• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    膜聯(lián)蛋白A7表達(dá)抑制對HepG-2細(xì)胞中g(shù)alectin-3及PKC 表達(dá)的影響

    2015-12-19 07:10:42田煥娜王小杰梁秀軍劉蘭芳
    關(guān)鍵詞:空白對照陰性肝癌

    田煥娜 王小杰 梁秀軍 陳 龍 劉蘭芳 李 欣*

    (1承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,承德067000;2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,河北067000)

    膜聯(lián)蛋白A7(annexin A7,ANXA7)是膜聯(lián)蛋白家族成員,該家族成員具有廣泛的生物學(xué)功能,包括膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分化、凋亡、生長調(diào)節(jié)及鈣離子信號途徑等[1-2]。.ANXA7除具有該家族典型的磷脂結(jié)合特性、Ca2+通道形成特性等外,其在多種腫瘤組織中出現(xiàn)了表達(dá)改變。研究發(fā)現(xiàn),ANXA7表達(dá)異常與前列腺癌[3]、乳腺癌[4]、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤[5]以及多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤[6]的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在肝癌中,ANXA7的表達(dá)顯著增高與肝癌進展成正相關(guān),當(dāng)抑制了ANXA7的表達(dá)后,肝癌細(xì)胞的移動和侵襲性顯著下降,細(xì)胞凋亡率增高,而且在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞,但是ANXA7在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制并不清楚。我們先前的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)抑制肝癌細(xì)胞系HepG-2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)后,HepG-2細(xì)胞出現(xiàn)了增殖抑制[7]。半乳糖凝集素家族成員galectin-3的高表達(dá)與多種腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān),其具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

    本研究在前期工作基礎(chǔ)上,采用人肝癌細(xì)胞系HepG-2細(xì)胞為研究對象,在抑制ANXA7表達(dá)后檢測galectin-3的表達(dá)改變;用PKC激活劑PMA處理ANXA7表達(dá)受抑的細(xì)胞,檢測ANXA7及PKC表達(dá)變化,為深入探索ANXA7在肝癌中的作用機制研究提供基礎(chǔ)。

    材料和方法

    1.試劑和儀器設(shè)備

    轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、靶向ANXA7的siRNA、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;ANXA7單克隆抗體購自美國Sigma公司;galectin-3多克隆抗體購自福建邁新公司;PKC單克隆抗體購自美國abcam公司;PMA購自Enzolife公司;所用引物由上海生工科技有限公司合成;細(xì)胞總RNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)公司產(chǎn)品;細(xì)胞培 養(yǎng) 基 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)為美國GIBCO公司產(chǎn)品;蛋白定量試劑盒購于上海生工生物工程有限公司;紫外分光光度計(Thermo labsystems Multiskan MK3)為 Thermo公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱(HERAceu150)為德國賀利氏公司產(chǎn)品。

    2.細(xì)胞培養(yǎng)

    HepG-2細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫,用含10%胎牛血清的DMEM于5%CO2的37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

    3.siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞按2×105/孔種植于6孔板中,使細(xì)胞在24h達(dá)到40-70%的密度;將細(xì)胞分為siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書,按siRNA oligo 20pm/孔、脂質(zhì)體5μl/孔,分別將siRNAoligo和脂質(zhì)體加入無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)液250μl中混勻,靜置5min。然后將兩液混合,室溫放置20min。將500μl脂質(zhì)體/siRNA混懸液逐滴加入培養(yǎng)板,輕輕混勻,置于培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染后6h更換含血清培養(yǎng)基。

