豬繁殖與呼吸綜合征病毒RFLP 1-4-4 L1C株的分離鑒定及其遺傳演化分析

田笑笑，黃昕怡，夏大松，王海偉，田志軍，蔡雪輝，安同慶

（中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and re-spiratory syndrome，PRRS）是由PRRS 病毒（PRRS vi-rus，PRRSV）引起的，以妊娠母豬繁殖障礙和各生長階段豬呼吸道癥狀為主的嚴重影響世界養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。PRRSV 屬于套式病毒目、動脈炎病毒科成員，可分為兩個屬，Betaarterivirus suid 1（歐洲型PRRSV）和Betaarterivirus suid 2（北美洲型PRRSV）[1]。我國于1996 年首次發(fā)現PRRS[2]，隨后在我國各主要養(yǎng)豬省份均有該病的發(fā)生。2006 年以來，我國相繼出現了高致病性PRRSV（HP-PRRSV）變異株[3-4]、類NADC30 株[5-6]、類NADC34 株[7-8]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。

PRRSV 遺傳多樣性復雜，病毒基因組中的ORF5和NSP2 是兩個高變異區(qū)[9]。為了區(qū)分PRRSV 野毒株與VR-2332 株的傳代致弱疫苗株，美國研究人員建立了PRRSV ORF5 基因的限制性片段多態(tài)性（Restric-tion fragment length polymorphism，RFLP）分類方法，該方法根據MluI、Hinc II 和SacII 酶切ORF5 基因后的DNA 片段長度和數量對PRRSV 分類和命名[10]。該方法是使用3 個數字分別代表ORF5 基因3 種酶切位點（MluI、Hinc II 和SacII）的數量和位置。例如：1-4-4 模式代表1（MluI=0）、4（Hinc II=nt88、nt219）和4（SacII=nt24、nt555）。RFLP 分類方法在美國養(yǎng)豬從業(yè)者使用較多，2007 年～2019 年美國有228 種RFLP模式的PRRSV，數量較多的RFLP 模式依次是RFLP 2-5-2（VR-2332 株傳代致弱疫苗株為該模式）、1-7-4、1-4-4 和1-8-4，其中RFLP 1-7-4 是近年來的優(yōu)勢流行模式[12]。另外一種分類方法是根據ORF5 基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹和序列之間的同源性，將北美洲型PRRSV 分為9 個分支譜系，L1～L9[11]，其中，L1 可進一步劃分為L1A～L1H。

2020 年10 月以來，美國明尼蘇達州和衣阿華州突然出現大量的妊娠母豬流產、產木乃伊胎，伴有成年母豬的死亡；斷奶仔豬高熱、死亡率高達15%～30%；育肥豬生長緩慢并有呼吸道癥狀[13-14]，該病迅速擴散周邊多個州，現有疫苗對其保護效果不理想，經研究發(fā)現病原是PRRSV RFLP 1-4-4 lineage 1C（L1C）變異株[13]。我國尚無RFLP 1-4-4 L1C 變異株的相關報道。鑒于我國有從美國引種和進口冷凍豬肉的貿易，以及美國的NADC30 株、NADC34 株已經傳入我國[5,15]，因此在我國開展RFLP 1-4-4 L1C 的遺傳演化分析非常必要。本研究對我國2016 年～2021 年從黑龍江、廣東和山東等15 個省份多個豬場采集的共219 份臨床發(fā)病豬樣品采用PRRSV ORF5 基因RTPCR 方法檢測，并對PRRSV 陽性樣品ORF5 基因測序用于RFLP 模式分析，將PRRSV ORF5 基因RFLP 1-4-4 的陽性病料樣品豬肺泡巨噬細胞（PAM）分離到一株PRRSV，采用PCR 擴增分離病毒的全基因組并測序拼接；分析其同源性、遺傳演化及其NSP2 氨基酸序列特征和全基因組的重組事件。同時還分析了1996 年～2021 年我國PRRSV RFLP 1-4-4 株在時間和地理上的分布，比較我國與其他國家PRRSV 的RFLP 模式。為了解我國RFLP 1-4-4 模式PRRSV 的流行情況提供了重要參考數據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料參考郭寶清等的方法[2]制備PAM，用于制備PAM 的4 周齡SPF 豬購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物基地；Marc-145細胞、PRRSV HuN4 株由本實驗室保存；PRRSV M蛋白單克隆抗體（MAb）3F7 由哈爾濱獸醫(yī)研究所王倩博士惠贈；FITC 標記的羊抗鼠IgG 購自Sigma-Aldrich公司；病毒核酸提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit 購 自QIAGEN 公 司；Recombinant RNase Inhibitor、Reverse Transcriptase M-MLV 和PremixTaq購自TaKa-Ra 公司。

