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    膜聯(lián)蛋白A7表達(dá)抑制對HepG-2細(xì)胞中g(shù)alectin-3及PKC 表達(dá)的影響

    2015-12-19 07:10:42田煥娜王小杰梁秀軍劉蘭芳
    關(guān)鍵詞:空白對照陰性肝癌

    田煥娜 王小杰 梁秀軍 陳 龍 劉蘭芳 李 欣*

    (1承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,承德067000;2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,河北067000)

    膜聯(lián)蛋白A7(annexin A7,ANXA7)是膜聯(lián)蛋白家族成員,該家族成員具有廣泛的生物學(xué)功能,包括膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分化、凋亡、生長調(diào)節(jié)及鈣離子信號途徑等[1-2]。.ANXA7除具有該家族典型的磷脂結(jié)合特性、Ca2+通道形成特性等外,其在多種腫瘤組織中出現(xiàn)了表達(dá)改變。研究發(fā)現(xiàn),ANXA7表達(dá)異常與前列腺癌[3]、乳腺癌[4]、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤[5]以及多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤[6]的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在肝癌中,ANXA7的表達(dá)顯著增高與肝癌進展成正相關(guān),當(dāng)抑制了ANXA7的表達(dá)后,肝癌細(xì)胞的移動和侵襲性顯著下降,細(xì)胞凋亡率增高,而且在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞,但是ANXA7在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制并不清楚。我們先前的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)抑制肝癌細(xì)胞系HepG-2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)后,HepG-2細(xì)胞出現(xiàn)了增殖抑制[7]。半乳糖凝集素家族成員galectin-3的高表達(dá)與多種腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān),其具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

    本研究在前期工作基礎(chǔ)上,采用人肝癌細(xì)胞系HepG-2細(xì)胞為研究對象,在抑制ANXA7表達(dá)后檢測galectin-3的表達(dá)改變;用PKC激活劑PMA處理ANXA7表達(dá)受抑的細(xì)胞,檢測ANXA7及PKC表達(dá)變化,為深入探索ANXA7在肝癌中的作用機制研究提供基礎(chǔ)。

    材料和方法

    1.試劑和儀器設(shè)備

    轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、靶向ANXA7的siRNA、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;ANXA7單克隆抗體購自美國Sigma公司;galectin-3多克隆抗體購自福建邁新公司;PKC單克隆抗體購自美國abcam公司;PMA購自Enzolife公司;所用引物由上海生工科技有限公司合成;細(xì)胞總RNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)公司產(chǎn)品;細(xì)胞培 養(yǎng) 基 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)為美國GIBCO公司產(chǎn)品;蛋白定量試劑盒購于上海生工生物工程有限公司;紫外分光光度計(Thermo labsystems Multiskan MK3)為 Thermo公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱(HERAceu150)為德國賀利氏公司產(chǎn)品。

    2.細(xì)胞培養(yǎng)

    HepG-2細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫,用含10%胎牛血清的DMEM于5%CO2的37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

    3.siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞按2×105/孔種植于6孔板中,使細(xì)胞在24h達(dá)到40-70%的密度;將細(xì)胞分為siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書,按siRNA oligo 20pm/孔、脂質(zhì)體5μl/孔,分別將siRNAoligo和脂質(zhì)體加入無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)液250μl中混勻,靜置5min。然后將兩液混合,室溫放置20min。將500μl脂質(zhì)體/siRNA混懸液逐滴加入培養(yǎng)板,輕輕混勻,置于培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染后6h更換含血清培養(yǎng)基。

    4.Western blot

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度;將蛋白質(zhì)變性后經(jīng)12%SDS-PAGE電泳,每泳道30μg。電泳后電轉(zhuǎn)膜(電轉(zhuǎn)緩沖液:Tris 3g,甘氨酸14.4g,甲醇200mL),濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜;5% 脫脂奶粉/TBST溶液封閉2h,將膜浸入1∶1000稀釋的ANXA7鼠抗人單克隆抗體,4℃過夜;加入羊抗鼠二抗(1∶1000稀釋),室溫孵育2h;ECL檢測。同時檢測相應(yīng)細(xì)胞β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參照。轉(zhuǎn)染48h后用100ng/ml PMA處理24h,Western blot檢測各組細(xì)胞中ANXA7和PKC表達(dá),步驟同上。應(yīng)用 Quantity One V4.52軟件進行結(jié)果分析,以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

    5.RT-qPCR反應(yīng)