    4.Western blot

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度;將蛋白質(zhì)變性后經(jīng)12%SDS-PAGE電泳,每泳道30μg。電泳后電轉(zhuǎn)膜(電轉(zhuǎn)緩沖液:Tris 3g,甘氨酸14.4g,甲醇200mL),濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜;5% 脫脂奶粉/TBST溶液封閉2h,將膜浸入1∶1000稀釋的ANXA7鼠抗人單克隆抗體,4℃過夜;加入羊抗鼠二抗(1∶1000稀釋),室溫孵育2h;ECL檢測。同時檢測相應(yīng)細(xì)胞β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參照。轉(zhuǎn)染48h后用100ng/ml PMA處理24h,Western blot檢測各組細(xì)胞中ANXA7和PKC表達(dá),步驟同上。應(yīng)用 Quantity One V4.52軟件進行結(jié)果分析,以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

    5.RT-qPCR反應(yīng)

    Trizol法提取細(xì)胞總RNA后,以其為模板使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。分別對目的基因和β-actin進行實時定量PCR檢測。參照Genebank上各基因序列的編碼區(qū),由TAKARA公司設(shè)計引物:ANXA7上游引物5’aaaggtgctggcacagatgac 3’,下游引物為5’tggcccacaatagccagaag 3’,擴增的基因片段為176bp。galectin-3的基因序列(Genebank AB006780.1),設(shè)計引物:上游引物5’taacccacgcttcaatgagaacaa 3’,下游引物為 5’acaagtgagcatcattcactgcaac 3’,擴增的基因片段為179bp。β-actin為內(nèi)參,上游引物5’tggcacccagcacaatgaa 3’,下游引物為5’ctaagtcatagtccgcctagaagca 3’,擴增的基因片段長度為186bp。反應(yīng)體系20uL:SYBR PremixEx TaqⅡ(2×)10μl,上下游引物各0.8μl,ROX Reference DyeⅡ0.4μl,cDNA 模板1.48μl,ddH2O 6.52μl。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃5min,95℃30s,60℃30s,72℃延伸30s,共40個循環(huán)。

    6.統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    1.Western blot檢測siRNA的干擾效果

    轉(zhuǎn)染后48h,經(jīng) Western blot檢測結(jié)果顯示,siRNA干擾組中ANXA7表達(dá)較陰性對照組和空白對照組有明顯下降。圖1結(jié)果顯示siRNA顯著抑制了HepG-2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)。

    圖1 Western blot法鑒定siRNA抑制ANXA7表達(dá)結(jié)果。1:siRNA干擾組;2:轉(zhuǎn)染陰性對照組;3:空白對照。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較,*P<0.05Fig.1Expression of ANXA7by western blot.1:siRNA interference group;2:negative control group;3:blank control group.*P<0.05,compared with negative control group and blank control group

    2.RT-qPCR檢測siRNA的干擾效果

    為了進一步驗證AXNA7siRNA對MGC-803細(xì)胞AXNA7蛋白基因轉(zhuǎn)錄的抑制效果,我們再次采用RT-qPCR法在mRNA水平進行了檢測,結(jié)果見圖2

    圖2 RT-qPCR法檢測 AXNA7mRNA表達(dá)結(jié)果。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較,*P<0.05Fig.2Expression of AXNA7mRNA by RT-qPCR.*P<0.05,compared with negative control group and blank control group

    3.Western blot檢測galectin-3在 ANXA7表達(dá)抑制的HepG-2細(xì)胞中的表達(dá)

    當(dāng)ANXA7的表達(dá)抑制效果確定后,Western blot法檢測各組細(xì)胞中g(shù)alectin-3的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照組和空白對照組相比較,siRNA干擾組中g(shù)alectin-3在蛋白水平表達(dá)顯著下降,如圖3所示。

    圖3 Western blot法檢測HepG-2細(xì)胞ANXA7表達(dá)抑制后galectin-3的表達(dá)。1:siRNA干擾組;2:陰性對照組;3:空白對照組。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較,*P<0.05Fig.3Expression of galectin-3after ANXA7knockdown in HepG-2cells by western blot.1:siRNA interference group;2:negative control group:3:blank control group.*P<0.05,compared with negative control group and blank control group

