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    慢性腦低灌注大鼠海馬組織中IDO的變化1)

    2012-01-24 08:59:00張敏慧韓彥青李光來李東芳裴宇恒
    關(guān)鍵詞:性反應(yīng)象限迷宮

    張敏慧,韓彥青,李光來,李東芳,裴宇恒

    慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion)是神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的病理狀態(tài),多項(xiàng)基礎(chǔ)與臨床研究都顯示無論是阿爾茲海默?。ˋD)還是血管性癡呆(VaD)都存在不同程度的慢性腦低灌注。目前對(duì)慢性腦低灌注導(dǎo)致認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙的機(jī)制尚不完全清楚。近年來有報(bào)道,炎性免疫反應(yīng)在癡呆等慢性缺血性腦血管病方面有重要作用。近年發(fā)現(xiàn),在干擾素(IFN-γ)作用下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞都能表達(dá)吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要作用[1]。

    本實(shí)驗(yàn)采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)模型(2VO)模擬慢性低灌注狀態(tài),用Morris水迷宮檢測(cè)2VO大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力變化,通過觀察大鼠海馬IFN-γ、IDO的表達(dá),探討IDO在慢性腦低灌注導(dǎo)致認(rèn)知功能損害炎性發(fā)病機(jī)制中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物 成年健康雄性 Wistar大鼠36只,體質(zhì)量(203.8±7.8)g,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,在具有通風(fēng)設(shè)備的動(dòng)物房?jī)?nèi)籠養(yǎng),在實(shí)驗(yàn)前后過程中均給予充足的水及食物。隨機(jī)分成假手術(shù)組與模型組,各18只。

    1.2 動(dòng)物模型的制備 參照 Wakita等[2]的方法進(jìn)行2VO模型制備。大鼠于術(shù)前12h禁食,4h禁水。10%水合氯醛(350 mg/kg體重)腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥固定,行腹側(cè)頸正中切口,鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,用4號(hào)手術(shù)線行雙重結(jié)扎。術(shù)后縫合切口并連續(xù)3d肌肉注射2×105U青霉素鈉,放回籠中保溫(26℃)飼養(yǎng)。對(duì)照組處理步驟同上,但不進(jìn)行頸總動(dòng)脈結(jié)扎。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中。模型組大鼠死亡3只,假手術(shù)組大鼠全部存活。

    1.3 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試 動(dòng)物模型制備4周后行水迷宮測(cè)試,實(shí)驗(yàn)參照Vorhees等[3]總結(jié)的方法進(jìn)行,主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)2個(gè)部分。定位航行實(shí)驗(yàn):連續(xù)訓(xùn)練5d,每天上午、下午2個(gè)時(shí)段,每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練3次,分別從3個(gè)象限入水。發(fā)現(xiàn)平臺(tái)后,讓其在平臺(tái)上站立30s,將大鼠從平臺(tái)上拿下來休息60s,再隨機(jī)由下一象限入水進(jìn)行試驗(yàn),如果120 s內(nèi)找不到平臺(tái),則由操作者幫助其上平臺(tái),潛伏期記為最高分120s。記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)。每天計(jì)算其平均數(shù)??臻g探索實(shí)驗(yàn):用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力,定位航行實(shí)驗(yàn)后,即在第6天上午,撤除水下平臺(tái),取任意1個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中,測(cè)定其120s內(nèi)在平臺(tái)象限的游泳距離占總距離的百分比(distance percentage,DP)。

    1.4 取海馬 各組大鼠行為觀察結(jié)束后,將大鼠麻醉后斷頭處死,迅速剝離腦組織,沿視交叉前端作冠狀切面,立即在冰盒上無菌分離出海馬組織,置-70℃冰箱/10%多聚甲醛中備用。

    1.5 IDO的檢測(cè) 海馬組織和生理鹽水1∶9比例冰上勻漿,將海馬研磨成勻漿,3 500r/min離心10min,取上清液。試驗(yàn)中采用IDO試劑盒檢測(cè),采用比色法在酶標(biāo)板上反應(yīng)。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管,第1管加蒸餾水950μL,第2~8管加入蒸餾水500 μL,在第1管中加入100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL,混勻后加樣器吸出500μL,移至第2管,如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋,從第7管中吸出500μL棄出,第8管為空白對(duì)照。每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品20μL。每孔加入底物工作液100μL,置37℃暗處反應(yīng)15min。每孔加入100μL終止液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IDO與底物工作液顯色30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值(OD)。IDO濃度與OD值成正比,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IDO濃度。

