甜葉菊體外培養(yǎng)獲得甜菊糖的研究與應(yīng)用進(jìn)展

曹雪花，董花，劉娜（.甘肅省武威市涼州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，武威733000；.涼州區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理站，甘肅武威733000；3.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱50080）

甜葉菊體外培養(yǎng)獲得甜菊糖的研究與應(yīng)用進(jìn)展

曹雪花1，董花2，劉娜3*
（1.甘肅省武威市涼州區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，武威733000；2.涼州區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理站，甘肅武威733000；3.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080）

綜述了世界上甜葉菊使用體外繁殖技術(shù)，培養(yǎng)基添加物質(zhì)對甜葉菊誘導(dǎo)、生芽、生根及甜菊糖生產(chǎn)的影響，育種方法對甜菊糖生產(chǎn)的改良等。

甜葉菊；體外培養(yǎng)；培養(yǎng)基；甜菊糖；甜菊糖苷；萊鮑迪苷

甜葉菊無毒、無致癌、無突變[1]。甜葉菊所含的甜菊糖（steviol glycosides，SGs）作為一種天然的、無熱量、安全的、穩(wěn)定的、甜度高的甜味劑在廣泛應(yīng)用，甜菊糖的成分和含量與健康無病相匹配，甜葉菊及其提取物具有較低的血糖指數(shù)，因此不影響血糖，其中有些化合物還具有治療功效，具有降血壓特性，還具有抗菌和利尿等作用特性[2-3]。植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)用于植物育種，可對植物的生長發(fā)育和代謝調(diào)查研究，可使植物在自然條件下無法實(shí)現(xiàn)的微繁殖或體細(xì)胞胚胎發(fā)生大量的營養(yǎng)繁殖/或再生。體外培養(yǎng)也能獲得雜交植株，即使雜交育種無法授粉的植物，也可獲得體細(xì)胞雜種?；ㄋ幒托℃咦优囵B(yǎng)可獲得單倍體和雙單倍體，即生物是完全純合的。在誘導(dǎo)植物細(xì)胞突變和遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，體外技術(shù)的應(yīng)用最終獲得無病毒植株[4-5]。甜葉菊育種中使用體外繁殖技術(shù)是其繁殖的重要途徑，是產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)最快和最有效的方法。由于甜葉菊種子發(fā)芽率非常低，因此實(shí)際應(yīng)用該方法更有意義[6]。有性繁殖導(dǎo)致產(chǎn)生不同基因型和表型性狀，難以獲得甜菊糖等化學(xué)成分含量同質(zhì)的群體。在傳統(tǒng)的營養(yǎng)繁殖/繁殖方法中尋找解決方法需要大量的努力，遺傳材料的可用率是有限的。生物技術(shù)方法在實(shí)際中得到很好的應(yīng)用，并在不斷改進(jìn)中[7-8]。