    4.RT-qPCR 檢測galectin-3在 ANXA7表達(dá)抑制的HepG-2細(xì)胞中的表達(dá)

    為了進一步證實galectin-3在ANXA7表達(dá)抑制的HepG-2細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果,我們再次采用RT-qPCR法在mRNA水平進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)galectin-3在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著下降,見圖4。

    5.PMA處理后PKC及ANXA7在ANXA7表達(dá)抑制的HepG-2細(xì)胞中的表達(dá)

    將siRNAoligo轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞后48h,用終濃度為100ng/mL的PMA處理24h,Western blot法檢測siRNA干擾組,陰性對照組和空白對照組HepG-2細(xì)胞以及相對應(yīng)各組加藥處理后的細(xì)胞中PKC及ANXA7的表達(dá),結(jié)果顯示在六組細(xì)胞中PKC的表達(dá)無顯著改變;與陰性對照組和空白對照組相比,siRNA干擾組ANXA7表達(dá)顯著降低;與(陰性對照+PMA)組和(空白對照+PMA)組相比,(siRNA干擾+PMA)組中ANXA7表達(dá)顯著降低;PMA處理前后各組細(xì)胞中ANXA7表達(dá)無顯著差異。如圖5所示。

    圖4 RT-qPCR檢測galectin-3mRNA在 ANXA7表達(dá)抑制的細(xì)胞中的表達(dá)。1:siRNA干擾組;2:陰性對照組;3:空白對照組。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較,*P<0.05Fig.4Galectin-3mRNA expression in the ANXA7 knockdown cells by RT-qPCR.1:siRNA interference group;2:Negative control group;3:Blank control group.*P<0.05,compared with negative control group and blank control group

    圖5 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染ANXA7并加PMA處理后細(xì)胞中PKC及ANXA7的表達(dá)。1:siRNA干擾組;2:陰性對照組;3:空白對照組。4:PMA處理的siRNA干擾組;5:PMA處理的陰性對照組;6:PMA處理的空白對照組。Fig.5PKC and ANXA7expressing after transfection siRNA and PMA treatment by Western blot.1:siRNA interference group;2:Negative control group;3:Blank control group;4:siRNA interference and PMA treatment group;5:Negative control and PMA treatment group;6:blank control and PMA treatment group.

    討 論

    膜聯(lián)蛋白家族是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族,該家族在細(xì)胞內(nèi)含量豐富,約占總蛋白量的1%-2%,參與細(xì)胞內(nèi)許多重要的生物學(xué)過程。ANXA7是膜聯(lián)蛋白家族最早發(fā)現(xiàn)的一個成員[8],研究發(fā)現(xiàn),ANXA7在多種腫瘤組織中出現(xiàn)表達(dá)異常,其表達(dá)失調(diào)與腫瘤進展和預(yù)后密切相關(guān)。通過對乳腺腫瘤樣本的大量分析,ANXA7的表達(dá)顯著增高,而且ANXA7表達(dá)越高,患者存活率越低[4];肺癌組織芯片結(jié)果顯示,在高分級的腫瘤中ANXA7高表達(dá),并與低生存率相對應(yīng)[4]。當(dāng)抑制了ANXA7的表達(dá)后,肝癌細(xì)胞的移動和侵襲性顯著下降,細(xì)胞凋亡率增高[9-10],而且在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞[11];我們先前的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)抑制肝癌細(xì)胞系HepG-2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)后,HepG-2細(xì)胞出現(xiàn)了增殖抑制。本研究繼續(xù)使用肝癌HepG-2細(xì)胞為實驗?zāi)P?,探討ANXA7表達(dá)抑制后細(xì)胞發(fā)生增殖和凋亡改變的可能的機制。

