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    響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥中原花青素超聲提取工藝及抗氧化性研究

    2017-07-31 23:09:42王彥平楊會會錢志偉孫瑞琳
    食品工業(yè)科技 2017年13期
    關(guān)鍵詞:液料花青素山藥

    王彥平,楊會會,錢志偉,孫瑞琳,李 東

    (河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,河南鄭州 451450)

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    響應(yīng)面法優(yōu)化紫山藥中原花青素超聲提取工藝及抗氧化性研究

    王彥平,楊會會,錢志偉*,孫瑞琳,李 東

    (河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,河南鄭州 451450)

    以紫山藥為實(shí)驗(yàn)材料,對紫山藥中原花青素超聲輔助提取的最佳工藝條件進(jìn)行研究,并對其體外抗氧化活性進(jìn)行評價。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以原花青素得率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法對超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,紫山藥原花青素的最佳提取工藝:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲時間30 min、液料比19∶1(mL/g)、提取溫度59 ℃、超聲功率220 W,此條件下,紫山藥原花青素得率達(dá)92.47 mg/g。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,紫山藥原花青素具有明顯的抗氧化性,對DPPH自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)半數(shù)抑制率濃度IC50分別為0.182 mg/mL和0.289 mg/mL,清除能力和總還原力強(qiáng)于維生素C。超聲輔助提取的紫山藥原花青素具有良好的抗氧化性。

    紫山藥,原花青素,超聲提取,響應(yīng)面,抗氧化性

    紫色山藥學(xué)名參薯(DioscoreaalalaLinn),為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)多年生草質(zhì)纏繞藤本植物,與人們熟知的懷山藥(DioscoreaoppositaLinn)是同科同屬不同種[1]。目前主要種植區(qū)域有浙江、湖南、江西、廣西等地,河南省也有少量種植,以其圓柱形或肥大的姜狀、掌狀塊根供食用。紫山藥有較高的食用和藥用價值,富含淀粉、蛋白質(zhì)、多種氨基酸、礦物元素、天然花青素、多糖、薯蕷皂苷、多酚、尿囊素等[2],具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、耐缺氧、抗衰老等保健功能[3-6]?!侗静菥V目》記載,其有滋肺益腎、健脾止瀉的功效[7],是我國重要的經(jīng)濟(jì)植物及藥食同源的綠色蔬菜佳品。我國紫山藥資源豐富,分布廣泛,產(chǎn)業(yè)化種植規(guī)模正在逐年擴(kuò)大。但目前,我國對紫山藥的利用還多以鮮食為主,對紫山藥功能成分的分析和精深加工尚處于落后階段。因此,進(jìn)一步深入研究紫山藥的功能成分對促進(jìn)紫山藥精深加工相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

    原花青素(Procyanidins),是一類在植物中廣泛存在的多酚化合物的總稱,由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成[8],以松樹皮和葡萄籽中含量最為豐富[9]。原花青素是目前研究發(fā)現(xiàn)最直接、高效的抗氧化劑,其抗氧化能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍,有明顯的抑菌、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)心血管、改善人體微循環(huán)、促進(jìn)傷口愈合、改善實(shí)驗(yàn)小鼠肥胖、改善骨形成、改善腸道菌群和防治糖尿病等作用[10-14]。然而,紫山藥原花青素的提取尚未見報道。目前,對原花青素的提取主要采用有機(jī)溶劑回流提取,但具有耗時長、溫度高、提取率低、純度低等缺點(diǎn)[15],而超聲波輔助提取法利用超聲波的空化作用、機(jī)械作用和熱效應(yīng)破壞生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),加快原花青素釋放速度,操作簡單、提取時間短、提取率高[15]。自由基學(xué)說是目前公認(rèn)的衰老學(xué)說之一,機(jī)體經(jīng)過代謝會產(chǎn)生大量的自由基,自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致多種慢性退化性疾病的重要因素。氧化應(yīng)激可引起磷脂、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的氧化損傷,從而增加炎性病變、心血管疾病、腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默癥、白內(nèi)障、年齡相關(guān)的功能衰退的風(fēng)險[17]。因此,抗氧化活性也成為評價食物營養(yǎng)價值的一個重要方面。植物作為人體外源性抗氧化物質(zhì)的最重要來源,其活性成分的抗氧化研究開發(fā)日益受到人們的重視并取得了許多成果[18]。