1 培養(yǎng)基質(zhì)對培養(yǎng)過程的影響

1.1 生長調(diào)節(jié)劑的作用

植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)劑是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)生化過程的一類化合物，它們負(fù)責(zé)植物適當(dāng)?shù)纳L和細(xì)胞分裂以及對環(huán)境條件變化的反應(yīng)，如脅迫反應(yīng)。植物的反應(yīng)取決于這些化合物的濃度，甚至少量的劑量即可觀察到。體外培養(yǎng)應(yīng)用生長調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)不定芽、愈傷組織和生根等，選擇其適當(dāng)?shù)臐舛葘χ参锊牧系馁|(zhì)量和數(shù)量是至關(guān)重要的。許多文獻(xiàn)報道了優(yōu)化生長調(diào)節(jié)劑濃度對甜葉菊微繁殖的研究。MS培養(yǎng)基中添加2.0mg/L BA誘導(dǎo)最多的芽數(shù)是43.9芽/外植體，但這些芽很薄，含有許多側(cè)生芽，煉苗期間存活率很低[7]。不同濃度的BA、IAA、IBA+MS培養(yǎng)基對不定芽再生最有效的組合是：BA 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L，結(jié)果頂芽、不定芽和葉為外植體的增殖率分別為11%、10%和8%[5]。添加IBA的培養(yǎng)基再生效率低，稀釋雙倍卻對生根很好，生根率可達(dá)100%。該成分的培養(yǎng)基組合對芽的伸長也有積極作用。其它的組合，BA、NAA、KIN與生長素被證明是低效的。Bondarev等[9]觀察到0.1 mg/L BA對外植體可產(chǎn)生1.5以上的芽，但對生根有抑制（與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基比較）；另一方面，GA3促進(jìn)了芽和根的伸長[10]。Jain等人[11]觀察到BA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L對芽誘導(dǎo)最佳；使用BA 0.8mg/L和KIN 0.4mg/L的組合芽增殖達(dá)到最好的結(jié)果。在這些研究中初始外植體為葉和不定芽[13]。另一項(xiàng)研究，芽再生最優(yōu)組合為：MS+KIN 0.3mg/L，生根最優(yōu)組合為：MS+IBA 2.0mg/L[12]。MS分別添加BA、KIN和IAA或組合，最好的結(jié)果是：MS+BA 1.0 mg/L+IAA 0.5mg/L，與早期報道一致。繁殖率最高的外植體也是頂芽。然而，N6（Nitsch）培養(yǎng)基+IAA 1.0 mg/L對生根是最有效的[13]。Yadav等人[17]使用其他細(xì)胞激素組合包括BA與KIN或NAA用于不定芽的誘導(dǎo)。最好的結(jié)果：MS+BA 0.5 mg/L+KIN 0.5 mg/L；在MS+ GA3 0.5mg/L培養(yǎng)基，獲得最高的莖伸長和葉片數(shù)量最高；用IBA 2.0mg/L，生根最高（87.8%）也最快，同時測試了NAA和IAA效果。反之，在沒有任何調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基沒有根生長[14]。Thiyagarajan等[3]在MS培養(yǎng)基上添加不同濃度的BA和KIN，獲得了不定芽和莖節(jié)外植體；另一種情況，添加不同濃度的IAA、IBA和NAA，在BA 1.0mg/L培養(yǎng)基上增殖率最高，每外植體達(dá)到15.69個芽，發(fā)生率為94.5%。實(shí)驗(yàn)旨在大規(guī)模生產(chǎn)節(jié)點(diǎn)外植體和不定芽，然后轉(zhuǎn)移到MS+BA 1.0mg/L培養(yǎng)基。經(jīng)過3個增殖周期，每個外植體獲得了123個芽，后來被轉(zhuǎn)移到1/2MS添加不同濃度的NAA、IAA、IBA和生長素培養(yǎng)基中，結(jié)果培養(yǎng)是成功的。最高的生根培養(yǎng)基是：1/2MS+NAA 0.4mg/L[3]。矮壯素（CCC）與IBA組合，獲得甜葉菊最佳的體外培養(yǎng)，研究表明，在添加CCC和IBA的培養(yǎng)基比單用CCC或IBA培養(yǎng)基發(fā)育和性狀更好。培養(yǎng)基中添加CCC 3.0mg/L+IBA 3.0 mg/L對增加芽數(shù)、生存率、生物量和葉綠素及改善甜菊糖含量被證明是最有效的[15]。總之，文獻(xiàn)資料表明，外源植物生長調(diào)節(jié)劑用于芽誘導(dǎo)，通常為：MS+BA 1.0mg/L+細(xì)胞激素1.0mg/L或BA1.0mg/L+IAA 1.0mg/L。外植體繁殖率最高的是頂芽。生根及其伸長生長最有效的是，在MS培養(yǎng)基中或MS培養(yǎng)基雙倍稀釋濃度添加2.0mg/L IBA或NAA 0.4mg/L。

1.2 礦物成分的影響

礦質(zhì)營養(yǎng)是植物離體培養(yǎng)的基本元素，在基質(zhì)中其濃度和比例對植株的生長速度和質(zhì)量起著基本作用，因此在選擇培養(yǎng)基的成分時這兩個參數(shù)必須指定[4]。Ibrahim等研究了不同濃度的MS培養(yǎng)基及其主要成分對甜葉菊體外發(fā)育的影響。最好的結(jié)果是用MS培養(yǎng)基并改良：NH4NO31237.5mg/L+KNO3950mg/L+MgSO4185mg/L+CaCl2.2H2O 440 mg/L+KH2PO485mg/L+豐富的微量元素+蔗糖30 g/L+甘氨酸2.0mg/L+吡哆醇0.5mg/L+煙酸0.5mg/L+硫胺素0.1mg/L，也以瓊脂1.5mg/L做凝固[16]。在MS培養(yǎng)基上加倍濃度的礦物鹽對植株生長有良好作用，但導(dǎo)致甜菊糖水平的下降[9]。微量元素的組成和濃度對芽的誘導(dǎo)和葉綠素含量的影響研究表明，該項(xiàng)目使用不同濃度的基質(zhì)鈷、鐵、錳、銅和鉀碘化物與標(biāo)準(zhǔn)的MS培養(yǎng)基中所獲得的結(jié)果比較，對于芽誘導(dǎo)的積極影響的方案是：MnSO460.4mg/L+CoCl20.26mg/L+KI 1.7mg/L；而增殖培養(yǎng)基為：CoCl20.26 mg/L+CuSO41.6mg/L+MnSO475.5mg/L+ZnSO414.4mg/L+H3BO324.7mg/L；生物量和葉綠素含量增長的培養(yǎng)基：Fe2(SO4)380mg/L+CoCl20.4mg/L+KI 1.7mg/L[4，11]。其他文獻(xiàn)資料表明，銅0.03mg/L對芽的誘導(dǎo)和增殖及對葉綠素含量和生物量有積極影響[11]。