1.2 臨床樣品的PRRSV 檢測及其ORF5 基因的測序2016 年～2021 年間，從黑龍江、廣東和山東等15 個省多個豬場共采集219 份臨床發(fā)病豬的病料樣品，取組織研磨后的上清液提取病毒RNA，反轉錄為cDNA 作為模板，按照本實驗室建立的PRRSV ORF5 基因RT-PCR 方法檢測，引物序列和反應條件均參考文獻[16]，擴增產物由吉林庫美生物科技有限公司測序。

1.3 PRRSV ORF5 基因的RFLP 模式分類根據Wesley 等建立的PRRSV ORF5 基因RFLP 分類方法[10]，對PRRSV 陽性樣品的ORF5 基因序列進行分類。

1.4 PRRSV 的分離與鑒定取PRRSV ORF5 基因為RFLP 1-4-4 的陽性病料樣品組織研磨液以8 000 r/min離心5 min 后取上清，用0.22 μm 濾器過濾除菌后接種PAM，5% CO237 ℃培養(yǎng)72 h 后收集上清液，繼續(xù)在PAM 中連續(xù)傳3 代后，取病毒液接種Marc-145 細胞，72 h 后收集上清液。對PAM 連續(xù)傳3 代后的上清液及Marc-145 細胞的上清液提取病毒RNA，反轉錄為cDNA 作為模板，按照1.2 RT-PCR 方法擴增分離病毒的ORF5 基因；將上述收獲病毒上清液后的PAM 和Marc-145 細胞分別經無水乙醇固定，經PBST洗3 次后，以PRRSV M 蛋白MAb 3F7 為一抗，FITC標記羊抗鼠IgG（1：200）為二抗，室溫孵育1 h，以不接種病毒的相應細胞作為陰性對照，以接種HuN4 病毒的細胞作為陽性對照，經間接免疫熒光試驗（IFA）鑒定。

1.5 分離病毒的全基因組測序及序列分析提取分離病毒的RNA 反轉錄為cDNA 作為模板，按照Zhou等的引物和方法對其基因組分成8 個重疊的片段進行PCR 擴增[3]，PCR 產物分別克隆至pMD18-T 載體中，并經PCR 鑒定為陽性的質粒由吉林庫美生物科技有限公司測序。序列經DNAStar 軟件包中的Seq-Man拼接。利用MegAlign 軟件分析分離株的全基因組序列和各ORF 基因序列分別與PRRSV 代表株（CH-1a、JXA1、NADC30、NADC34、GM2 和VR-2332）及美國RFLP 1-4-4 L1C 變異株的相應基因序列的同源性；利用MEGA6.0 軟件對分離株、美國新發(fā)1-4-4 L1C 變異株及PRRSV 各分支參考株（L1A～L1H、L3、L5 和L8）的ORF5 基因序列繪制系統(tǒng)發(fā)生樹（ML 法），分析分離病毒的遺傳進化關系；參考Yu 等的方法[17]，利用MegAlign 對分離病毒NSP2 的氨基酸序列比對分析；利用RDP4 重組分析軟件對分離株全基因組序列進行重組分析。

1.6 1996 年～2021 年我國PRRSV RFLP 1-4-4 的時間和地理分布為了確定PRRSV RFLP 1-4-4 L1C 在我國的流行情況，本研究將PRRSV 陽性臨床樣品中測序獲得的41 條ORF5 基因序列，連同GenBank 中1996 年～2021 年我國3 125條北美洲型PRRSV ORF5基因序列，共計3 166條，參照上述的PRRSV RFLP 1-4-4模式和L1C 分支譜系劃分依據分類[11]。根據分類結果、病毒株的采集時間和省份，對我國RFLP 1-4-4 L1C株進行了時間和地理分布的分析。

1.7 我國與其他國家PRRSV RFLP 模式的比較分析為了進一步了解近年來我國PRRSV 流行株的各種RFLP 模式，以及和同時期國外流行株RFLP 模式的差異，本研究下載了2016 年～2021 年GenBank 中所有北美洲型PRRSV ORF5 基因序列（共計1 918條），分別來自美國、中國、加拿大等7 個國家。按照PRRSV RFLP 分類方法分類[10]，分析比較2016 年以來不同國家之間PRRSV RFLP 的模式特點。