    研究發(fā)現(xiàn)ANXA7可通過和galectin-3相互作用調(diào)控細(xì)胞的抗凋亡活性[12]。galectin-3是半乳糖凝集素家族成員,是一種可見于胞核、胞漿以及細(xì)胞外環(huán)境的多功能腫瘤抑制蛋白,它參與細(xì)胞黏附、免疫調(diào)節(jié)、新血管形成及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程。在凋亡誘導(dǎo)劑作用下,galectin-3轉(zhuǎn)位至核周膜,富集于線粒體并防止其被破壞和細(xì)胞色素C的釋放,對多種腫瘤細(xì)胞具有抗凋亡作用[13],使用siRNA干擾ANXA7mRNA時,ANXA7表達(dá)下調(diào),galectin-3便不能轉(zhuǎn)移到核周膜,這提示ANXA7在galectin-3的運輸中發(fā)揮了作用。我們在抑制ANXA7表達(dá)后,在蛋白水平和RNA水平分別檢測了galectin-3的表達(dá),結(jié)果顯示galectin-3的表達(dá)顯著降低。由此我們推測抑制ANXA7表達(dá)導(dǎo)致HepG-2細(xì)胞增殖抑制可能和galectin-3的表達(dá)降低有關(guān)。

    研究證實ANXA7還具有Ca2+激活的GTP水解酶活性,并且隨著胞內(nèi)顆粒的向外分泌活性加強[14]。Ca2+,GTP和PKC共同使 ANXA7具有促進胞吐過程中細(xì)胞膜融合的活性[15]。PKC不僅是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要信號分子,也是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞黏附、運動、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。有研究表明,PMA長時間處理細(xì)胞對PKC的調(diào)節(jié)存在組織和細(xì)胞特異性。我們在抑制ANXA7表達(dá)后,根據(jù)文獻報道用100ng/ml PMA處理細(xì)胞24h,在蛋白水平檢測了PKC和ANXA7的表達(dá),結(jié)果顯示與未處理組相比PKC及ANXA7的表達(dá)無顯著差異。我們推測單獨激活PKC并不能引起ANXA7表達(dá)顯著變化。我們將用不同時間點及不同濃度PMA處理細(xì)胞來檢驗該推測是否準(zhǔn)確。此外,出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能有諸多因素共同作用,具體原因有待于我們繼續(xù)研究。

    基于以上實驗結(jié)果,結(jié)合galectin-3具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,我們推測,抑制ANXA7表達(dá)導(dǎo)致HepG-2細(xì)胞增殖抑制的機理有可能是通過下調(diào)galectin-3的表達(dá)而導(dǎo)致,其具體機制亟待我們進一步深入研究解決。

    [1]Gerke V,Creutz CE,Moss SE.Annexins:linking Ca2+signalling to membrane dynamics.Nat Rev Mol Cell Bio,2005,6(6):449-461

    [2]Fatimathas L,Moss SE.Annexins as disease modifiers.Histol Histopathol,2010,25(4):527-532

    [3]Srivastava M,Bubendorf L,Srikantan V,et al.ANX7,a candidate tumor suppressor gene for prostate cancer.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(8):4575-4580

    [4]Srivastava M,Bubendorf L,Raffeld M,et al.Prognostic impact of ANX7-GTPase in metastatic and HER2-negative breast cancer patients.Clin Cancer Res,2004,10(7):2344-2350

    [5]Kataoka TR,Ito A,Asada H,et al.Annexin VII as a novel marker for invasive phenotype of malignant melanoma.Jpn J Cancer Res,2000,91(1):75-83

    [6]Yadav AK,Renfrow JJ,Scholtens DM,et al.Monosomy of chromosome 10associated with dysregulation of epidermal growth factor signaling in glioblastomas.JAMA,2009,302(3):276-289

    [7]王小杰,李欣.膜聯(lián)蛋白A7低表達(dá)對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響.解剖學(xué)報,2013,29(5):656-660

    [8]Creutz CE,Pazoles CJ,Pollard HB.Identification and purification of an adrenal medullary protein (synexin)that causes calcium-dependent aggregation of isolated chromaffin granules.J Biol Chem,1978,253(8):2858-2866