1.3 碳源效應(yīng)

糖類提供了培養(yǎng)基的碳源和能量，加速培養(yǎng)的生長發(fā)育，使其可獨(dú)立光合作用。其過程受體外氣體交換條件的抑制。因此，CO2對光合作用是有用的。此外，并非所有體外生長的細(xì)胞都必須具有光合能力和碳水化合物的存在。另一方面，糖的存在可以促進(jìn)培養(yǎng)基上微生物的生長。在生物反應(yīng)器中，對糖的種類和濃度對甜葉菊芽和甜菊糖含量的影響進(jìn)行了研究，與蔗糖相比，在含有果糖或葡萄糖的培養(yǎng)基對根系統(tǒng)的發(fā)育更有利，但葉質(zhì)量和甜菊糖含量下降了。為改善組織中甜菊糖含量，測試了不同濃度碳源（1%～5%），而最佳的蔗糖濃度為3%，高濃度促進(jìn)了根系統(tǒng)發(fā)育和生物質(zhì)的積累[9]。

1.4 甜葉菊體外愈傷組織培養(yǎng)及懸浮培養(yǎng)的影響

體外培養(yǎng)愈傷組織，由于其全能性導(dǎo)致組織分化，用于間接器官發(fā)生或形成體細(xì)胞胚。愈傷組織培養(yǎng)一般用于獲得植物代謝產(chǎn)物。據(jù)有關(guān)甜葉菊的文獻(xiàn)，對愈傷組織誘導(dǎo)最有效的培養(yǎng)基為：MS+2,4-D 0.1mg/L[15]或BA 2.0～3.0mg/L+NAA 2.0mg/L[17]。愈傷組織誘導(dǎo)芽的發(fā)育為：MS培養(yǎng)基添加BA和2,4-D[12]。在未添加外源生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基未觀察到愈傷組織發(fā)育，說明培養(yǎng)過程是復(fù)雜的，需要添加生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[17]。經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的植物再生，胚性愈傷組織從葉片和小花外植體而形成[18]。甜葉菊懸浮培養(yǎng)的最佳生長是：2,4-D 0.06mg/L+BA 0.6mg/L+抗壞血酸0.01mg/L，該組合的生長速率是2.61/d[17]。甜葉菊懸浮培養(yǎng)的最優(yōu)改良的礦物鹽濃度的標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基：NH4NO32.0mg/L+KNO35.7mg/L+MgSO40.5mg/L+KH2PO410.2mg/L。另有研究：提高鹽的濃度對甜葉菊也有較好的效果[19]。

1.5 瓶內(nèi)到瓶外煉苗的影響

將體外不育植株轉(zhuǎn)到眾多具脅迫誘導(dǎo)因素外部環(huán)境的煉苗。植株必須建立一個功能根系、高效蒸騰機(jī)制、保護(hù)層，開始光合作用。甜葉菊煉苗的基質(zhì)為混合砂土、蛭石、蚯蚓糞、或椰殼纖維泥炭。比較分析表明，使用砂、土壤和蚯蚓糞以1∶1∶1混合，植株存活率為82%，只用椰殼纖維泥炭的生存率為70%[13，17，20]。

2 幾種因素對甜葉菊體外培養(yǎng)甜菊糖生產(chǎn)的影響

甜葉菊中甜菊糖最常見的甜菊甜味物質(zhì)是甜菊糖苷（stevioside，STV）、萊鮑迪苷A（Reb A）和萊鮑迪苷C（Reb C）。在傳統(tǒng)方式種植的甜葉菊，每種化合物的含量占葉干質(zhì)量的1%或更高。STV、Reb A和Reb C含量分別達(dá)到3.3mg/g、1.9mg/g和0.7mg/g干物質(zhì)[10]。其余的甜菊糖含量很低。不同的研究者體外組織培養(yǎng)植株的甜菊糖含量差異很大。Swanson[21]沒有在愈傷組織或芽檢測到甜菊糖的存在，認(rèn)為，只有充分發(fā)育的植株可以生產(chǎn)這些化合物。其他作者證明培養(yǎng)的芽有能力合成這些化合物[10，15]。一些作者在愈傷組織和懸浮培養(yǎng)沒有檢測到甜菊糖[10]，在愈傷組織培養(yǎng)，即使是在水平高出一倍的甜菊葉都沒有[4]。2001年的文獻(xiàn)表明，體外生長的甜菊葉和莖的甜菊糖含量比傳統(tǒng)方式分別低5和3倍[10]。愈傷組織培養(yǎng)幾乎不含有任何苷類；Taware等[12]的結(jié)果相反，在愈傷組織中STV含量較高。