2 結 果

2.1 臨床樣品中PRRSV 的檢測結果對15 個省的豬場采集的219 份臨床樣品經PRRSV ORF5 基因RTPCR 檢測，結果顯示，檢測出41份PRRSV 陽性樣品，占比18.72%，對陽性樣品擴增產物測序并采用RFLP分型結果顯示，其中有1 份來自黑龍江省的PRRSV 陽性臨床樣品的ORF5基因為RFLP 1-4-4模式。

2.2 PRRSV 的分離與鑒定結果將ORF5 基因為RFLP 1-4-4 模式的PRRSV 陽性病料樣品研磨液接種PAM，48 h 后部分細胞出現破碎和脫落。在PAM 中傳至3 代后，接種Marc-145 細胞。72 h 后收獲兩種細胞的上清液分別經RT-PCR 檢測，結果顯示僅PAM 上清液中檢測到PRRSV 目的基因（圖1A）；將上述PAM、Marc-145 細胞固定后，利用PRRSV M 蛋白MAb 進行IFA 鑒定。結果顯示，僅PAM 中有特異性綠色熒光，接種病毒的Marc-145 細胞（結果未展示）和未接種病毒的對照細胞均無該綠色熒光（圖1B）。上述結果表明，本研究從上述PRRSV 陽性病料樣品中分離到了一株PRRSV RFLP 1-4-4 株，且該PRRSV能夠在PAM 中增殖，不能在Marc-145 細胞中增殖，將該分離株命名為HLJ-80。

圖1 分離病毒的RT-PCR（A）及IFA（B，在PAM中分離）的鑒定結果Fig.1 Identification results of RT-PCR(A)and IFA(B,in PAM cells)of isolated viruses

2.3 HLJ-80 株全基因組序列的同源性分析以分離病毒HLJ-80 株的cDNA 為模板，經PCR 分段擴增其基因組并測序，利用SeqMan 軟件對測序結果拼接后獲得了該病毒的全基因組序列。結果顯示，HLJ-80株基因組全長為15 013 nt（不含3'末端的poly A），全基因組序列提交GenBank獲得登錄號為MN046222。HLJ-80 株 與PRRSV 代 表 株（CH-1a、 JXA1、 NADC30、NADC34、GM2 和VR-2332）的全基因組序列同源性分析結果顯示，HLJ-80 株與NADC30 株的同源性最高，為93.3%，與其他代表株的同源性均低于90%。各ORF 基因序列的同源性分析結果顯示，除ORF2 基因與VR-2332 株ORF2 基因同源性最高（97.5%）外，其余各基因均與NADC30 株同源性最高（90.6%～99.3%）。NSP2 氨基酸序列的比對分析結果顯示，與VR-2332 株相比，HLJ-80 株NSP2 存在131 個氨基酸（111+1+19）的不連續(xù)缺失，缺失位置與NADC30 株一致。上述結果表明，HLJ-80 株與NADC30 株同源性較高，且其NSP2 氨基酸缺失特征與NADC30 株一致。

2.4 HLJ-80 株的重組特征分析以L1～L9 分支的PRRSV 代表株（分別為NADC30、XW008、MD001、EDRD-1、VR-2332、 P129、JXA1 和MN30100）為親本株，利用RDP4 軟件分析HLJ-80 株基因組中可能存在的重組事件，結果顯示，HLJ-80 株是以NADC30 株為主要親本、VR2332 株為次要親本的重組病毒株。根據初步分析的重組斷點，將HLJ-80 株基因組的主要親本片段、次要親本片段分別利用BLAST 檢索與該株病素相應基因序列同源性較高的潛在親本株。結果顯示，HLJ-80 株主要親本片段與PRRSV 2014-81 株同源性最高，次要親本片段與PRRSV SD53-1603 株同源性最高，二者的分離時間均早于HLJ-80 株。隨后以PRRSV 2014-81 株和SD53-1603 株為參考序列重新采用RDP4 進行重組分析，結果顯示，重組斷點有4 個，將HLJ-80 株分為兩個明顯的重組區(qū)域分別為nt1 601～nt3 101和nt9 001～nt14 921（圖2）。表明HLJ-80株有可能與PRRSV 2014-81 株、SD53-1603 株的高度同源的病毒株重組而來。

圖2 PRRSV HLJ-80株的重組分析Fig.2 Recombination analysis of PRRSV HLJ-80 strain

2.5 HLJ-80 株的遺傳演化分析利用MEGA6.0 軟件對HLJ-80 株、美國新發(fā)1-4-4 L1C 變異株和各分支代表株（L1A～L1H、L3、L5 和L8）的ORF5 基因構建遺傳進化樹。結果顯示，HLJ-80 株屬于L1C 分支（圖3），即HLJ-80 株屬于RFLP 1-4-4 L1C 株。HLJ-80 株與美國RFLP 1-4-4 L1C 變異株雖然同屬于L1C分支，但處于不同的分支（圖3）；全基因組同源性分析結果顯示，HLJ-80 株與美國1-4-4 L1C 變異株同源性為93.4%，表明HLJ-80 株與美國1-4-4 L1C 變異株不是同一株病毒。

