早發(fā)冠心病患者載脂蛋白E基因多態(tài)性分析及其與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度關(guān)系研究

許 璐，白春英，陳士萍，韓旭晨

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.赤峰學(xué)院內(nèi)蒙古人類遺傳病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

早發(fā)冠心病(Premature coronary artery disease，PCAD)是一種特殊的冠心病類型，指男性在55歲前、女性在65歲前發(fā)病。研究[1]顯示，冠心病雖更易出現(xiàn)在老年人中，但目前PCAD發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，冠心病發(fā)病年齡也有提早的趨勢(shì)。PCAD是由各種原因引起冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，當(dāng)血管管腔狹窄達(dá)到一定程度后引起心臟供血不足，心肌缺血、缺氧。相關(guān)研究[2]顯示，血脂異常與PCAD的發(fā)生有關(guān)。高密度脂蛋白降低或低密度脂蛋白升高可影響脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，可增加PCAD發(fā)生的危險(xiǎn)性。有報(bào)道[3]指出，人類載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)基因與冠心病的發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)。ApoE基因可作為脂蛋白結(jié)構(gòu)和功能蛋白，對(duì)血脂代謝起到主要作用[4]?；诖耍狙芯刻骄縋CAD患者ApoE基因多態(tài)性并分析其與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，為該疾病的臨床評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2020年1月至2021年4月于我院心血管內(nèi)科就診的冠心病患者279例為研究對(duì)象。根據(jù)發(fā)病年齡將其分為早發(fā)組(男性發(fā)病年齡≤55歲或女性發(fā)病年齡≤65歲，91例)和遲發(fā)組(男性發(fā)病年齡>55歲或女性發(fā)病年齡>65歲，188例)。兩組患者除年齡外，病程、體重指數(shù)等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并先天性心臟病、心肌病或充血性心力衰竭；合并嚴(yán)重肝、腎功能不全；合并惡性腫瘤；合并嚴(yán)重急性感染性疾??；合并結(jié)締組織疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且患者均已簽署知情同意書。

表1 早發(fā)組與遲發(fā)組患者一般資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 ApoE基因多態(tài)性分析：采集患者空腹靜脈血3 ml于含EDTA的抗凝劑采血管中，應(yīng)用Eppendorf公司Centrifuge 5804R型高速離心機(jī)以1500 r/min離心5 min，去除上清液后將剩余物加入至0.2%氯化鈉溶液10 ml中混勻，在室溫下以2500 r/min離心5 min，分離底層白細(xì)胞。應(yīng)用凱普生物公司的DNA提取試劑盒提取基因組DNA后，應(yīng)用Thermo公司ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)樣本中DNA進(jìn)行擴(kuò)增處理，引物序列(正向5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCAAGGA-3’；反向5’-AGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’)由上海生工生物工程有限公司合成，擴(kuò)增條件：37 ℃條件下尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)處理10 min，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)。取10 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(0.2%溴酚藍(lán)、30%甘油)處理，采用豎式電泳槽電泳，在50 mV恒壓下電泳1～1.5 h，至溴酚藍(lán)接近玻板底部2 cm時(shí)終止電泳。將電泳后的PAGE凝膠置于0.5 μg/ml溴乙錠中染色10 min，經(jīng)特異性限制內(nèi)切酶消化后得到6種基因型(E2/E2、E2/E3、E3/E3、E2/E4、E3/E4、E4/E4)，在Beckman公司Du-640型紫外分光光度儀下觀察結(jié)果。

1.2.2 冠狀動(dòng)脈病變程度評(píng)估：參考文獻(xiàn)[6]以Gensini積分評(píng)估冠狀動(dòng)脈病變并對(duì)早發(fā)組患者進(jìn)行分組。Gensini積分<7分者納入輕度組(39例)，7～14分者納入中度組(29例)，>14分者納入重度組(23例)。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較早發(fā)組及遲發(fā)組的ApoE基因多態(tài)性，分析其與PCAD發(fā)生的關(guān)系；②比較輕度組、中度組、重度組患者的ApoE基因多態(tài)性，分析其對(duì)PCAD患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的評(píng)估價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1 早發(fā)組與遲發(fā)組患者ApoE基因多態(tài)性分析 見表2。早發(fā)組ApoE基因E3/E3型檢出率高于遲發(fā)組(P<0.05)。兩組ApoE基因E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E4及E4/E4檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 早發(fā)組與遲發(fā)組患者ApoE基因多態(tài)性分析[例(%)]

