益腎化濁方對SAMP8小鼠NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)指標(biāo)的影響

張琳琳 周 震 李 程 張玉蓮

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津，300150;2天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津，300073)

老年性癡呆即阿爾茲海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙和記憶能力損害為主要的臨床特征[1]，為癡呆最常見的類型。據(jù)中國國家防控中心(CDC)統(tǒng)計(jì)，2006年我國AD患病人數(shù)已超過500萬，60歲以上的老年人群中，年齡每增加5歲，AD的患病危險(xiǎn)可增加1.85倍[2]。AD已成為21世紀(jì)威脅人類的最嚴(yán)重疾病之一。

AD的病理特征主要包括Aβ聚集形成的老年斑(SP)及tau蛋白異常磷酸化形成的纖維纏結(jié)(NFT)最終導(dǎo)致神經(jīng)元的減少，以往研究多集中于此。而最新研究顯示NEI網(wǎng)絡(luò)在機(jī)體衰老過程中具有重要地位，也是老年相關(guān)疾患研究中不可避免的重要環(huán)節(jié)[3]。王擁軍團(tuán)隊(duì)流行病學(xué)調(diào)查顯示生、長、壯、老的生命過程，其突出表現(xiàn)為NEI網(wǎng)絡(luò)某些指標(biāo)的調(diào)節(jié)變化[4]。因此通過對AD患者紊亂NEI網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，從而達(dá)到微環(huán)境神經(jīng)生化指標(biāo)的良性改變，對于預(yù)防和治療老年性癡呆具有一定作用。而中藥復(fù)方正是通過采取多靶點(diǎn)作用于失穩(wěn)NEI網(wǎng)絡(luò)的方法，起到整體良性調(diào)和陰陽的作用，使已經(jīng)失去平衡的機(jī)體重返穩(wěn)態(tài)[5]。

我們在本實(shí)驗(yàn)觀察了補(bǔ)腎化濁方對SAMP8小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的影響，并對其機(jī)理進(jìn)行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 健康雄性SAMP8小鼠(由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心提供)6、9、12三個(gè)月齡各30只，共計(jì)90只，體重(30±2)g。三個(gè)月齡分別按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為安慰劑組、安理申組和益腎化濁方組，共9組，每組10只。見表1。于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每12 h明暗交替，溫度20～22℃，濕度50%左右，飲水、飼料及高溫蒸汽滅菌。

1.2 藥物制備 益腎化濁方由淫羊藿10 g、補(bǔ)骨脂10 g、女貞子 10 g、石菖蒲12 g、炙黃芪 10 g、川芎 10 g 六種中藥組成。上述藥物310 g加10倍水，煎煮3次，每次0.5 h，煎煮液濃縮至500 mL，生藥濃度為0.62 g·mL－1。以上均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室制備，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸多奈哌齊[商品名:安理申，衛(wèi)才(中國)藥業(yè)有限公司提供，5 mg/片]，批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字H20050978，批號(hào):100335A。

人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量比值表計(jì)算，其中人(70 kg)與小鼠(20 g)間系數(shù)為0.0026。按照患者每日62 g(1劑)生藥計(jì)算，30 g小鼠為每日0.2886 g生藥，即生藥濃度為9.62 g/kg，因1 mL中藥濃煎劑含0.62 g生藥，故每日小鼠需13 mL/kg中藥濃煎劑。安理申組給藥方法為取2片安理申用研缽研磨后混懸于100 mL生理鹽水中，即濃度為0.1 mg/mL，按0.01 mL/g給小鼠進(jìn)行灌胃，2組均連續(xù)灌胃4周。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 Elisa試劑盒(包括SAMP8小鼠乙酰膽堿、雌二醇、促腎上腺皮質(zhì)激素和白細(xì)胞介素－2酶聯(lián)免疫分析試劑盒):購自天津市灝洋生物制劑科技有限責(zé)任公司;05－1sR離心機(jī):購自美國Beekman公司;speetraMaxMS全自動(dòng)酶標(biāo)儀及Potter－Elvejhem勻漿器:購自美國Mo－eeularDeviees公司;ANDELIN細(xì)胞超聲破碎儀:購自上海友思生物技術(shù)有限公司。

1.4 各指標(biāo)檢測方法 進(jìn)行4周生理鹽水及藥物灌胃后，將各組小鼠進(jìn)行股動(dòng)脈穿刺取血1 mL，用05－1sR離心機(jī)3500 r/min離心15 min后，取上清液放入－80℃冰箱進(jìn)行保存。利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒對各組小鼠的血清進(jìn)行NEI網(wǎng)絡(luò)部分指標(biāo)的檢測，包括:乙酰膽堿、雌二醇、促腎上腺皮質(zhì)激素及白細(xì)胞介素－2。方法操作均按各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用(±s)表示，組間比較符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)(組間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，以0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，方差不齊時(shí)選用校正的t檢驗(yàn))，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠分組表(只)

表2 不同月齡小鼠NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)指標(biāo)測定(n=10，±s)