懸浮培養(yǎng)的甜菊糖的含量變化為15μg/g～3803μg/g，表現(xiàn)為與細(xì)胞繁殖周期相關(guān)的有特色的動態(tài)，其含量在對數(shù)增長階段或在其結(jié)束時值最大，然后降到平穩(wěn)[10，17]。這表明在懸浮培養(yǎng)的生長、細(xì)胞分裂與STV的合成呈正相關(guān)關(guān)系。培養(yǎng)基成分及礦物鹽的含量，糖、生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，都可能對獲得的材料的STV含量水平產(chǎn)生影響[18]。在愈傷組織，在添加7.5mM脯氨酸和5%PEG時，SGs含量分別從0.27%（對照）增加到1.09%和1.83%。在懸浮培養(yǎng)下，相同的脯氨酸和PEG濃度使SGs含量在第10天分別從1.36%（對照）增加到5.03%和6.38%[22]。0.5 g/L ALG和2.0 g/L酵母提取物處理的體外苗STV產(chǎn)量分別從1.56mg/g干重增加到14.69和14.54mg/g。僅在0.5 g/L海藻酸（ALG）處理觀察到Reb A為0.55mg/g干重，田間生長的植物的STV含量為15.06mg/g干重[23]。再生植株和種子幼苗轉(zhuǎn)移到大田16周，其植株葉SGs含量（葉干重比）之間沒有差異，Reb A含量為4.7%～5.0%（w/w），而STV含量為6.4%～6.9%（w/w）[24]。外源生長調(diào)節(jié)劑幾乎總是使甜菊糖水平下降[9]。這也部分解釋了不同培養(yǎng)基類型甜菊糖的不同濃度變化。然而，沒有發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外植體類型和糖苷含量間這樣的相關(guān)性[10]。細(xì)胞分化似乎對糖苷產(chǎn)生影響。據(jù)Bondarev等人，在形成愈傷組織的這些化合物的含量高4～5倍，而在形成芽的情況下甚至比懸浮培養(yǎng)高37倍[10]。在甜菊糖的合成過程也存在細(xì)胞解體的作用[17]。

甜菊糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)對于其生產(chǎn)是很重要的，因?yàn)闆Q定其味覺特性。在甜菊糖的差異，特別是由于很多配基轉(zhuǎn)移酶的存在，會發(fā)生殘留糖被糖苷配基取代現(xiàn)象[25]。糖苷類的多樣性體現(xiàn)在他們的特性，尤其是在感知的味覺和在水中的溶解度。總之，當(dāng)羥基或糖基團(tuán)在C-19位時即能感知到甜味，這些位置取代基團(tuán)的差異決定化合物的性質(zhì)[26]。例如，Reb A與STV比在味覺上感覺更好，STV具有特定的回味，有些人覺得不愉快或苦味，而且沒有Reb A那么甜[4]。據(jù)觀察，STV和Reb A的等同物分別是杜爾可苷A（Dul A）和Reb C，是葡糖基團(tuán)被鼠李糖取代的結(jié)果。到目前為止，基于苷配基（不同于分離自Stevia paniculata,Stevia ovata及Rubus suavissimus的甜菊醇）的糖苷類的研究表明，甜菊醇產(chǎn)生最甜的糖苷類，甜菊糖的味道依賴于其結(jié)構(gòu)[26]。因此，已經(jīng)嘗試修改它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)以期改進(jìn)味道。由于其天然來源（和食品應(yīng)用），酶修飾法是首選的化學(xué)方法。生物轉(zhuǎn)化作用是酶催化的化學(xué)化合物的轉(zhuǎn)化過程?？煽氐纳镛D(zhuǎn)化已對經(jīng)濟(jì)價值化合物進(jìn)行修飾和生產(chǎn)。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)功能之一是化合物的糖基團(tuán)的修飾、連接、基團(tuán)的拆分和轉(zhuǎn)糖基。一般來說，生物催化是一個有用的工具，例如特定的異構(gòu)體的合成、選擇性合成、低毒性或低活性化合物的合成。這通常是并不需要特殊的反應(yīng)條件和不產(chǎn)生危險廢物的化學(xué)合成，對人類和環(huán)境更友好。CGTase與淀粉反應(yīng)形成環(huán)糊精，也催化反式α-1,4反式葡糖基化，在可溶性淀粉存在下STV在CGTase作用下分解為糖苷。性味改良了更多的葡糖基化化合物，雖然C-19位影響糖基化衍生物的口味。后來被用于其他反應(yīng)中，使用更特異的酶，以便獲得最需要的化學(xué)化合物[26]。支鏈淀粉酶似乎比CGTase更高效，所需產(chǎn)品具有較高的特異性[27]。在糊精葡聚糖酶（DDase）也被用于STV的苦-甜化合物的改良[28]。一個有趣的例子：經(jīng)Actinomycete培養(yǎng)STV也可以形成C13-O-β-6(2)-β-glucosylsophorosyl-C19-O-β-glucopyranosyl steviol。

