補(bǔ)陽還五湯對(duì)60Coγ射線輻射損傷小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群和IL-2的影響*

張 煒，韓 彪△，劉喜平，孫少伯

1 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院；2 甘肅中醫(yī)學(xué)院教育部“敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 甘肅中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所

補(bǔ)陽還五湯對(duì)60Coγ射線輻射損傷小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群和IL-2的影響*

張 煒1，韓 彪1△，劉喜平2，孫少伯3

1 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院；2 甘肅中醫(yī)學(xué)院教育部“敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 甘肅中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所

目的：探討補(bǔ)陽還五湯對(duì)輻射損傷的防護(hù)作用及機(jī)制。方法：采用60Coγ射線對(duì)小鼠進(jìn)行一次性全身照射致輻射損傷動(dòng)物模型，觀察外周血淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+及白細(xì)胞介素-2（IL-2）的變化。結(jié)果：于60Coγ射線照射前后，連續(xù)14天灌胃補(bǔ)陽還五湯水煎液，可使受輻射小鼠外周血的CD3+和CD4+水平顯著上升（P＜0.01），同時(shí)可升高血清及脾臟白細(xì)胞介素-2（IL-2）水平。結(jié)論：補(bǔ)陽還五湯具有明顯的抗輻射作用，其機(jī)制可能與其能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，減輕輻射對(duì)機(jī)體的損傷，調(diào)整免疫系統(tǒng)功能恢復(fù)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)輻射的抵御力有關(guān)。

補(bǔ)陽還五湯；60Coγ射線；輻射損傷；小鼠

輻射屬中醫(yī)外邪范疇，具有直中臟腑，耗傷元?dú)獾奶攸c(diǎn)，使氣虛不能推動(dòng)血脈運(yùn)行，致“停血留瘀”，形成“氣虛血瘀”的病理機(jī)制［1-2］，故益氣活血法為防治輻射后機(jī)體損傷或毒副反應(yīng)的關(guān)鍵治法。補(bǔ)陽還五湯為益氣活血法的代表方劑，本研究發(fā)現(xiàn)益氣活血法對(duì)60Coγ射線輻射損傷小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群和白細(xì)胞介素-2（IL-2）有明顯影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20～25）g。由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供，并在甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)施證號(hào)：SYXK（甘）2004-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（甘）2004-0006。

1.2 藥物及試劑 補(bǔ)陽還五湯藥材購自蘭州大學(xué)第一醫(yī)院中藥房，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。按原方組成及比例混合［3］，將各組藥物飲片浸泡30分鐘，煎煮2次，30min/次，紗布粗濾去渣，2煎混勻，藥液濃縮為含生藥0.5g/mL，置于冰箱保存?zhèn)溆?；EDTA-K2抗凝劑（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號(hào)：20110218）；Mouse CD3試劑盒（Invitrogen，Carisbad，CA9200 USA，批號(hào)：286157D）；Mouse CD4試劑盒（北京福瑞生物工程公司，批號(hào)：20110801）；Mouse CD8試劑盒（西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20080817）；Mouse白細(xì)胞介素2（IL-2）定量檢測（E1isa）試劑盒（西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20120896）。

1.3 儀器 照射裝置，采用60Coγ射線源（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院放療科鈷源室GWGP80型60Coγ治療機(jī)）；流式細(xì)胞儀（Beckman co1ter XL）；Biorad S680酶標(biāo)儀（E1isa kit博士德）；CO2培養(yǎng)箱（美國Forma公司生產(chǎn)）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及給藥 選用SPF級(jí)昆明種小鼠75只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組15只，組間無差異（P＞0.05）。N組（正常組）：不灌胃，不照射，食水自由；R組（照射組）：小鼠在自由活動(dòng)狀態(tài)下，采用60Coγ射線進(jìn)行全身輻射1次，輻射條件為等效方野20cm×20cm面積，焦點(diǎn)-鼠距80cm，1Gy/min增量，輻照6分鐘，總劑量為6 Gy；BL組（低劑量補(bǔ)陽還五湯保護(hù)組），按照1g/kg（相當(dāng)于人劑量的5倍）劑量灌胃；BM組（中劑量補(bǔ)陽還五湯保護(hù)組），按2g/kg（相當(dāng)于人劑量的10倍）劑量灌胃；BH組（高劑量補(bǔ)陽還五湯保護(hù)組），按4g/kg（相當(dāng)于人劑量的20倍）劑量灌胃。補(bǔ)陽還五湯各保護(hù)組連續(xù)灌胃14天，于給藥后第6天進(jìn)行輻射，輻射方法同照射組。

1.4.2 輻射損傷小鼠外周血T淋巴細(xì)胞含量的檢測 于第15天各組小鼠眼底采血，肝素鈉抗凝，100μL全血加CD3+、CD4+、CD8+抗體各10μL，輕輕吹勻后，避光，室溫溫育30分鐘，加1mL紅細(xì)胞裂解液，1 000r/min，離心5分鐘，棄上清液，用1mL 0.001 M的PBS重新懸浮細(xì)胞，200目過濾網(wǎng)過濾樣本后上機(jī)檢測，按照小鼠CD3+、CD4+、CD8+試劑盒說明，流式細(xì)胞儀檢測，上樣分析。