表2 不同月齡小鼠NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)指標(biāo)測定(n=10，±s)

注:同一月齡小鼠，與安慰劑組比較，*P＜0.05;同一月齡小鼠，與安慰劑組比較，△△P≤0.001;▲P＞0.001。

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2 結(jié)果

1)本研究結(jié)果表明老年癡呆小鼠的乙酰膽堿、雌二醇及腎上腺皮質(zhì)激素的水平明顯減低，IL－2的水平明顯增高。見表2。

2)安理申與益腎化濁方9、12月齡小鼠的乙酰膽堿水平較同月齡安慰劑組都有明顯的升高作用(P＜0.05)。見表2。

3)益腎化濁方組9、12月齡小鼠在乙酰膽堿、雌二醇及腎上腺皮質(zhì)激素水平較同月齡安慰劑組明顯升高(P＜0.05);IL－2較同月齡安慰劑組明顯減低(P＜0.05)。見表2。

4)9月齡小鼠安理申組的乙酰膽堿水平及同月齡益腎化濁方組的乙酰膽堿、雌二醇、腎上腺皮質(zhì)激素及IL－2水平較同月齡安慰劑組變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.001);12月齡月齡小鼠安理申組的乙酰膽堿水平及同月齡益腎化濁方組的乙酰膽堿、雌二醇、腎上腺皮質(zhì)激素及IL－2水平較同月齡安慰劑組變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.001)。P值越小，差異越明顯。見表2。

3 討論

NEI網(wǎng)絡(luò)學(xué)說最初在1977年由Basedovsky提出，該學(xué)說認(rèn)為，看似獨(dú)立的神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)，實(shí)際上是一個(gè)有著廣泛聯(lián)系的有機(jī)整體，三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間存在著精密完整復(fù)雜的信息傳遞機(jī)制[6]。生理狀態(tài)下，NEI網(wǎng)絡(luò)各系統(tǒng)間通過自分泌或旁分泌方式維持著動(dòng)態(tài)平衡，通過相互刺激、相互制約，達(dá)到系統(tǒng)內(nèi)部的自我調(diào)劑和相對穩(wěn)定;但病理狀態(tài)下，某些因子的異常變化可誘發(fā)一系列的連鎖反應(yīng)，使穩(wěn)態(tài)偏離，造成疾病出現(xiàn)[7]。NEI網(wǎng)絡(luò)自穩(wěn)調(diào)節(jié)紊亂是所有疾病的共同本質(zhì)。AD是一種常見于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其病程長，致殘率高，目前治療該病尚無有效的藥物和方法。

乙酰膽堿(Ach)是腦內(nèi)與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)乙酰膽堿能神經(jīng)元缺少，Ach含量不足。膽堿酯酶抑制劑可抑制中樞突觸間隙的膽堿酯酶，阻止Ach的分解，修復(fù)AD患者中已喪失的膽堿能功能[8]。血漿腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醉含量的減低可引起下丘腦一垂體一腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)系統(tǒng)功能的改變[9]，亢進(jìn)的HPA軸可參與衰老相關(guān)的機(jī)體組分、代謝改變及腦老化[10]。研究表明，AD患者血清中睪丸酮及雌二醇水平明顯降低[11]。Pierschmann 等[12]研究發(fā)現(xiàn)老年人 IL－2、IL－4及IL－13的水平會(huì)顯著增高。近年研究發(fā)現(xiàn)白介素(IL－1、IL－2、IL－6、TNF、TGF)等細(xì)胞因子在AD病灶區(qū)大量表達(dá)，不僅與神經(jīng)元死亡及神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而且促進(jìn)細(xì)胞黏附分子等的表達(dá)，在AD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究同樣發(fā)現(xiàn)AD小鼠體內(nèi)Ach、雌二醇及ACTH的水平明顯減低，IL－2的水平明顯增高。