圖3 基于PRRSV ORF5基因構建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PRRSV based on ORF5 gene sequences

2.6 1996 年～2021 年我國PRRSV RFLP 1-4-4 株的時間和地理分布1996 年～2021 年，GenBank 中共有3 125 條PRRSV ORF5 基因序列來自我國，加上本研究測序獲得的41 條，共計3 166 條ORF5 基因序列。根據PRRSV RFLP 分類依據分類和RFLP 1-4-4 株的統(tǒng)計分析。結果顯示，我國共有260 條ORF5 基因屬于（8.2%）RFLP 1-4-4 模式株。將該260 條RFLP 1-4-4 模式株ORF5 基因序列進行分支譜系劃分，結果顯示其中217 條屬于L1C 分支（217/260，83.46%），其余為L8和L1A分支（圖4A）。在時間上，PRRSV RFLP 1-4-4 模 式 在2003 年 就 已 存 在（HZ-X 株，GenBank AY450301），屬于L8 分支；在2006 年～2009 年間該模式的PRRSV均屬于L8分支，2010年～2013年間則為L8和L1A分支共存；2014年以后RFLP 1-4-4株的數量迅速增多，且絕大多數PRRSV 屬于L1C 分支。在地理分布上，RFLP 1-4-4 L1C 分支主要分布在河南、廣東和山東，分別占總數的31.15%、10%和5.38%，各省該類病毒株數量依次為河南（n=81）、廣東（n=26）、山東（n=14）、福建（n=14）、江蘇（n=13）、四川（n=11）、黑龍江（n=10）、新疆（n=7）、河北（n=6）、江西（n=6）、安徽（n=5）、廣西（n=5）、山西（n=5）、浙江（n=5）、北京（n=3）、湖北（n=2）、貴州（n=1）、吉林（n=1）、上海（n=1）和中國臺灣（n=1）（圖4B）。表明PRRSV RFLP 1-4-4 L1C分支早已出現在我國多個省份。

圖4 1996年～2021 年中國PRRSV RFLP 1-4-4株的系統(tǒng)進化樹及時間與地理分布Fig.4 Phylogenetic and spatiotemporal distribution of PRRSV RFLP 1-4-4 strains in China

2.7 我國與國外PRRSV 流行株RFLP 模式的比較分析統(tǒng)計2016 年～2021 年GenBank 中所有北美洲型PRRSV ORF5 基因序列的數量，從多到少依次為美國（n=1 167）、中國（n=635）、加拿大（n=65）、印度（n=29）、秘魯（n=12）、韓國（n=7）和越南（n=3），共7 個國家1 918 條ORF5 基因序列。RFLP 分類結果顯示，這些病毒株共有36 種RFLP 模式（圖5A）。我國PRRSV 共有23 種RFLP 模式，美國28 種，加拿大11種，印度等國家RFLP 模式種類較少（圖5B）。從分離年份上，2016 年～2018 年RFLP 模式復雜多樣，2019 年～2021 年，各 國 上 傳GenBank 的PRRSV 序 列較少（其中加拿大、印度和秘魯等國家未上傳PRRSV序列），該年間RFLP 模式較為單一，主要為1-4-4、1-4-2、1-4-3、1-2-4、1-7-4、2-5-2、1-3-4 和1-8-4（圖5C）。具體而言，RFLP 1-7-4 的數量最多（n=498），占25.96%，主要分布在美國、中國和秘魯。RFLP 1-4-3 株數量其次，占16.53%，主要分布在美國、中國、印度和越南，也是我國的優(yōu)勢RFLP 模式。RFLP 1-4-4分布最廣泛，除越南和印度外，該模式在上述5個國家均有分布；其中我國的數量最多（n=159，含中國臺灣1條），美國其次（n=129）。上述結果表明，中美兩國PRRSV RFLP 模式較多，且PRRSV RFLP 1-4-4 模式早已存在于多個國家。

圖5 2016年～2021年各國PRRSV RFLP模式及分布特征Fig.5 Classification and distribution of PRRSV ORF5 RFLP patterns from 2016 to 2021