    本實(shí)驗(yàn)首先利用響應(yīng)面法對超聲輔助提取紫山藥原花青素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳工藝條件;其次通過對DPPH·和·OH的清除作用進(jìn)行分析,評價其體外抗氧化活性,旨在為紫山藥原花青素的研究和開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    紫山藥 為市售廣西賀州產(chǎn)完全成熟的紫山藥。置于60 ℃恒溫箱烘24 h,稱恒重、粉碎,過50目篩后,在二氧化硅干燥器內(nèi)常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

    1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,純度99%) Sigma公司;兒茶素(HPLC≥98%)上海金穗生物科技有限公司;香草醛(分析純)科密歐化學(xué)試劑,分析純;無水乙醇、甲醇、硫酸、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、雙氧水、硫酸亞鐵等均為分析純 購自國藥集團(tuán)。

    BS224S分析天平 德國賽多利斯公司;UV power紫外可見光分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海喬躍電子科技有限公司;202-3AB電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海喬躍電子科技有限公司;RE2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;KBS-250 型數(shù)控超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 昆山舒美超聲儀器有限公司;D5-R2離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品,分別吸取 1.0 mg/mL 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mL至10 mL試管中,用甲醇稀釋至1 mL,搖勻,再向其中加入5 mL 10 g/100 mL香草醛甲醇溶液和3 mL濃鹽酸,混勻,在20 ℃水浴中反應(yīng)10 min后,用甲醇作空白對照,在500 nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度對吸光度進(jìn)行回歸分析,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。以兒茶素濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程為:y=2.2345x+0.0192,R2=0.9971。其濃度在0.04~0.24 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

    1.2.2 原花青素的提取過程 紫山藥粉與一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液按一定液料比混合,在一定溫度、一定超聲功率下提取一定時間,將提取液離心(6000 r/min,20 min)后取上清液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫減壓濃縮,轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶,用甲醇定容,然后測定吸光度。

    原花青素得率(mg/g)=原花青素質(zhì)量(mg)/紫山藥粉質(zhì)量(g)

    1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)查閱文獻(xiàn)[19]和預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,影響原花青素超聲輔助提取的主要因子有乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、超聲時間、超聲功率等。乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%,在液料比20∶1 mL/g、提取溫度50 ℃、超聲時間30 min、超聲功率200 W條件下提取1次,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫山藥原花青素得率的影響。液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g,在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度50 ℃、超聲時間30 min、超聲功率200 W條件下提取1次,考察液料比對紫山藥原花青素糖得率的影響。提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20∶1 mL/g、超聲時間30 min、超聲功率200 W條件下提取1次,考察提取溫度對紫山藥原花青素得率的影響。超聲時間分別為10、20、30、40、50 min,在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20∶1 mL/g、提取溫度50 ℃、超聲功率200 W條件下提取1次,考察超聲時間對紫山藥原花青素得率的影響。超聲功率分別為50、100、150、200、250 W,在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、液料比20∶1 mL/g、提取溫度50 ℃、超聲時間30 min條件下提取1次,考察超聲功率對紫山藥原花青素得率的影響。

    1.2.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1),以提取溫度、超聲功率、液料比為自變量,紫山藥原花青素得率為響應(yīng)值,建立紫山藥原花青素提取工藝條件的二次模型。超聲輔助提取紫山藥原花青素,提取液于6000 r/min離心20 min后取上清液得原花青素粗提液,按照1.2.1的方法測定粗提液的吸光度,并計(jì)算原花青素得率,以確定超聲輔助提取紫山藥原花青素的最佳工藝條件。

    表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test

    1.2.5 紫山藥原花青素體外抗氧化活性測定 稱取200 g紫山藥粉,按響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝,提取液于6000 r/min的速度離心20 min,取上清液得原花青素粗提液。粗提液采用AB-8大孔樹脂進(jìn)行分離純化后得紫山藥原花青素粉末測定原花青素含量(原花青含量25.7%)。紫山藥原花青素按照不同要求,配制不同濃度的紫山藥原花青素水溶液,分別進(jìn)行總還原力測定、DPPH·清除率的測定、·OH清除率的測定,體外抗氧化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]的方法。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    所有數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值,單因素實(shí)驗(yàn)和抗氧化性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft office excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖標(biāo)制作,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析,并優(yōu)化出最佳提取工藝。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 紫山藥原花青素提取的單因素實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫山藥原花青素得率的影響 由圖1可知,相同條件下,紫山藥中原花青素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由40%增加到70%時,原花青素得率不斷升高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時,原花青素得率反而下降,這可能與溶劑體積分?jǐn)?shù)過高時小極性脂溶性溶出物太多太復(fù)雜的緣故[20]。由于乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時優(yōu)勢較顯著,故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%為最佳提取濃度。

    圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on procyanidins yield

    2.1.2 液料比對紫山藥原花青素得率的影響 由圖2可知,當(dāng)液料比由5∶1 mL/g增加到20∶1 mL/g時,原花青素得率不斷升高,當(dāng)液料比大于20∶1 mL/g時,原花青素得率呈下降趨勢。一定范圍內(nèi),提取劑劑量越大,原花青素得率越高;但當(dāng)提取劑過多時由于可能影響超聲的空化效應(yīng)和機(jī)械振動的效果,原花青素得率反而下降[15]。故選擇液料比為(15∶1~25∶1) mL/g進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

    圖2 液料比對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of liquid-material ratio on procyanidins yield

    2.1.3 提取溫度對紫山藥原花青素得率的影響 由圖3可知,隨著提取溫度的升高,紫山藥原花青素得率先升高后降低。這主要是由于溫度越高分子運(yùn)動越快,得率升高。但溫度過高時,可能破壞原花青素的分子結(jié)構(gòu),得率反而降低。故選擇提取溫度為50~70 ℃進(jìn)行優(yōu)化。

    圖3 提取溫度對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on procyanidins yield

    2.1.4 超聲時間對紫山藥原花青素得率的影響 由圖4可知,超聲時間低于30 min時,紫山藥原花青素得率,隨著時間延長呈現(xiàn)升高趨勢,30~50 min范圍時趨向平穩(wěn)。超聲時間達(dá)到一定程度,紫山藥原花青素得率趨于平穩(wěn),可能由于此時細(xì)胞壁破壞較完全。故確定超聲時間30 min為最佳時間。

    圖4 超聲時間對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on procyanidins yield

    2.1.5 超聲功率對紫山藥原花青素得率的影響 由圖5可知,紫山藥原花青素得率隨著超聲功率的提高呈現(xiàn)升高趨勢,當(dāng)超聲功率為200 W時,原花青素得率最高,之后反而下降,可能由于功率過大加速了提取液的流動,使物料作用于超聲波下的時間減少,細(xì)胞壁被破壞程度減弱,原花青素溶出減少[21]。故選擇超聲功率在150~250 W進(jìn)一步優(yōu)化。

    圖5 超聲功率對原花青素得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on procyanidins yield

    2.2 紫山藥原花青素提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

    2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以70%乙醇為提取劑、超聲時間30 min,以紫山藥中原花青素得率為響應(yīng)值,選擇液料比、提取溫度和超聲功率3個因素,做三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

    表2 紫山藥原花青素提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design and results of response surface test of procyanidins extraction

    表3 回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for each term in the response surface regression model

    注:*差異顯著(p<0.05);**差異極顯著(p<0.01)。2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 應(yīng)用Design Expert進(jìn)行回歸擬合分析,可得到紫山藥中原花青素得率的回歸模型為:

    Y=90.71-0.57A-0.58B+1.29C-0.11AB+0.38AC+1.65BC-1.21A2-2.11B2-1.43C2,Y為紫山藥原花青素得率的預(yù)測值。

    由圖6可知,提取溫度和超聲功率交互作用的響應(yīng)面坡度和等高線,說明二者相互作用對紫山藥原花青素得率的影響顯著,可能因?yàn)槌暪β试酱?所需提取溫度越低,而在相同功率下提取溫度過高則會引起得率下降。

    圖6 各因素交互作用對原花青素得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graphs showing the interactions of various factors on procyanidins yield

    2.2.3 最佳條件的預(yù)測及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過回歸模型預(yù)測,超聲波輔助提取紫山藥原花青素的最佳工藝為:液料比19∶1 mL/g、提取溫度59 ℃、超聲功率220 W,此時紫山藥中原花青素理論得率最大為91.13 mg/g。根據(jù)所得工藝條件進(jìn)行三組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得原花青素得率為(92.47±1.12) mg/g,與理論得率相接近,驗(yàn)證了此模型的有效性。

    2.3 紫山藥原花青素體外抗氧化活性

    2.3.1 紫山藥原花青素的總還原能力 由圖7可知,在0.03~0.15 mg/mL濃度范圍內(nèi),總還原能力隨著紫山藥原花青素濃度的增加而升高,并與樣品濃度存在良好的量效關(guān)系。相同濃度下,紫山藥原花青素的總還原能力明顯高于維生素C。