2.2 ApoE基因多態(tài)性與PCAD發(fā)生關(guān)系的Logistic分析 見表3。Logistic回歸分析顯示，ApoE基因E3/E3型是影響PCAD發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

表3 ApoE基因多態(tài)性與PCAD發(fā)生關(guān)系的Logistic回歸分析

2.3 不同冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度患者ApoE基因多態(tài)性分析 見表4。PCAD患者ApoE基因E3/E4型檢出率隨冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的加重而升高(P<0.05)。

表4 不同冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度患者ApoE基因多態(tài)性分析

2.4 ApoE基因多態(tài)性對(duì)PCAD患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的評(píng)估價(jià)值 見表5。ROC曲線分析顯示，ApoE基因E2/E3、E3/E3和E3/E4型對(duì)PCAD患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度具有一定的評(píng)估價(jià)值，且各基因型聯(lián)合評(píng)估的曲線下面積(AUC)更高(均P<0.05)。

表5 ApoE基因多態(tài)性對(duì)PCAD患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的評(píng)估價(jià)值

3 討 論

近年來，冠心病的發(fā)病日益年輕化，患者在患病后易喪失勞動(dòng)力，造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失[7]。臨床資料[8]顯示，PCAD患者多存在脂質(zhì)代謝紊亂。研究[9]發(fā)現(xiàn)，PCAD患者與遲發(fā)性冠心病的高密度脂蛋白及甘油三酯水平均存在差異，表明早發(fā)性及遲發(fā)性冠心病的血脂代謝存在差異。冠心病是一種多種內(nèi)在遺傳因子和外在環(huán)境相互作用導(dǎo)致的疾病。

相關(guān)報(bào)道[10]指出，ApoE基因可通過誘發(fā)血脂代謝異常而導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。ApoE是一種多態(tài)性蛋白，主要分布于乳糜微粒、低密度脂蛋白等表面，通過與低密度脂蛋白受體結(jié)合調(diào)節(jié)體內(nèi)的血脂水平，從而影響冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度及冠心病的發(fā)病率[11]。ApoE基因位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂，屬于常染色體顯性遺傳基因，含有3種等位基因，其不同基因與受體的結(jié)合活性有較大差異，從而對(duì)血脂、脂蛋白代謝產(chǎn)生較大的影響。亦有報(bào)道[12-13]發(fā)現(xiàn)，ApoE基因多態(tài)性可決定血脂水平，從而影響動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生與發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)組ApoE基因E3/E3型檢出率高于遲發(fā)組，提示ApoE基因E3/E3型或與冠心病發(fā)生時(shí)間有關(guān)。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ApoE基因E3/E3型是影響PCAD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示ApoE基因E3/E3型或可誘導(dǎo)PCAD的發(fā)生，這可能與E3/E3型可加重機(jī)體血脂代謝異常、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展有關(guān)。但有研究[14]指出，PCAD患者ApoE基因E4等位基因與遲發(fā)性冠心病患者相比明顯增高，與本研究結(jié)果不符，這可能與本研究樣本量較少有關(guān)，故后期需增加樣本量以進(jìn)一步分析。

血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的重要因素，而動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，故目前認(rèn)為血脂代謝與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[15]。ApoE是一種由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生、神經(jīng)元和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與合成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要載脂蛋白[16]。目前，對(duì)于ApoE基因與冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議。有報(bào)道[17-18]發(fā)現(xiàn)，ApoE基因多態(tài)性因與血脂代謝有關(guān)，或與冠狀動(dòng)脈病變也存在密切關(guān)聯(lián)。但有研究[19-20]指出，ApoE基因多態(tài)性與冠心病患者冠狀動(dòng)脈受累數(shù)目無關(guān)。因此，本研究進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)PCAD患者ApoE基因E3/E4型檢出率隨冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的加重而升高，表明患者ApoE基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度相關(guān)，這主要是因?yàn)锳poE基因多態(tài)性可導(dǎo)致血脂異常，抑制內(nèi)皮一氧化氮合酶活性，改變血管內(nèi)皮功能，從而加重冠狀動(dòng)脈病變程度。本研究結(jié)果顯示，ApoE基因E2/E3、E3/E3和E3/E4型對(duì)PCAD患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度具有一定的評(píng)估價(jià)值，且各基因型聯(lián)合評(píng)估的AUC更高，因此ApoE基因多態(tài)性分析對(duì)PCAD患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度具有較好的評(píng)估價(jià)值。

綜上所述，PCAD患者ApoE基因以E3/E3型為主，E3/E4型或與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度有關(guān)，且ApoE基因多態(tài)性分析對(duì)PCAD患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度具有較好的評(píng)估價(jià)值。