3 通過育種改進(jìn)甜菊糖的生產(chǎn)

傳統(tǒng)選育方法和分子工具結(jié)合選擇最期望的特性，即通過多倍體化或在基因組更徹底的調(diào)停和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因品種，與特定特性結(jié)合進(jìn)行選擇性標(biāo)記測定。所有這些方法都有助于生物體的發(fā)展和完善遺傳和商業(yè)需要，了解給定的特征及其遺傳本質(zhì)是進(jìn)一步修改生物體性狀的有力工具。代謝途徑分析、測定酶參與途徑、調(diào)控的方法和基因的負(fù)責(zé)過程提供了重要的信息，均可幫助開發(fā)所需的性狀[29]。

甜葉菊最典型的特點(diǎn)是其生物合成甜菊糖的能力，因此該物種的繁育研究針對這些化合物含量與成分的改進(jìn)。由于STV的特殊味道使我們注意到降低其在總甜菊糖含量的份額，而增加Reb A和Reb C卻沒有苦味。在葉中甜菊糖含量最高，因此其他改良性狀是葉產(chǎn)量和葉莖質(zhì)量比。研究表明甜葉菊經(jīng)濟(jì)上重要的繁殖性狀具有較高的種群內(nèi)的變異和高遺傳力特性，這些性狀包括葉產(chǎn)量（h2=62.1）、葉莖比（h2=78.8）和甜菊糖含量（h2=76.6）。因遺傳力高容易進(jìn)行選擇修改[30]。此外，STV和Reb A含量呈負(fù)相關(guān)，而Reb A與Reb C含量呈正相關(guān)。Reb A是否存在由一個單一的主基因控制，而它的量是由較高的位點(diǎn)數(shù)目調(diào)節(jié)。Reb A和Reb C比率由單一加性基因決定，這些性狀的基因進(jìn)行共分離。同一個酶負(fù)責(zé)兩種化合物的合成[4，31]。甜葉菊這些特點(diǎn)使其成為育種潛力高、易于改良的植物，能獲得更高效的品種。

在甜葉菊，如果植株經(jīng)常自花授粉，在特定的性狀常表現(xiàn)出很高的差異性，那么選擇是獲得改良品種的有效方法。甜葉菊經(jīng)過30多年的選育，葉中甜菊糖的含量已從2%～10%提高到20%（干物質(zhì)）[29]。迄今為止基于表型性狀已經(jīng)做了選擇，更取決于選育條件和植物的年齡。據(jù)估計，在幼苗的情況下，只有20%～30%的變異是基因決定的。因此，應(yīng)對成熟植株進(jìn)行選擇，但又延長了所需的時間。此外，用HPLC測定葉糖苷含量是昂貴和費(fèi)時的[32]。生物技術(shù)工具為所需的甜葉菊性狀改善提供了機(jī)會。在花藥培養(yǎng)體外組織培養(yǎng)用于大規(guī)模繁殖和/或獲得完全單倍體基因型。分子遺傳標(biāo)記鑒定針對影響甜菊糖的生物合成的基因型的基因定位。更深入理解甜菊糖的生化合成途徑、調(diào)節(jié)基因如何表達(dá)也很重要。誘導(dǎo)突變可能成功地被用于改善種群內(nèi)變異性低的性狀。到目前為止，很少有甜菊糖產(chǎn)量高的甜葉菊品種獲取專利。選育的栽培種具有特定用途或觀賞性狀、穩(wěn)定性和均勻性，通過選擇、雜交育種、多倍體化或突變等方法而獲得。品種最常見的是無性系，為保持其性狀需要限制其生殖繁殖，代替以利用營養(yǎng)繁殖。

