冠脈內(nèi)皮細胞的功能和損傷程度。

    mitoKATP被公認為是心肌保護作用中的一個關鍵環(huán)節(jié)[8]。mitoKATP的開放不僅參與IP的第一窗保護作用,而且也參與第二窗保護作用,不僅能作為啟動因子誘導IP,同時也是IP重要的效應器。它的開放能減輕MIRI [9]。

    實驗結(jié)果提示外源性BH4可提高NOS的活性,促進內(nèi)源性NO的產(chǎn)生,發(fā)揮NO對心肌和冠狀血管內(nèi)皮的保護作用,減少CK的漏出,增加CF。表明BH4能增強冠脈系統(tǒng)的擴張,有利于停搏液在心肌的均勻分布和降溫,而在再灌注時則促進有害物質(zhì)排出,減輕心肌酶的漏出,從而減輕心肌損傷,而這種保護作用也與mitoKATP的開放有關。

    參考文獻

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