3 討 論

2020 年10 月，美國出現RFLP 1-4-4 L1C 變異株，該變異株ORF5 基因發(fā)生了重組[18]，其大部分序列來自L1C 分支，所以在進化樹中該株病毒被劃分為L1C 分支，且在L1C 進化樹中形成單獨的一個分支。因有別于其他RFLP 1-4-4 L1C 株，被稱為RFLP 1-4-4 L1C 變異株。目前我國尚無RFLP 1-4-4 L1C 變異株的相關報道。本研究從219 份疑似PRRSV感染的臨床樣品中分離出一株PRRSV RFLP 1-4-4 L1C 株，命名為HLJ-80 株。不同于美國1-4-4 L1C變異株NSP2 蛋白存在100 個氨基酸的連續(xù)缺失[18]，HLJ-80 株與NADC30 株同源性較高且NSP2 蛋白均為131 個氨基酸（111+1+19）的不連續(xù)缺失。遺傳演化分析結果顯示，HLJ-80 株雖與美國1-4-4 L1C 變異株同屬于L1C 分支，但兩者全基因組序列的同源性僅為93.4%。綜上，本研究分離的HLJ-80 株與美國1-4-4 L1C 變異株并不是同一株病毒。

為了解我國PRRSV RFLP 1-4-4 株的流行情況，本研究分析了1996 年～2021 年我國3 166 條PRRSV ORF5 基因，發(fā)現我國共有260 條（8.2%）ORF5 基因屬于RFLP 1-4-4 模式，其中217 條屬于L1C 分支（217/260，83.46%），其余為L8 和L1A 分支。由此可見，即使RFLP 模式相同的病毒株，它們之間的基因序列也可能存在很大的差異，這是由于PRRSV 的RFLP 分類是依據某些限制性內切酶酶切位點的數量和位置來命名的[10]，在酶切位點中個別堿基的突變，即可改變RFLP 的模式。例如，美國RFLP1-4-4 大部分屬于L1C 分支，也有L1A 分支、L5 分支以及L7～L9 分支[12]，因此RFLP 模式不能反映ORF5 基因更多的遺傳信息，更不能作為判定是否為美國變異株的唯一標準。美國將這兩種分類方法結合起來，對新出現的病毒命名為RFLP 1-4-4 L1C 變異株，更多地體現出了該株病毒的遺傳進化位置。

為進一步比較近年來國內外流行株RFLP 模式的差異，本研究分析了2016 年～2021 年國內外1 918 條PRRSV ORF5 基因，RFLP 分類結果顯示，這些病毒共有36 種RFLP 模式，中美兩國PRRSV RFLP 模式最多，這是PRRSV 在豬群中不斷遺傳演化的結果，印度等國家RFLP 模式種類較少，可能與這些國家上傳到GenBank 中的ORF5 基因序列數量較少有關。此外，在上傳序列至GenBank 的國家中（除越南和印度）均發(fā)現了RFLP 1-4-4 株，但無類似美國RFLP 1-4-4 L1C 變異株導致大規(guī)模發(fā)病的報道。其原因可能包括以下幾方面，RFLP 分類和分支譜系分類均是基于ORF5 基因，該基因序列長度僅占PRRSV 全基因組的4%，僅能反映PRRSV 的部分遺傳信息；重組賦予了病毒更復雜的生物學特性，RFLP 1-4-4 L1C 變異株[13]、中國農業(yè)大學研究團隊從山東某豬場分離的L1 分支的RFLP 1-4-4 株[14]與本研究中分離的RFLP 1-4-4 L1C 株均屬于重組病毒，且重組的親本株和位置不一；另外，研究表明PRRSV 對豬的致病性更多受PRRSV 在豬體內復制效率的影響[19]。

我國和美國的養(yǎng)豬規(guī)模居世界前列，PRRSV 流行株也較其他國家更為復雜多樣。本研究發(fā)現PRRSV RFLP 1-4-4 模式早已在多個國家存在，這些病毒的全基因組序列與美國新出現的RFLP 1-4-4 L1C 變異株全基因組序列有很大的差異。目前國內尚未發(fā)現與美國RFLP 1-4-4 L1C 變異株基因組序列高度同源的PRRSV。鑒于我國有從美國、加拿大引種和進口冷凍豬肉制品的貿易，以及有美國PRRSV傳入我國的先例，因此有必要加強引種和進口冷凍豬肉制品的出入境檢驗檢疫、加強國內豬群的流行病學監(jiān)測、及與美國相關疫控部門或研究人員的信息溝通，共同抵御RFLP 1-4-4 L1C變異株的傳播。本研究為了解我國RFLP 1-4-4模式PRRSV的流行情況提供了重要參考數據，為我國PRRSV的防控提供數據參考。