在性狀高變異的異花受粉物種（如甜葉菊）中，用特殊技術(shù)改良數(shù)量性狀進(jìn)行循環(huán)選擇。重組選擇與普通群體及進(jìn)一步重組雜交選育相比性狀表現(xiàn)較好。在亞群決定所需性狀的等位基因發(fā)生率比初始種群高。如此循環(huán)重復(fù)，直到達(dá)到顯著效果。改良糖苷含量的甜葉菊育種品系RSIT 94-1306和RSIT 751是控制雜交育種和選擇方法獲得的[30]。在1998年，由于其Reb C與STV比率的獨(dú)特性，育成了RSIT 95-166-13品系[33]。這3個品系都是營養(yǎng)體無性繁殖選育的。發(fā)展綜合和復(fù)雜的品種是特別重要的，生產(chǎn)這樣的植物如，AC Black Bird和PTA－444，即改變糖苷含量[34-35]。一些品種，盡管糖苷生產(chǎn)非常高，因自交不育只能進(jìn)行營養(yǎng)體無性繁殖。然而，PTA－444可由種子繁殖。使用營養(yǎng)體育種提高了植物生產(chǎn)的成本，并限制其商業(yè)用途，但它們?nèi)匀豢捎糜陔s交種生產(chǎn)[20，34]。

植物雜交種是由不同的種、屬雜交育種而成的。有意的、可控的雜交生產(chǎn)允許引入新的基因進(jìn)入基因庫，有助于豐富遺傳多樣性。這對作物同質(zhì)群體是有益的，它可以提高雜種優(yōu)勢，也可能是育種者利用抗病或活力等優(yōu)良性狀創(chuàng)造新品種的方法。在2006年，Wang獲得選育甜菊雜交植物的專利方法[36]。在2001年，Sun用生產(chǎn)營養(yǎng)體雜交的技術(shù)獲得種子的方法[32]。一種營養(yǎng)雜交體形成是將植物的一部分嫁接到另一株植物上的結(jié)果。誘發(fā)突變是一種工具，與傳統(tǒng)的育種方法比，加速了植物所需性狀的培育。使用物理和化學(xué)的誘變劑，在一個群體更快地獲得遺傳多樣性。該方法的應(yīng)用，給定的性狀在群體中顯示非常低的變異。直到現(xiàn)在，這個方法還沒有用于甜葉菊，因?yàn)槠渌椒ㄊ且子谑褂玫暮透咝У摹?/p>

多倍化成功地用于提高農(nóng)作物產(chǎn)量。多倍體植株往往具有環(huán)境條件的適應(yīng)性強(qiáng)和較大的器官與細(xì)胞。不同染色體數(shù)目的雜交育種而產(chǎn)生的植物通常是完全或部分不育的。通過秋水仙素溶液處理甜葉菊種子或經(jīng)四倍體作母本與二倍體作父本雜交育種而獲得三倍體。三倍體植株葉大、Reb A含量較高[37]，四倍體的葉片較大、較厚，可能使生物產(chǎn)量增加。所有的多倍體都有非功能性花粉[38]?；ㄋ幣囵B(yǎng)，即從未成熟的花藥在體外培養(yǎng)形成，用于獲得單倍體植株。它們可獲得的雙單倍體植株是完全純合的。純合群體的性狀可用于雜交。以花藥培養(yǎng)成功地再生甜葉菊植株[4]。在利用分子標(biāo)記與特定性狀連鎖的標(biāo)記識別創(chuàng)造新的可能性和植物育種途徑。在植物發(fā)育中借助可檢測的分子標(biāo)記，使所需的性狀發(fā)現(xiàn)更早。這可無需生產(chǎn)成熟的植株，并大大縮短評估性狀所需的時間。而且，能夠在較小的種群中執(zhí)行選擇過程。在1999年，用RAPD創(chuàng)建了甜葉菊的遺傳圖技術(shù)[32]。遺傳圖譜構(gòu)建甜菊選育中（基于遺傳標(biāo)記）使用分子選擇技術(shù)，并將為甜葉菊基因組組織和代謝研究奠定基礎(chǔ)。下一步的研究應(yīng)包括與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的特異標(biāo)記，并對其進(jìn)行整形，使其易于在植物材料中應(yīng)用。盡管上述甜葉菊的研究相當(dāng)有限，將來的工作，開發(fā)新品種和調(diào)整育種技術(shù)將通過提高產(chǎn)質(zhì)量增強(qiáng)其在食品工業(yè)和保健上的應(yīng)用價值與潛力。

[1]Brusick DJ.A critical review of the genetic toxicity of steviol and steviol glycosides[J].Food Chem Toxicol,2008,46(7):S83-S91.