    1.6 免疫組織化學(xué)法 觀察INF-γ的表達(dá):大鼠海馬組織經(jīng)4℃的4%多聚甲醛72h充分固定后,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制備厚4μm組織切片。切片經(jīng)脫蠟至水化,3%H2O2滅活內(nèi)源性酶,蒸餾水沖洗;枸櫞酸鹽緩沖液,微波熱修復(fù)20min,PBS洗滌;5%BSA封閉20min,傾去;滴加適當(dāng)稀釋的一抗4℃過夜,PBS緩沖液洗滌;滴加兔抗大鼠二抗37℃反應(yīng)30min,PBS緩沖液洗滌;滴加試劑SABC,PBS洗滌;DAB顯色,自來水充分沖洗,蘇木素-伊紅復(fù)染,脫水,透明,封片。選取海馬區(qū)CA1區(qū),將切片在OLYMPUS BX51正置熒光顯微鏡下觀察,采用Image-Pro plus圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析,以陽性細(xì)胞的平均光密度值表示IFN的表達(dá)水平。免疫組化染色結(jié)果判定:胞漿呈棕黃色為陽性細(xì)胞。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,2VO大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力下降。水迷宮結(jié)果:與假手術(shù)組比較,模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng),平臺(tái)象限游泳距離百分比減少(P<0.05);隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加,兩組大鼠的學(xué)習(xí)能力均有提高,但模型組逃避潛伏期仍長(zhǎng)于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見表1、表2。

    表1 兩組大鼠每天平均逃避潛伏期測(cè)試結(jié)果(±s) s

    表1 兩組大鼠每天平均逃避潛伏期測(cè)試結(jié)果(±s) s

    組別 鼠數(shù) 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天假手術(shù)組 18 96.11±2.58 77.49±1.72 52.94±1.24 24.13±1.38 13.88±0.83模型組 15 103.16±2.37 90.94±2.06 71.02±2.021) 42.33±1.491) 30.99±1.831)與假手術(shù)組比較,1)P<0.05

    表2 兩組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)平臺(tái)象限游泳距離百分比比較(±s) %

    表2 兩組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)平臺(tái)象限游泳距離百分比比較(±s) %

    組別 鼠數(shù) 游泳距離假手術(shù)組 18 50.51±4.01模型組 15 24.80±3.061)與假手術(shù)組比較,1)P<0.05

    2.2 海馬INF-γ、IDO的表達(dá) 模型組海馬組織IDO表達(dá)、INF-γ陽性細(xì)胞累計(jì)光密度值高于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見表3。

    表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)IFN-γ平均光密度值、IDO的表達(dá)比較(±s)

    表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)IFN-γ平均光密度值、IDO的表達(dá)比較(±s)

    組別 鼠數(shù) IFN-γ IDO濃度(ng/mL)假手術(shù)組 18 0.14±0.04 0.89±0.06模型組 15 0.50±0.031) 4.73±0.211)與假手術(shù)組比較,1)P<0.05

    3 討 論

    慢性腦缺血是各種原因引發(fā)的長(zhǎng)期慢性腦血流灌注不足導(dǎo)致的以持久或進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的一組疾病,是血管性癡呆、Alzheimer病、Binswanger病等多種疾病的共同病理基礎(chǔ),主要的損傷機(jī)制有凋亡、免疫炎性損傷、氧化應(yīng)激損傷、突觸結(jié)構(gòu)和功能異常、能量代謝障礙、中樞膽堿能及單胺能系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂等[4]。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型采用較為常用的雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎,保證鼠腦不完全性缺血,與人類慢性腦低灌注相似。通過水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了模型大鼠存在學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。

    吲哚胺-2,3-雙加氧酶是IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)的一種酶。參與許多疾病的免疫調(diào)節(jié),如自身免疫反應(yīng)性疾病、腫瘤的免疫逃避以及移植免疫。研究證實(shí),正常生理?xiàng)l件下IDO活性很低。當(dāng)在病毒細(xì)菌感染、炎性反應(yīng)刺激的條件下,IFN-γ分泌增加,可刺激IDO表達(dá)增強(qiáng),IDO誘導(dǎo)產(chǎn)生的毒性化合物是AD發(fā)病機(jī)制中的重要成分[5]。Gold等[6]認(rèn)為卒中后認(rèn)知障礙炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)是IDO與犬尿氨酸代謝產(chǎn)物增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠IFN-γ增高,說明慢性腦灌注大鼠的病理生理過程包含著炎性反應(yīng),而炎性反應(yīng)的發(fā)生很可能刺激了IDO的高表達(dá)。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠IFN-γ增高,說明慢性腦灌注大鼠的病理生理過程包含著炎性反應(yīng),炎性反應(yīng)的發(fā)生刺激了IDO的高表達(dá),導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、死亡。這可能為使用IDO抑制劑抑制致炎細(xì)胞因子產(chǎn)生,從而減輕腦微血管免疫炎癥,將為預(yù)防和治療VCI提供新思路。

    [1]Godin-Ethier J,Hanafi LA.Indoleamine 2,3-dioxygenase expression in human cancers:Clinical and immunologic perspectives[J].Clin Cancer Res,2011,17(22):6985-6991.

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    [3]Vorhees CV,Williams MT.Morris water maze:Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].Nat Protoc,2006,1:848-858.

    [4]劉暉,章軍建,楊英,等.慢性腦低灌注對(duì)大鼠皮層核因子E2相關(guān)因子2表達(dá)的影響[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(1):6-9.

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