1.4.3 輻射損傷小鼠血清及鼠脾臟IL-2水平的檢測 于第15天各組小鼠眼底采血，離心20分鐘（2 000r/min），取血清，備用。頸椎脫臼處死動(dòng)物，摘取小鼠脾臟，除盡脂肪等組織，制備成5×106/mL脾細(xì)胞混懸液，加入ConA，使終濃度為5μg/mL，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞，取出離心20分鐘（2 500r/min）洗滌2次，收集上清液，滅菌后-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。以上血清及脾?xì)胞上清液均采用ELISA試劑盒，按說明書雙抗體夾心法檢測IL-2的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)輻射損傷小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響 小鼠受輻射損傷后，外周血CD3+、CD4+、CD8+較正常組均有顯著下降，與正常組比較有明顯差異（P＜0.01），但下降幅度有所不同，其中CD3+的降低幅度最大，照射組CD4+/CD8+比值較正常組明顯升高（P＜0.01）；補(bǔ)陽還五湯各劑量組對(duì)CD8+的作用不明顯，但均可使受輻射小鼠的CD3+和CD4+水平較照射組顯著上升，與照射組比較有顯著差異（P＜0.05）；補(bǔ)陽還五湯各劑量組對(duì)CD4+/CD8+無明顯影響（P＞0.05），見表1。

表1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)輻射損傷小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響（±s）

表1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)輻射損傷小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響（±s）

注：與N組比較▲表示P＜0.01；與R組比較△表示P＜0.01，△△表示P＜0.05。

組別 例數(shù) CD3+/％ CD4+/％ CD8+/％ CD4+/CD8+N 15 31.10±2.20 11.30±2.20 4.78±3.10＊ 2.36±0.01 R 15 6.67±3.10▲ 9.24±4.20▲ 2.38±5.80▲ 3.88±0.04▲BL 15 8.16±1.90△ 9.23±2.20 2.48±4.10 3.72±0.07 BM 15 10.20±3.60△ 9.38±4.60△△ 2.96±3.30△△ 3.16±0.06 BH 15 17.20±5.40△ 10.70±5.10△ 3.10±2.80△ 3.45±0.02

2.2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)輻射損傷小鼠脾臟及血清IL-2水平的影響 小鼠受輻射損傷后，脾臟IL-2顯著下降，與正常組比較有明顯差異（P＜0.05）；補(bǔ)陽還五湯各劑量組均可升高IL-2水平，且大劑量組作用顯著（P＜0.05），見表2。

表2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)輻射損傷小鼠脾臟及血清IL-2水平的影響（±s） pg/mL

表2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)輻射損傷小鼠脾臟及血清IL-2水平的影響（±s） pg/mL

注：與N組比較▲表示P＜0.01；與R組比較△表示P＜0.01，△△表示P＜0.05。

組別 例數(shù) IL-2（血清） IL-2（脾臟） N 15 4.361±0.614 0.094±0.053 R 15 3.182±0.440▲ 0.086±0.032▲BL 15 3.520±0.578 0.091±0.026 BM 15 3.760±0.361 0.098±0.017△△BH 15 3.950±0.421 1.067±0.023△

3 討論

“氣虛血瘀”貫穿輻射發(fā)病的始終，具有程度不同、輕重不同的特點(diǎn)。故益氣活血法是防治輻射后機(jī)體損傷或毒副反應(yīng)的重要治法。補(bǔ)陽還五湯來源于清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，該方重用黃芪為君藥，為益氣活血法的代表方劑。

輻射對(duì)免疫器官以及其他組織、細(xì)胞都有損害，但免疫系統(tǒng)對(duì)輻射損傷的敏感性最高。淋巴細(xì)胞是存在于體內(nèi)的一種單核細(xì)胞，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要構(gòu)成成分之一。機(jī)體受到輻射后，將發(fā)生嚴(yán)重的免疫功能低下，表現(xiàn)為免疫活性細(xì)胞數(shù)量減少，抗體形成抑制或紊亂，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失常等。T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，作為體內(nèi)最重要的免疫活性細(xì)胞之一，對(duì)輻射相當(dāng)敏感，其中T淋巴細(xì)胞功能亞群CD3+、CD4+、CD8+在急性輻射損傷后的改變，已經(jīng)引起學(xué)者的高度重視，可作為輻射損傷后反映免疫功能狀態(tài)的較理想的指標(biāo)［4］。CD3+代表外周血總T細(xì)胞，CD4+代表輔助性T細(xì)胞（Th），在免疫反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，CD8+代表抑制性T細(xì)胞（Ts），能抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，阻止抗體的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，60Coγ射線照射后，小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+均有顯著下降，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致［5］，其中CD3+的降低幅度最大；補(bǔ)陽還五湯各組，尤其是高劑量組可升高受輻射小鼠外周血CD3+和CD4+水平，而對(duì)CD8+的作用不明顯；補(bǔ)陽還五湯各劑量組對(duì)CD4+/CD8+無明顯影響。提示補(bǔ)陽還五湯通過介導(dǎo)細(xì)胞免疫，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)理關(guān)鍵在于升高CD3+和CD4+水平。IL-2是T細(xì)胞功能增強(qiáng)的重要標(biāo)志之一，是參與免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子，可作用于活化的T細(xì)胞以促進(jìn)其增殖。補(bǔ)陽還五湯可明顯促進(jìn)小鼠脾臟產(chǎn)生IL-2的水平，對(duì)T淋巴細(xì)胞有直接促進(jìn)作用，或作用于巨噬細(xì)胞促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞及IL-2的產(chǎn)生。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，倘若能通過觀察調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞的功能（促進(jìn)或抑制）進(jìn)而觀察調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)功能，也許是一條有效的觀察免疫調(diào)節(jié)和藥物發(fā)現(xiàn)的新途徑［6］。