[2]吳則東，張文彬，吳玉梅，劉乃新.世界甜葉菊發(fā)展概況[J].中國糖料，2016，38（4）：62-65

[3]Thiyagarajan M,Venkatachalam P.Large scale in vitro propagation of Stevia rebaudiana(Bert)for commercial application: Pharmaceutically importantand antidiabeticmedicinal herb[J].Ind.Crops Prod,2012,37(1):111-117.

[4]A Luwańska，A Perz，GMańkowska，KWielgus.Application of in vitro stevia(Stevia rebaudiana Bertoni)cultures in obtaining steviol glycoside richmaterial[J].Herba Polonica,2015,61(1):50-63

[5]Sivaram L,Mukundan U.In vitro culture studies on Stevia rebaudiana[J].Vitro Cell Dev Biol-Plant,2003,39(5):520-523.

[6]Carneiro JWP,Muniz AS,Guedes TA.Greenhouse bedding plant production of Stevia rebaudiana(Bert)Bertoni[J].Can JPlant Sci, 1997,77(3):473-474.

[7]Hassanen SA,Rasha MA.Khalil.Biotechnological studies for improving of Stevia(Stevia rebaudiana Bertoni)in vitro plantlets[J]. Middle-East JSci Res,2013,14(1):93-106.

[8]Jain P,Kachhwaha S,KothariInt SL.Biotechnology and metabolic engineering of Stevia rebaudiana(Bert.)Bertoni:perspective and possibilities[J].JLife Sci Bt&Pharm Res,2014,3(2):15-37.

[9]Bondarev N,Reshetnyak O,Nosov A.Effects of nutrientmedium composition on developmentof Stevia rebaudiana shoots cultivated in the roller bioreactor and their production of steviol glycosides[J].Plant Sci,2003,165(4):845-850.

[10]Bondarev N,Reshetnyak O,Nosov A.Peculiarities of diterpenoid steviol glycoside production in in vitro cultures of Stevia rebaudiana Bertoni[J].Plant Sci,2001,161(1):155-163.

[11]Jain P,Kachhwaha S,Kothari SL.Improved micropropagation protocol and enhancement in biomass and chlorophyll content in Stevia rebaudiana(Bert.)Bertoniby using high copper levels in the culturemedium[J].SciHortic,2009,119(3):315-319.

[12]Taware AS,Mukadam DS,Chavan AM,Taware SD.Comparative studies of in vitro and in vivo grown plants and callus of Stevia rebaudiana(Bertoni)[J].Int J Integr Biol,2010,9(1):10-15.

[13]Anbazhagan M,Kalpana M,Rajendran R,Natarajan V,Dhanave D.In vitro production of Stevia rebaudiana Bertoni[J].Emir J Food Agric,2010,22(3):216-222.

[14]Yadav AK,Singh S,DhyaniD,Ahuja PS.A review on the improvementof stevia[Stevia rebaudiana(Bertoni)][J].Can JPlant Sci, 2011,91(1):1-27.

[15]Dey A,Kundu S,Bandyopadhyay A,Bhattacharjee A.Efficientmicropropagation and chlorocholine chloride induced stevioside production of Stevia rebaudiana Bertoni[J].CR Biol,2013,336(1):17-28.

[16]Ibrahim IA,Nasr MI,Mohammed BR,El-ZefzafiMM.Nutrient factors affecting in vitro cultivation of Stevia rebaudiana[J].Sugar Tech,2008,10(3):248-253.

[17]Mathur S,Shekhawat GS.Establishment and characterization of Stevia rebaudiana(Bertoni)cell suspension culture:an in vitro approach for production of stevioside[J].Acta Physiol Plant,2013,35(3):1-9.

[18]Madan S,Ahmad S,Singh GN,KohliK,Kumar Y,Singh R,Garg M.Stevia rebaudiana(Bert.)Bertoni–a review[J].Indian JNat Prod Res,2010,1(3):267-286.

[19]Bondarev N,Nosov A,Kornienko A.Influence of several cultural factors on the growth and efficiency of Stevia callus and suspension cultures[J].Biotechnology,1997,7(8):30-37.

[20]Lee KR.,Park JR,Choi BS.Studies on the callus culture of stevia as a new sweetening source and the formation of stevioside[J]. Korean JFood Sci Technol,1982,14(2):179-183.

[21]Swanson SM,Mahady GB,Beecher CWW.Stevioside biosynthesis by callus,root,shootand rooted-shoot cultures in vitro[J].Plant Cell Tissue Organ Cult,1992,28(2):151-157.