    [9]Yuhong Huang,Qing Wanga,Yue Du,et al.Inhibition of annexin A7gene and protein induces the apotosis and decreases the invasion,migration of the hepatocarcinoma cell line.Biomed Pharmacother,2014,68,819-824

    [10]Mohammed Mohammed Ibrahim,Ming-Zhong Sun,Yuhong Huang,et al.Down-regulation of ANXA7decreases metastatic potential of human hepatocellular carcinoma cells in vitro.Biomed Pharmacother,2013,67(4),285-291

    [11]Srivastava M,Bubendorf L,Nolan L,et al.ANX7as a bio-marker in prostate and breast cancer progression.Dis Markers,2001,17(2):115-120

    [12]Wang YG,Kim SJ,Baek JH,et al.Galectin-3increases the motility of mouse melanoma cells by regulating matrix metalloproteinase-1expression.Exp Mol Med,2012,44(6):387-393

    [13]Yu F,F(xiàn)inley RL Jr,Raz A,et al.Galectin-3translocates to the perinuclear membranes and inhibits cytochrome c releasefrom the mitochondria.A role for synexin in galectin-3translocation.J Biol Chem,2002,277(18):15819-15827

    [14]Caohuy H,Srivastava M,Pollard HB.Membrane fusion protein synexin (annexin VII)as a Ca2+/GTP sensor in exocytotic secretion.Proc Natl Acad Sci,1996,93(20):10797-10802

    [15]Caohuy H,Pollard HB.Protein kinase C and guanosine triphosphate combine to potentiate calcium-dependent membrane fusion driven by annexin 7.J Biol Chem,2002,277(28):25217-25225

