玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

周妍，張圓圓，刁晨曦，3，陸濤峰，陳洪巖*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱150069；3.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011）

玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

周妍1，2，張圓圓2，刁晨曦2，3，陸濤峰2，陳洪巖2*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱150069；3.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011）

玉米赤霉烯酮是由鐮刀菌產(chǎn)生的類雌激素樣真菌毒素。本文結(jié)合國內(nèi)外的研究成果，對(duì)玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為真菌毒素如玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法的探索提供參考。

玉米赤霉烯酮；檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

1 玉米赤霉烯酮及限量

玉米赤霉烯酮（ZEN）又稱F2毒素，是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的非甾體雌激素樣作用真菌毒素，分子式為C18H22O5。其難溶于水，易溶于甲醇，在食品或飼料加工過程中均不易被破壞（Wang等，2009；Yumbe等，2003）。ZEN廣泛存在于霉變的玉米、高粱等谷類作物，是世界上污染范圍最廣的鐮刀菌毒素之一（葛文霞等，2016）。ZEN具有較強(qiáng)的生殖、發(fā)育毒性，其能與雌激素受體結(jié)合使動(dòng)物產(chǎn)生雌激素亢進(jìn)癥，從而導(dǎo)致不孕或流產(chǎn)，給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失（單妹等，2006；肖治軍，2005）；其還具有細(xì)胞毒性以及潛在的致癌性（Vlata等，2006；Conková等，2001；Tomaszewski等，1998），嚴(yán)重威脅人類的健康。

目前已有多個(gè)國家或地區(qū)對(duì)食品和飼料中的ZEN含量制定了標(biāo)準(zhǔn)。2007年歐盟規(guī)定了谷物和玉米中ZEN的含量分別不能超過0.1 mg/kg和0.35 mg/kg。澳大利亞規(guī)定黑麥中ZEN含量不得超過60 μg/kg（侯月娥等，2014）。而我國頒布的《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB13078.2-2006）中規(guī)定玉米類飼料ZEN最大含量為500 μg/kg，《食品中真菌毒素限量》（GB2761-2011）中規(guī)定小麥中ZEN含量不得超過60 μg/kg。ZEN污染直接關(guān)系國計(jì)民生問題，因此尋找有效的ZEN檢測(cè)及去除方法是科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本文對(duì)可行的、靈敏度高的、特異性強(qiáng)的ZEN檢測(cè)方法進(jìn)行了概述。

2 玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法

2.1 氣相色譜法（GC法）GC法從20世紀(jì)70年代開始用于羥基衍生化處理后揮發(fā)性霉菌毒素的檢測(cè)（張思思，2016）。Amelin等（2013）采用Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe QuECh-ERS）樣品前處理方法結(jié)合GC-電子俘獲檢測(cè)器分離測(cè)定了多種谷物、飼料以及肉中的ZEN，檢出限為50 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于8%。GC法適合對(duì)飼料或食品中ZEN的定量定性分析，具有靈敏度高、回收率高等特點(diǎn)，現(xiàn)今美國分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）仍采用該方法。但該方法對(duì)設(shè)備要求高，并且實(shí)驗(yàn)室條件下不能進(jìn)行常規(guī)操作，因而檢測(cè)時(shí)常與其他方法聯(lián)用。Zhang等（2006）建立了免疫親和柱（IAC）-GC-質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）方法，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)ZEN的最低檢測(cè)限和定量限可達(dá)0.5 ng/kg和1.0 ng/kg，添加ZEN標(biāo)準(zhǔn)品含量為1.0～5.0 ng/g時(shí)，回收率為79.6%～110.7%。雖然GC-MS方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)真菌毒素，但是需要將分析物轉(zhuǎn)化為氣態(tài)。一些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子質(zhì)量大的分析物則不適宜使用GC-MS方法（王元?jiǎng)P，2014）。