淫羊藿味辛甘性溫，補(bǔ)腎陽、益精氣，是常用的延年益壽藥物?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿主要成分為淫羊藿總黃酮和淫羊藿多糖等[13]，具有抗衰老、保護(hù)心腦血管及增強(qiáng)免疫等藥理活性[14]。另外，其還具有較強(qiáng)雌激素活性[15]。女貞子味甘苦性涼，滋補(bǔ)肝腎、填髓益精。其具有抗炎、抗衰老、降血糖、降血脂、血管保護(hù)及提高免疫功能等藥理作用[16]。而淫羊藿與女貞子配伍，更使其平補(bǔ)陰陽、益腎填精的功效倍增。黃芪補(bǔ)心脾、益氣血?，F(xiàn)代研究表明黃芪具有擴(kuò)張血管、抗血栓、抗自由基、調(diào)節(jié)免疫等作用[17]。其能有效阻止大腦皮層和海馬區(qū)的神經(jīng)軸突和突觸的消失;上調(diào)ACTH、皮質(zhì)醇及升高 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞平均百分率水平;降低IL－2、IL－6、TNF－α和INF－γ的mRNA表達(dá)水平[18]。補(bǔ)骨脂味辛苦性溫，壯腰益腎。現(xiàn)代研究表明其可通過提高下丘腦－垂體－性腺軸的敏感性，從而影響血清中雌激素和睪丸酮含量，發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用[19]。石菖蒲能夠化痰開竅、醒神益智。其內(nèi)含的揮發(fā)油和細(xì)辛醚有較強(qiáng)抑制乙酰膽堿酯酶活性的作用[20]。川芎其味辛性溫，善通利血脈，芳香走竄，能升能降，善于上行頭目，入腦開閉，可使血行流利，腦絡(luò)通暢。其內(nèi)含的川芎嗪易通過血腦屏障，可起到擴(kuò)張腦血管、增加血流量的目的。本研究表明諸藥合用可升高AD小鼠體內(nèi)Ach、雌二醇及ACTH的水平，降低IL－2的水平，從而起到調(diào)節(jié)NEI網(wǎng)絡(luò)平衡，防治AD疾患的作用;而安理申組僅Ach的水平可得到升高。表明中藥復(fù)方可通過整體多靶點(diǎn)作用于失穩(wěn)的NEI網(wǎng)絡(luò)，達(dá)到防治AD的作用。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，9月齡小鼠安理申組的Ach水平及同月齡益腎化濁方組的Ach、雌二醇、促腎上腺皮質(zhì)激素及IL－2水平較同月齡安慰劑組變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.001);12月齡月齡小鼠安理申組的Ach水平及同月齡益腎化濁方組的 Ach、雌二醇、ACTH及IL－2水平較同月齡安慰劑組變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.001)。P值越小，代表差異越明顯。提示AD疾病的早期干預(yù)可能對其治療效果會(huì)產(chǎn)生更為明顯的作用。

[1]吳江，賈建平，崔麗英，等.神經(jīng)病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:331－332.

[2]Papon MA，Whittington RA，El－ Khoury NB，Planel E，etal.Alzheimer＇s disease and anesthesia[J].Neurosci，2011，31(4):272.

[3]Hannestad J，Molljil DF，Diaz－Esnal B，et al.Age－de－Pendent ehanges in the nervous and endoerine eontrol of the thymus[J].Mierosc Res Tech，2004，63:94－101.

[4]鄭洪新，王擁軍，李佳，等.“腎藏精”與干細(xì)胞及其微環(huán)境及NEI網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，29(7):2267－2270.

[5]尹英杰.六味地黃丸(湯)異病同治規(guī)律的理論與臨床研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2003.

[6]伊煥發(fā)，甄星，張連軍，等.來氟米特對小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，2008，24(4):310－314.

[7]梁俊清，吳以嶺，孫士然，等.絡(luò)氣虛滯大鼠NEI網(wǎng)絡(luò)因子分泌失衡與血管內(nèi)皮功能障礙之間關(guān)系的研究[A].//絡(luò)病學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究(四)——第四屆國際絡(luò)病學(xué)大會(huì)論文集[C].2008:91－95.

[8]郭盈杉，張忠敏.抗老年癡呆藥——乙酰膽堿酶抑制劑進(jìn)展[J].河北化工，2008，31(3):14－16.

[9]陳忠良.中醫(yī)“腎虛”與腎上腺皮質(zhì)軸的關(guān)系及其臨床意義探討[J].福建醫(yī)藥雜志，1992，14(2):37－38.

[10]姚建平.神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的老齡化變化及調(diào)控[J].國外醫(yī)學(xué)(老年醫(yī)學(xué)分冊)，2004，25(4):160－166.

[11]解恒革，王魯寧，王曉紅，等.血清睪酮及雌二醇與老年男性癡呆類型和嚴(yán)重程度的關(guān)系[J].中華老年心腦血管病，2009，11(5):352－354.

[12]Peschmann P.The effect of age and gender on cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells and markers of bone metabolism[J].Exp Gerontol，2003，38(10):1119－1127.

[13]唐子濱，顧海華，柏燕萍，等.淫羊藿研究新進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，14(4):326－328.

[14]宋劍，王超，李知遙，等.淫羊藿總黃酮抗老年癡呆化學(xué)成分研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2009，11(8):23－26.

[15]趙丕文，王大偉，王玲巧，等.用小鼠子宮增重法篩選淫羊藿等10種中藥雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(10):686－689.

[16]吳喜鳳，韓淑英，朱麗莎，等.女貞子提取物對小鼠免疫功能的影響[J].華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10(3):303－304.

[17]黃飛華，夏翔，柳玉瑾，等.復(fù)方黃芪飲治療老年期癡呆60例臨床研究[J].中國臨床醫(yī)生，2002，30(9):51.

[18]汪元，劉健.黃芪對神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的藥理學(xué)作用研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2009，13(2):204－206.

[19]李璘，邱蓉麗，樂巍，等.補(bǔ)骨脂雌激素樣作用實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14(4):57－58.

[20]金虹，徐國波，黃毅.石菖蒲抑酶活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(9):2241－2242.