    Trizol法提取細(xì)胞總RNA后,以其為模板使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。分別對目的基因和β-actin進行實時定量PCR檢測。參照Genebank上各基因序列的編碼區(qū),由TAKARA公司設(shè)計引物:ANXA7上游引物5’aaaggtgctggcacagatgac 3’,下游引物為5’tggcccacaatagccagaag 3’,擴增的基因片段為176bp。galectin-3的基因序列(Genebank AB006780.1),設(shè)計引物:上游引物5’taacccacgcttcaatgagaacaa 3’,下游引物為 5’acaagtgagcatcattcactgcaac 3’,擴增的基因片段為179bp。β-actin為內(nèi)參,上游引物5’tggcacccagcacaatgaa 3’,下游引物為5’ctaagtcatagtccgcctagaagca 3’,擴增的基因片段長度為186bp。反應(yīng)體系20uL:SYBR PremixEx TaqⅡ(2×)10μl,上下游引物各0.8μl,ROX Reference DyeⅡ0.4μl,cDNA 模板1.48μl,ddH2O 6.52μl。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃5min,95℃30s,60℃30s,72℃延伸30s,共40個循環(huán)。

    6.統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    1.Western blot檢測siRNA的干擾效果

    轉(zhuǎn)染后48h,經(jīng) Western blot檢測結(jié)果顯示,siRNA干擾組中ANXA7表達(dá)較陰性對照組和空白對照組有明顯下降。圖1結(jié)果顯示siRNA顯著抑制了HepG-2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)。

    圖1 Western blot法鑒定siRNA抑制ANXA7表達(dá)結(jié)果。1:siRNA干擾組;2:轉(zhuǎn)染陰性對照組;3:空白對照。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較,*P<0.05Fig.1Expression of ANXA7by western blot.1:siRNA interference group;2:negative control group;3:blank control group.*P<0.05,compared with negative control group and blank control group

    2.RT-qPCR檢測siRNA的干擾效果

    為了進一步驗證AXNA7siRNA對MGC-803細(xì)胞AXNA7蛋白基因轉(zhuǎn)錄的抑制效果,我們再次采用RT-qPCR法在mRNA水平進行了檢測,結(jié)果見圖2

    圖2 RT-qPCR法檢測 AXNA7mRNA表達(dá)結(jié)果。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較,*P<0.05Fig.2Expression of AXNA7mRNA by RT-qPCR.*P<0.05,compared with negative control group and blank control group

    3.Western blot檢測galectin-3在 ANXA7表達(dá)抑制的HepG-2細(xì)胞中的表達(dá)

    當(dāng)ANXA7的表達(dá)抑制效果確定后,Western blot法檢測各組細(xì)胞中g(shù)alectin-3的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照組和空白對照組相比較,siRNA干擾組中g(shù)alectin-3在蛋白水平表達(dá)顯著下降,如圖3所示。

    圖3 Western blot法檢測HepG-2細(xì)胞ANXA7表達(dá)抑制后galectin-3的表達(dá)。1:siRNA干擾組;2:陰性對照組;3:空白對照組。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較,*P<0.05Fig.3Expression of galectin-3after ANXA7knockdown in HepG-2cells by western blot.1:siRNA interference group;2:negative control group:3:blank control group.*P<0.05,compared with negative control group and blank control group

    4.RT-qPCR 檢測galectin-3在 ANXA7表達(dá)抑制的HepG-2細(xì)胞中的表達(dá)

    為了進一步證實galectin-3在ANXA7表達(dá)抑制的HepG-2細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果,我們再次采用RT-qPCR法在mRNA水平進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)galectin-3在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著下降,見圖4。

    5.PMA處理后PKC及ANXA7在ANXA7表達(dá)抑制的HepG-2細(xì)胞中的表達(dá)

    將siRNAoligo轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞后48h,用終濃度為100ng/mL的PMA處理24h,Western blot法檢測siRNA干擾組,陰性對照組和空白對照組HepG-2細(xì)胞以及相對應(yīng)各組加藥處理后的細(xì)胞中PKC及ANXA7的表達(dá),結(jié)果顯示在六組細(xì)胞中PKC的表達(dá)無顯著改變;與陰性對照組和空白對照組相比,siRNA干擾組ANXA7表達(dá)顯著降低;與(陰性對照+PMA)組和(空白對照+PMA)組相比,(siRNA干擾+PMA)組中ANXA7表達(dá)顯著降低;PMA處理前后各組細(xì)胞中ANXA7表達(dá)無顯著差異。如圖5所示。

    圖4 RT-qPCR檢測galectin-3mRNA在 ANXA7表達(dá)抑制的細(xì)胞中的表達(dá)。1:siRNA干擾組;2:陰性對照組;3:空白對照組。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較,*P<0.05Fig.4Galectin-3mRNA expression in the ANXA7 knockdown cells by RT-qPCR.1:siRNA interference group;2:Negative control group;3:Blank control group.*P<0.05,compared with negative control group and blank control group

    圖5 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染ANXA7并加PMA處理后細(xì)胞中PKC及ANXA7的表達(dá)。1:siRNA干擾組;2:陰性對照組;3:空白對照組。4:PMA處理的siRNA干擾組;5:PMA處理的陰性對照組;6:PMA處理的空白對照組。Fig.5PKC and ANXA7expressing after transfection siRNA and PMA treatment by Western blot.1:siRNA interference group;2:Negative control group;3:Blank control group;4:siRNA interference and PMA treatment group;5:Negative control and PMA treatment group;6:blank control and PMA treatment group.