    猜你喜歡
    空白對照陰性肝癌
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實驗教學(xué)中的應(yīng)用
    LCMT1在肝癌中的表達(dá)和預(yù)后的意義
    鉬靶X線假陰性乳腺癌的MRI特征
    過表達(dá)H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁)圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    三陰性乳腺癌的臨床研究進展
    microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展及診治中的作用
    hrHPV陽性TCT陰性的婦女2年后隨訪研究
    8 種外源激素對當(dāng)歸抽薹及產(chǎn)量的影響
    Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
    身体一侧抽搐| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜老司机福利剧场| 亚洲av.av天堂| 久久精品人妻少妇| 国产伦在线观看视频一区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 中国国产av一级| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费在线观看成人毛片| 免费高清视频大片| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品伦人一区二区| 麻豆国产av国片精品| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品在线观看二区| 免费人成在线观看视频色| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 午夜福利视频1000在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 免费av观看视频| 免费看日本二区| 国产成人a∨麻豆精品| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲成a人片在线一区二区| 十八禁网站免费在线| 久久国产乱子免费精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 99热精品在线国产| 国产亚洲av嫩草精品影院| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日本色播在线视频| 永久网站在线| 国产黄片美女视频| 中文字幕av在线有码专区| 欧美成人免费av一区二区三区| 能在线免费观看的黄片| 免费观看人在逋| 九色成人免费人妻av| 此物有八面人人有两片| 伦理电影大哥的女人| 97超碰精品成人国产| 高清毛片免费看| 国产69精品久久久久777片| 久久午夜福利片| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 午夜影院日韩av| 三级国产精品欧美在线观看| 色综合色国产| 亚洲国产精品合色在线| 日本一本二区三区精品| 老司机福利观看| 国产人妻一区二区三区在| 丝袜美腿在线中文| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲美女视频黄频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 不卡一级毛片| 成年版毛片免费区| av专区在线播放| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 一区二区三区免费毛片| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 精品久久久久久久久久免费视频| 老司机福利观看| 校园春色视频在线观看| 简卡轻食公司| 美女内射精品一级片tv| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产爱豆传媒在线观看| av天堂在线播放| 无遮挡黄片免费观看| eeuss影院久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 三级经典国产精品| 国产色婷婷99| 91精品国产九色| 精品一区二区三区视频在线| 我要搜黄色片| 免费av毛片视频| 九色成人免费人妻av| 91av网一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品一区二区免费欧美| 尾随美女入室| 波野结衣二区三区在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 最新中文字幕久久久久| 有码 亚洲区| 男女视频在线观看网站免费| 欧美成人a在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 99热这里只有精品一区| 国内精品久久久久精免费| 国产成人freesex在线 | 成人av在线播放网站| 国产久久久一区二区三区| 日韩一区二区视频免费看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲五月天丁香| 亚洲精品影视一区二区三区av| 简卡轻食公司| 免费黄网站久久成人精品| 国产综合懂色| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩成人伦理影院| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲美女黄片视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 网址你懂的国产日韩在线| 免费av观看视频| 成人精品一区二区免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产伦一二天堂av在线观看| 黄色日韩在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品国产高清国产av| 国产爱豆传媒在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 听说在线观看完整版免费高清| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 人妻久久中文字幕网| 欧美最黄视频在线播放免费| 国语自产精品视频在线第100页| 两个人的视频大全免费| 身体一侧抽搐| 午夜福利18| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 热99在线观看视频| 欧美精品国产亚洲| 两个人视频免费观看高清| 精品无人区乱码1区二区| 成人美女网站在线观看视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| a级毛片免费高清观看在线播放| 嫩草影院新地址| 性插视频无遮挡在线免费观看| 观看美女的网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 禁无遮挡网站| 色视频www国产| 免费看日本二区| 最新在线观看一区二区三区| 极品教师在线视频| 九九爱精品视频在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国内精品一区二区在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 中文字幕av成人在线电影| 日本色播在线视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 嫩草影院新地址| 久久久精品94久久精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 22中文网久久字幕| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 成人午夜高清在线视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产男人的电影天堂91| 亚洲av成人av| 色播亚洲综合网| 一级黄片播放器| 特大巨黑吊av在线直播| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美潮喷喷水| 