補(bǔ)陽還五湯中黃芪、當(dāng)歸、川芎等單味藥物具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗輻射的藥理作用［7-13］，本研究顯示補(bǔ)陽還五湯對(duì)機(jī)體輻射損傷免疫功能具有重要調(diào)節(jié)作用，初步印證了益氣活血法防治輻射損傷的正確性，而對(duì)于補(bǔ)陽還五湯的其他抗輻射作用及其機(jī)制、有效物質(zhì)、尤其是藥物配伍后的協(xié)同增效情況，還有待進(jìn)一步研究。

［1］劉艷梅，龐來祥，尋園，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗輻射作用研究［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28（6）：61-62.

［2］張宸閣，高雯欣，盧衛(wèi)紅.影響輻射小鼠肝臟SOD及MDA活性的孔石莼多糖研究［J］.中醫(yī)藥信息，2012，29（1）：111-114.

［3］李冀.方劑學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：197.

［4］吳大鵬，賈宗嶺，蔣會(huì)娟，等.放射損傷對(duì)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，30（2）：108-109.

［5］崔玉芳，丁彥青，徐菡，等.大劑量線照射對(duì)小鼠免疫功能近期、遠(yuǎn)期的影響［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2004，20（6）：675-677.

［6］Attwood JT，Munn DH.Macrophage suppression of T cell activation：a potential mechanism of peripheral tolerance［J］.Int Rev Immunol，1999，18（5-6）：515-525.

［7］許愛琴，孫玉文，馮全生.現(xiàn)代中醫(yī)防輻射研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，19（30）：3361-3363.

［8］馬洪第，盧芳汀，陶艷艷，等.中藥免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27（5）：462-466.

［9］任鵬飛，鄧毅.當(dāng)歸及其有效成分藥效學(xué)研究進(jìn)展［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25（9）：125-128.

［10］陳國輝，黃文鳳.黃芪的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2008，17（17）：1482-1485.

［11］穆艷云，李忠仁.當(dāng)歸芍藥散的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展［J］.西部中醫(yī)藥，2000，13（1）：62-64.

［12］黃自麗，黃修燕，鄭起，等.中藥抗腫瘤作用及其作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16（3）：386-389.

［13］成麗.淺議川芎的藥理學(xué)作用［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4（6）：137-138.

The Influence of BuYang HuanWu Tang on T Lymphocytes and IL-2 in Peripheral Blood of Mice Damaged by60Co γ Ray Radiation

ZHANG Wei1，HAN Biao1△，LIU Xiping2，SUN Shaobo3
1 Lanzhou University the First Hospital，Lanzhou 73000，China；2 Key Laboratory of Education Ministry″Dunhuang Medicine and Translation″from Gansu University of Traditional Chinese Medicine；3 Institute of Integrative Medicine of Gansu University of Traditional Chinese Medicine；

Objective：To explore the protection and the mechanism of BuYang HuanWu Tang for radiation damage.Methods：Animal model was established through60Coγ ray total body radiation once.The changes of interleukin-2（IL-2）and T lymphocytes in peripheral blood including CD3+，CD4+，CD8+were observed.Results：Before and after60Coγ ray radiation，BuYang HuanWu Tang was given by intragastric administration for 14 days，which could make the levels of CD3+and CD4+rise in peripheral blood of the mice significantly（P＜0.01），and raise the level of IL-2 in the serum and the spleen.Conclusion：BuYang HuanWu Tang is effective in protecting the mice with radiation damage，and the mechanism might be related to enhancing immunologic function of the body，relieving the damage caused by radiation of the body，regulating functional recovery of immunologic function and improving animal resistance to the radiation.

BuYang HuanWu Tang；60Coγ ray；damaged by radiation；mice

R392.12

A

1004-6852（2014）01-0017-03

2013-04-27

甘肅省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（編號(hào)GZK-2011-79）

張煒（1977—），男，碩士研究生，主治醫(yī)師。研究方向：心胸外科疾病的中西醫(yī)結(jié)合診治。

△通訊作者：韓彪（1966—），男，碩士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：胸外科疾病的診治。