    討 論

    膜聯(lián)蛋白家族是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族,該家族在細(xì)胞內(nèi)含量豐富,約占總蛋白量的1%-2%,參與細(xì)胞內(nèi)許多重要的生物學(xué)過程。ANXA7是膜聯(lián)蛋白家族最早發(fā)現(xiàn)的一個成員[8],研究發(fā)現(xiàn),ANXA7在多種腫瘤組織中出現(xiàn)表達(dá)異常,其表達(dá)失調(diào)與腫瘤進展和預(yù)后密切相關(guān)。通過對乳腺腫瘤樣本的大量分析,ANXA7的表達(dá)顯著增高,而且ANXA7表達(dá)越高,患者存活率越低[4];肺癌組織芯片結(jié)果顯示,在高分級的腫瘤中ANXA7高表達(dá),并與低生存率相對應(yīng)[4]。當(dāng)抑制了ANXA7的表達(dá)后,肝癌細(xì)胞的移動和侵襲性顯著下降,細(xì)胞凋亡率增高[9-10],而且在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞[11];我們先前的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)抑制肝癌細(xì)胞系HepG-2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)后,HepG-2細(xì)胞出現(xiàn)了增殖抑制。本研究繼續(xù)使用肝癌HepG-2細(xì)胞為實驗?zāi)P?,探討ANXA7表達(dá)抑制后細(xì)胞發(fā)生增殖和凋亡改變的可能的機制。

    研究發(fā)現(xiàn)ANXA7可通過和galectin-3相互作用調(diào)控細(xì)胞的抗凋亡活性[12]。galectin-3是半乳糖凝集素家族成員,是一種可見于胞核、胞漿以及細(xì)胞外環(huán)境的多功能腫瘤抑制蛋白,它參與細(xì)胞黏附、免疫調(diào)節(jié)、新血管形成及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程。在凋亡誘導(dǎo)劑作用下,galectin-3轉(zhuǎn)位至核周膜,富集于線粒體并防止其被破壞和細(xì)胞色素C的釋放,對多種腫瘤細(xì)胞具有抗凋亡作用[13],使用siRNA干擾ANXA7mRNA時,ANXA7表達(dá)下調(diào),galectin-3便不能轉(zhuǎn)移到核周膜,這提示ANXA7在galectin-3的運輸中發(fā)揮了作用。我們在抑制ANXA7表達(dá)后,在蛋白水平和RNA水平分別檢測了galectin-3的表達(dá),結(jié)果顯示galectin-3的表達(dá)顯著降低。由此我們推測抑制ANXA7表達(dá)導(dǎo)致HepG-2細(xì)胞增殖抑制可能和galectin-3的表達(dá)降低有關(guān)。

    研究證實ANXA7還具有Ca2+激活的GTP水解酶活性,并且隨著胞內(nèi)顆粒的向外分泌活性加強[14]。Ca2+,GTP和PKC共同使 ANXA7具有促進胞吐過程中細(xì)胞膜融合的活性[15]。PKC不僅是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要信號分子,也是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞黏附、運動、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。有研究表明,PMA長時間處理細(xì)胞對PKC的調(diào)節(jié)存在組織和細(xì)胞特異性。我們在抑制ANXA7表達(dá)后,根據(jù)文獻報道用100ng/ml PMA處理細(xì)胞24h,在蛋白水平檢測了PKC和ANXA7的表達(dá),結(jié)果顯示與未處理組相比PKC及ANXA7的表達(dá)無顯著差異。我們推測單獨激活PKC并不能引起ANXA7表達(dá)顯著變化。我們將用不同時間點及不同濃度PMA處理細(xì)胞來檢驗該推測是否準(zhǔn)確。此外,出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能有諸多因素共同作用,具體原因有待于我們繼續(xù)研究。

    基于以上實驗結(jié)果,結(jié)合galectin-3具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,我們推測,抑制ANXA7表達(dá)導(dǎo)致HepG-2細(xì)胞增殖抑制的機理有可能是通過下調(diào)galectin-3的表達(dá)而導(dǎo)致,其具體機制亟待我們進一步深入研究解決。

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