又黄又爽又免费观看的视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 波多野结衣高清无吗| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久久久国产a免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 可以在线观看的亚洲视频| 直男gayav资源| 看片在线看免费视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产男靠女视频免费网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产单亲对白刺激| 亚洲国产精品国产精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本黄色视频三级网站网址| 日本色播在线视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 欧美中文日本在线观看视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产成人freesex在线 | 激情 狠狠 欧美| av视频在线观看入口| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩亚洲欧美综合| 三级毛片av免费| 精品日产1卡2卡| 免费看光身美女| 不卡一级毛片| 精品国产三级普通话版| 中文字幕熟女人妻在线| 午夜老司机福利剧场| 人妻久久中文字幕网| 99久久精品一区二区三区| 欧美激情久久久久久爽电影| 高清午夜精品一区二区三区 | 黄色配什么色好看| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美日韩综合久久久久久| 国产爱豆传媒在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美性感艳星| 日韩av在线大香蕉| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲在线自拍视频| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美高清成人免费视频www| 色5月婷婷丁香| 免费av不卡在线播放| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日韩人妻高清精品专区| 国产av不卡久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99久久精品国产国产毛片| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品一区av在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 欧美zozozo另类| 好男人在线观看高清免费视频| 三级毛片av免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品乱码一区二三区的特点| 12—13女人毛片做爰片一| 99久久精品热视频| 免费大片18禁| 三级毛片av免费| 亚洲久久久久久中文字幕| 麻豆一二三区av精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 国内精品美女久久久久久| 欧美日韩在线观看h| 欧美精品国产亚洲| 97热精品久久久久久| 晚上一个人看的免费电影| 中文字幕av在线有码专区| 日本成人三级电影网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美性猛交黑人性爽| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产精品福利在线免费观看| 天堂动漫精品| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产亚洲欧美98| 中文字幕久久专区| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 毛片女人毛片| 精品欧美国产一区二区三| 女人被狂操c到高潮| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲性久久影院| 国产精品一区二区免费欧美| 可以在线观看毛片的网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩制服骚丝袜av| 美女内射精品一级片tv| 亚洲av不卡在线观看| 日韩国内少妇激情av| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美性猛交黑人性爽| 国产片特级美女逼逼视频| 午夜福利成人在线免费观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 深夜a级毛片| 69人妻影院| 啦啦啦啦在线视频资源| 看片在线看免费视频| av.在线天堂| 国产不卡一卡二| 久久久精品欧美日韩精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 又爽又黄a免费视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 免费av不卡在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品午夜福利在线看| 精品久久久久久久末码| 国产精品久久电影中文字幕| 色综合色国产| 最好的美女福利视频网| 黄色视频,在线免费观看| aaaaa片日本免费| 91狼人影院| 久久这里只有精品中国| 18禁在线播放成人免费| 1024手机看黄色片| 天堂影院成人在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 久久国产乱子免费精品| 超碰av人人做人人爽久久| 国产亚洲欧美98| av专区在线播放| 一级黄色大片毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 超碰av人人做人人爽久久| 久久久久性生活片| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 一个人看的www免费观看视频| 一级黄色大片毛片| 久久精品国产自在天天线| 日日干狠狠操夜夜爽| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜精品国产一区二区电影 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美日韩乱码在线| 久久久色成人| a级一级毛片免费在线观看| 搞女人的毛片| 一级a爱片免费观看的视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 午夜福利18| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲五月天丁香| 成年av动漫网址| 亚洲人成网站在线观看播放| 伊人久久精品亚洲午夜| 日本五十路高清| 国产精品一及| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品欧美国产一区二区三| 如何舔出高潮| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99久久精品热视频| av福利片在线观看| 国产老妇女一区| av中文乱码字幕在线| 天堂动漫精品| 一级毛片我不卡| 又爽又黄无遮挡网站| 男女那种视频在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av免费在线观看| 欧美性感艳星| 中国美女看黄片| 亚洲人与动物交配视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 午夜精品国产一区二区电影 | 国产精品久久久久久精品电影| 丝袜美腿在线中文| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产在视频线在精品| 国产成人精品久久久久久| 一区福利在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲成人中文字幕在线播放| 美女免费视频网站| 国产精品一及| 99久久中文字幕三级久久日本| 