[22]Gupta P,Sharma S,Saxena S.Biomass Yield and Steviol Glycoside Production in Callus and Suspension Culture of Stevia rebaudiana Treated with Proline and Polyethylene Glycol[J].Appl Biochem Biotechnol.,2015,176(3):863-874

[23]M Bayraktar，E Naziri，IH Akgun，F(xiàn) Karabey，E Ilhan,et al.Elicitor induced stevioside production,in vitro shoot growth,and biomass accumulation inmicropropagated Stevia rebaudiana[J].Plant Cell Tissue&Organ Culture,2016:127(2):289-300.

[24]B Yücesan，A Mohammed，R Büyükg??men，CAltug，SGürel.Biotechnological Aspects on High-Quality Stevia(Stevia rebaudiana Bertoni)Production[C].World Convention on Stevia:Stevia Tasteful,2015

[25]Richman A,Swanson A,Humphrey T,Chapman R,McGarvey B,Pocs R,Brandle J.Functional genomics uncovers three glucosyltransferases involved in the synthesis of themajor sweetglucosides of Stevia rebaudiana[J].Plant J,2005,41(1):56-67.

[26]Kinghorn AD.Stevia:The Genus Stevia[EB/OL].Londyn:Taylor&Francis,2002.

[27]Lobov SV,Kasai R,Ohtani K.Enzymic Production of Sweet Stevioside Derivatives:Transglucosylation by Glucosidases[J].Agric Biol Chem,1991,55(12):2959-2965.

[28]Yamamoto K,Yoshikawa K,Okada S.Effective production ofglycosyl-steviosidesbyα-1,6 transglucosylation ofdextrin dextranase[J]. Biosci Biotechnol Biochem.,1994,58:1657-1661.

[29]Yadav SK,Guleria P.Steviol Glycosides from stevia:biosynthesis pathway review and their application in foods and medicine[J]. Crit Rev Food SciNutr.,2012,52:988-998.

[30]Brandle JE,Rosa N.Heritability for yield,leaf:stem ratio and stevioside content estimated from a landrace cultivar of Stevia rebaudiana[J].Can JPlant Sci.,1992,72(4):1263-1266.

[31]Brandle J.Genetic control of rebaudioside A and C concentration in leaves of the sweet herb,Stevia rebaudiana[J].Can JPlant Sci.,1999,79(1):85-91.

[32]Sun J.Method for breeding hybridized seed of Stevia rebaudinum[P].China(SIPO)Patentno.CN1237720-A.,2001.

[33]Brandle J,Sys EA,Marsolais AA.Stevia plant named`RSIT 95-166-13`[P].USPatent no.USPP10563 P,1998.

[34]Brandle J.Stevia rebaudiana with altered steviol glycoside composition[P].USPatent no.US 6255557 B1,2001.

[35]Morita T,Bu Y.Variety of Stevia rebaudiana Bertoni[P].USPatentno.US 6031157 A,2000.

[36]Wang Q.Systemic asexual stevia parentselection breeding process for producing hybrid[P].China(SIPO)Patentno.CN1985575 B., 2007.

[37]ShuichiH,Tsuneo Y,SatoshiF.Breeding of tyriploid plantsof stevia(Stevia rebaudiana Bertoni)with high rebaudioside A content[J]. Jpn JTrop Agric,2001,45(4):281-289.

[38]Oliveira V.de,Forni-Martins ER,Magalh?es PM,Alves MN.Chromosomal and morphological studies of diploid and polyploid cytotypes of Stevia rebaudiana(Bertoni)Bertoni(Eupatorieae,Asteraceae)[J].GenetMol Biol 2004,27(2):215-222.

Advances in Research and Application of Stevia in vitro Culture to Im prove Steviol G lycoside Content

CAO Xue-hua1,DONG Hua2,LIU Na3*
(1.Agricultural Technology Service Center of Liangzhou District,Wuwei733000,Gansu;2.Agricultural ProductQuality Safety Supervision and Management Station of Liangzhou District,Wuwei733000,Gansu;3.Crop Academy of Heilongjiang University/ Sugar Beet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080,Heilongjiang)

The use of in vitro propagation techniques of Stevia in the world was introduced,and the effects of culturemedium on the induction,germination,rooting and steviol glycoside,and effects of breeding approach on production of steviol glycosideswere summarized.

Stevia;in vitro culture;medium;steviol glycosides;stevioside;rebaudioside A

S566.9

B

1007－2624（2017）04－0048－05

10.13570/j.cnki.scc.2017.04.017

2012-02-27

曹雪花（1974-），女，甘肅武威人，農(nóng)藝師，主要從事作物病蟲害測報與防治工作。

劉娜（1974-），女，黑龍江通河人，助理研究員，主要從事甜菜生理學(xué)和栽培學(xué)研究。E-mail：ln5-8@163.com