2.2 薄層色譜法1968年AOAC首次提出用微柱-薄層色譜法（TLC）測(cè)定花生中的黃曲霉毒素，之后許多國家都將該方法作為標(biāo)準(zhǔn)方法（張思思等，2016）。我國規(guī)定檢測(cè)ZEN的標(biāo)準(zhǔn)方法即為該方法，最低檢出限為50 ng/g（羅雪云等，1995）。隋凱等（2006）建立了檢測(cè)出口玉米中ZEN含量的TLC法，最低檢測(cè)限為100 μg/kg，并由此建立了《出口糧谷中赤霉烯酮檢測(cè)方法》的商檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。吳文達(dá)等（2010）也構(gòu)建了檢測(cè)ZEN的TLC法，其比移值（Rf）約為0.26。Schaafsma等（1998）利用TLC測(cè)定谷物中的ZEN含量，檢出限為200 ng/kg，可以避免ZEN代謝物對(duì)測(cè)定的干擾。TLC法的優(yōu)點(diǎn)是成本較低，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、試劑需求高、靈敏度稍差、且主觀因素影響較大，實(shí)驗(yàn)室大都不采用該方法，但是在研究毒素的檢測(cè)和分析方法等方面，尤其是在實(shí)驗(yàn)條件不允許的情況下，TLC法還具有一定的優(yōu)越性（范偉杰，2016），目前該方法只在特殊情況下作為仲裁檢驗(yàn)。

2.3 高效液相色譜法（HPLC法）HPLC法是目前最常用的檢測(cè)糧油食品中ZEN的方法。Ostry等（2003）經(jīng)ZearalaTest免疫親和柱純化后，再用HPLC法檢測(cè)ZEN含量，其檢出限達(dá)0.1 μg/kg，回收率高達(dá)95%。羅小虎等（2010）采用HPLC法和熒光檢測(cè)器（FLD）方法測(cè)定ZEN的含量，批內(nèi)、批間加標(biāo)回收率為78.2%～89.6%，RSD為1.5%～3.9%，檢測(cè)限為8 μg/kg。Figueira等（2015）提出QuEChERS樣品前處理技術(shù)結(jié)合超聲輔助提取和超高壓液相色譜熒光檢測(cè)分析對(duì)谷物中ZEN進(jìn)行敏感和高通量定量檢測(cè)，ZEN檢出限（3.4 μg/kg）和定量限（4.7 μg/kg）均低于歐盟設(shè)定的限值，回收率為80.2%～109.7%，RSD小于5%。HPLC法具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、檢出限較低等優(yōu)點(diǎn)；缺點(diǎn)是成本高、檢測(cè)時(shí)間長、無法進(jìn)行大批量樣本檢測(cè)。

2.3.1 免疫親和柱-高效液相色譜法（IAC-HPLC法）劉勝利等（2011）采用層析柱和IAC結(jié)合凈化提取液的方法結(jié)合熒光檢測(cè)器檢測(cè)飼料樣品中的ZEN，加標(biāo)回收率高達(dá)88.74%，檢測(cè)限為5.7 μg/L， RSD低于4.01%。饒正華等（2012）利用IAC-HPLC熒光檢測(cè)法有效地將ZEN與其類似物分開，檢測(cè)配合飼料、預(yù)混料、玉米中的ZEN含量發(fā)現(xiàn)，RSD均小于5%。隋凱等（2006）利用此法檢測(cè)玉米和小麥中ZEN的含量，最低檢測(cè)限為0.04 μg/g，加標(biāo)檢測(cè)為0.04～5.0 mg/kg時(shí)，回收率為87.5%～98.6%，RSD為1.5%～8.3%。李軍等（2006）建立了ZEN的IAC凈化-柱后光化學(xué)衍生-HPLC方法，檢出限為4.0 μg/kg；在小麥、玉米、黑麥樣品中，平均加標(biāo)回收率為70.8%～94.0%，RSD為2.79%～9.38%。該方法比HPLC法更加可靠安全，靈敏度和準(zhǔn)確度也更高，但缺點(diǎn)是試樣準(zhǔn)備耗時(shí)長，成本高，目前僅限于花生、玉米等部分飼料原料的檢測(cè)。