日韩中字成人| АⅤ资源中文在线天堂| 日韩av在线大香蕉| 成人av在线播放网站| 香蕉av资源在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 高清毛片免费观看视频网站| 国产中年淑女户外野战色| 成年女人毛片免费观看观看9| 可以在线观看毛片的网站| 全区人妻精品视频| 一区福利在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 一个人免费在线观看电影| 亚洲高清免费不卡视频| 干丝袜人妻中文字幕| 校园春色视频在线观看| 麻豆一二三区av精品| 欧美区成人在线视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 九色成人免费人妻av| aaaaa片日本免费| 黄色配什么色好看| 高清日韩中文字幕在线| 99久国产av精品国产电影| 亚洲图色成人| 欧美人与善性xxx| 国产精品一及| 六月丁香七月| 久久久精品大字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 日韩中字成人| 超碰av人人做人人爽久久| 日本黄色片子视频| 亚洲在线观看片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 十八禁网站免费在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 99热全是精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99国产极品粉嫩在线观看| 我要搜黄色片| 久久精品夜色国产| 天堂网av新在线| 精品福利观看| 99热只有精品国产| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产亚洲欧美98| 赤兔流量卡办理| 美女大奶头视频| 国产一区二区三区av在线 | 国产精品久久视频播放| 成人二区视频| 少妇的逼水好多| 欧美+亚洲+日韩+国产| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美激情国产日韩精品一区| 村上凉子中文字幕在线| 插阴视频在线观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲色图av天堂| av在线观看视频网站免费| 麻豆国产97在线/欧美| 久久精品夜色国产| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品亚洲一级av第二区| 美女黄网站色视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线播放无遮挡| 精品人妻偷拍中文字幕| 床上黄色一级片| 成年av动漫网址| 日韩精品中文字幕看吧| 热99在线观看视频| 国产精品一区www在线观看| 国产色婷婷99| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲精品456在线播放app| 中文资源天堂在线| 日韩欧美三级三区| 日韩亚洲欧美综合| 天堂网av新在线| 中文字幕av成人在线电影| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 在线观看午夜福利视频| 国产精品久久电影中文字幕| 国产午夜精品论理片| 国产成人91sexporn| 成人午夜高清在线视频| 人妻久久中文字幕网| 亚洲一区二区三区色噜噜| av天堂中文字幕网| 色哟哟·www| 国产91av在线免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 嫩草影院入口| 亚洲成av人片在线播放无| 在线免费观看的www视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 三级国产精品欧美在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本在线视频免费播放| 男女啪啪激烈高潮av片| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美国产日韩亚洲一区| av福利片在线观看| 亚洲精品色激情综合| 99久国产av精品| 一级黄色大片毛片| АⅤ资源中文在线天堂| 日本在线视频免费播放| 国产毛片a区久久久久| avwww免费| 少妇熟女aⅴ在线视频| 在线免费观看的www视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 一本精品99久久精品77| 亚洲中文字幕日韩| 哪里可以看免费的av片| 最近2019中文字幕mv第一页| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 欧美日韩乱码在线| 久久精品国产亚洲av天美| 中文字幕av成人在线电影| 偷拍熟女少妇极品色| 人妻久久中文字幕网| 在线国产一区二区在线| 最好的美女福利视频网| 欧美一区二区亚洲| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲av中文av极速乱| 日韩欧美免费精品| 精品久久久久久成人av| 看十八女毛片水多多多| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 一级a爱片免费观看的视频| 日韩av在线大香蕉| 真实男女啪啪啪动态图| eeuss影院久久| 亚洲四区av| 中文字幕av在线有码专区| 色吧在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美成人一区二区免费高清观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品一区二区三区人妻视频| 中国美女看黄片| av专区在线播放| 成人三级黄色视频| 国产精品一区www在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 97超视频在线观看视频| 国产亚洲精品久久久com| 97超碰精品成人国产| 99久久精品热视频| 美女 人体艺术 gogo| av在线亚洲专区| 久久综合国产亚洲精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品久久国产蜜桃| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 91av网一区二区| 美女内射精品一级片tv| 成人二区视频| 日本五十路高清| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 免费看光身美女| 国产成年人精品一区二区| 国产亚洲欧美98| av.在线天堂| 黄色视频,在线免费观看| 久久久精品大字幕| 久久亚洲精品不卡| 免费在线观看成人毛片| 亚洲美女黄片视频| 国产91av在线免费观看| 久久久成人免费电影| 国产 一区 欧美 日韩| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久久色成人| 不卡视频在线观看欧美| 99热只有精品国产| 老司机午夜福利在线观看视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 免费观看在线日韩| 精品午夜福利在线看| 成年女人毛片免费观看观看9| 日本黄色视频三级网站网址| 乱人视频在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 黄色欧美视频在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 最近在线观看免费完整版| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 免费av毛片视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产伦在线观看视频一区| 我要看日韩黄色一级片| av黄色大香蕉| 最好的美女福利视频网| 午夜免费激情av| 天天一区二区日本电影三级| 日韩欧美三级三区| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美区成人在线视频| 成人漫画全彩无遮挡| 高清毛片免费看| 免费在线观看影片大全网站| 99久国产av精品国产电影| 国产毛片a区久久久久| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品永久免费网站|