    圖7 紫山藥原花青素的總還原能力Fig.7 The total reducing power of procyanidins from purple yam

    2.3.2 紫山藥原花青素對DPPH·的清除作用 由圖8可知,在0.1~0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi),對DPPH·的清除能力隨著紫山藥原花青素濃度的提高而增強(qiáng),通過線性回歸方程計(jì)算得到紫山藥原花青素的IC50=0.182 mg/mL,而維生素C的IC50=0.227 mg/mL,這說明在相同濃度下,紫山藥原花青素對DPPH·的清除能力明顯強(qiáng)于維生素C。

    2.3.3 紫山藥原花青素對·OH的清除作用 由圖9可知,在·OH清除實(shí)驗(yàn)中,在0.1~0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi),原花青素濃度與·OH清除率之間存在良好的量效關(guān)系,通過線性回歸方程計(jì)算得到紫山藥原花青素的IC50=0.289 mg/mL,而維生素C的IC50=0.364 mg/mL,這說明在相同濃度下,紫山藥原花青素對·OH的清除能力強(qiáng)于維生素C。

    圖9 紫山藥原花青素對·OH的清除作用Fig.9 The scavenging effect of procyanidins from purple yam on ·OH

    3 結(jié)論

    采用超聲輔助提取紫山藥中原花青素,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),建立了紫山藥中原花青素得率的二次回歸模型,優(yōu)化最佳工藝條件為:液料比19∶1 mL/g、提取溫度59 ℃、超聲功率220 W,在此條件下進(jìn)行三組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得原花青素得率為(92.47±1.12) mg/g,與理論得率最大值91.13 mg/g相差不大。通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),紫山藥原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化性,總還原力和對DPPH·、·OH的清除能力均強(qiáng)于維生素C。且在實(shí)驗(yàn)濃度下,紫山藥原花青素的總還原力和對DPPH·、·OH的清除能力呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。為紫山藥功能成分的開發(fā)利用提供一定的參考價值和理論基礎(chǔ)。

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    [18]欒娜,劉行. 超聲輔助提取紫甘藍(lán)中原花青素工藝的優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(30):14651-14653.

    [19]陳月英,王彥平,孫瑞琳,等. 葡萄皮渣原花青素酶法提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究[J]. 北方園藝,2016,(16):129-132.

    [20]秦菲,劉蕊,王龍. 超聲輔助提取山竹果皮中原花青素[J]. 食品發(fā)教育工業(yè),2012,38(7):157-160.

    Optimization of ultrasonic-assisted extraction of procyanidins frompurple yam by response surface methodology and antioxidant activity

    WANG Yan-ping,YANG Hui-hui,QIAN Zhi-wei*,SUN Rui-lin,LI Dong

    (Department of Food Engineering,HenanVocational College of Agriculture,Zhengzhou 451450,China)

    Taking purple yam as the experimental material,the optimum conditions of ultrasonic-assisted extraction of procyanidins from purple yam were studied and their antioxidant activitiesinvitrowere evaluated. On the basis of single factor test,response surface methodology was used to optimize the extraction yield of proanthocyanidins. Results showed the optimum condition were as follows:ethanol volume fraction 70%,ultrasonic time 30 min,liquid-material ratio 19∶1 (mL/g),extraction temperature 59 ℃,ultrasonic power 220 W.Under such conditions,the yield of procyanidins was 92.47 mg/g. Procyanidins from purple yam showed significant antioxidant capacity,and half inhibition concentrations(IC50)of DPPH· and that of ·OH were 0.182 mg/mL and 0.289 mg/mL respectively,the scavenging abilities and reducing power were stronger than vitamin C.

    purple yam;procyanidins;ultrasonic-assisted extraction;response surface;antioxidant activity

    2016-12-27

    王彥平(1983--),女,碩士,講師,研究方向:食品功能與營養(yǎng)因子,E-mail:14389487@qq.com。

    *通訊作者:錢志偉(1969-),男,碩士,教授,研究方向:食品營養(yǎng)與檢測,E-mail:1460331538@qq.com。

    鄭州市普通科技攻關(guān)項(xiàng)目(153PKJGG424);2015年度河南省高等學(xué)校優(yōu)秀教學(xué)團(tuán)隊(duì)建設(shè)(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品營養(yǎng)與檢測專業(yè));2014年度河南省高等學(xué)?!皩I(yè)綜合改革試點(diǎn)”項(xiàng)目(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品營養(yǎng)與檢測專業(yè))。

    TS209

    B

    1002-0306(2017)13-0181-06

    10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.034

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