2.3.2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS法）張利強(qiáng)等（2012）采用HPLC串聯(lián)MS技術(shù)建立了小麥中ZEN的測(cè)定方法，結(jié)果表明，ZEN質(zhì)量濃度在5～500 μg/L時(shí)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9997，加標(biāo)回收率為80%～101%，RSD為3.6%～8.9%，檢出限為8.0 μg/kg。龔珊等（2015）利用HPLC-MS/MS法檢測(cè)大麥、小麥等谷物中的真菌毒素，其回收率最高可達(dá)100%。Zollne等（1999）采用HPLC-MS法測(cè)定小麥以及啤酒中ZEN，其檢測(cè)限為0.5 ng/kg。梁穎等（2006）應(yīng)用HPLC-MS法測(cè)定小麥面粉中的ZEN，檢出限為5 ng/kg，RSD均小于10%，回收率達(dá)93.7%。Franz等采用HPLC-APCI電離-MS/MS方法測(cè)定ZEN的含量，內(nèi)標(biāo)法回收ZEN達(dá)到99%，最低檢測(cè)限（LOD）為0.3 μg/kg（范偉杰，2016）。

HPLC-MS法綜合了色譜和質(zhì)譜兩大優(yōu)勢(shì)，在真菌毒素的檢測(cè)過程中，既可以運(yùn)用色譜技術(shù)良好的分離方式，又可以擁有質(zhì)譜技術(shù)卓越的檢測(cè)能力（陳云良，2016）。與其他化學(xué)檢測(cè)方法相比，HPLC-MS檢測(cè)靈敏度更高，檢測(cè)結(jié)果更加精準(zhǔn)。但是，此方法的檢測(cè)過程復(fù)雜，設(shè)備昂貴，成本高，不適合大批量檢測(cè)樣品以及大范圍推廣。

2.4 免疫化學(xué)檢測(cè)法免疫化學(xué)檢測(cè)方法已經(jīng)成為真菌毒素的常規(guī)檢測(cè)方法，具有靈敏度高和特異性抗體高選擇性等特點(diǎn)。

2.4.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）鄧歌等（2015）研究證明，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)動(dòng)物飼料中ZEN含量，其最低檢測(cè)限度為0.1 μg/kg，回收率高達(dá)99%；另外，使用ELISA與HPLC法對(duì)35個(gè)相同樣品進(jìn)行分析，其變異系數(shù)（CV）和回收率都相近，回收率相關(guān)系數(shù)（R2）為0.96，且ELISA法的最低檢測(cè)限較低。劉剛等（2015）利用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)大麥中的ZEN，靈敏度為0.08 μg/kg，最低檢測(cè)限為0.01 μg/kg，回收率高達(dá)96.7%。

Zhan等（2016）將過氧化氫酶對(duì)過氧化氫（H2O2）的高催化活性和H2O2對(duì)碲鎘量子點(diǎn)敏感性能相結(jié)合建立了一種新型的熒光ELISA方法，檢測(cè)限為4.1 pg/mL。ZEN的半數(shù)抑制濃度（IC50）為75 pg/mL，比基于辣根過氧化物酶的傳統(tǒng)ELISA低約17倍。Zhang等（2015）建立了以磁性納米粒子為基礎(chǔ)的ELISA法，可定量檢測(cè)飼料樣品和谷物中ZEN的含量，其工作范圍為0.07～2.41 ng/mL，檢出限0.04 ng/mL，IC50為0.37 ng/mL；并與錳過氧化物酶試劑盒（MNP-bsELISA法）和LP-串聯(lián)MS法具有良好的相關(guān)性（R2=0.9283）。

目前已建立ZEN單克隆抗體ELISA檢測(cè)的國標(biāo)方法，并用于其快速篩選檢測(cè)（范偉杰，2016）。馬智鴻等（2009）研制出了生物素-鏈霉親和素的ELISA試劑盒檢測(cè)谷物中的ZEN，靈敏度為0.8 ng/mL，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別為5.1%和8.6%，平均加標(biāo)回收率為91.2%。邱云青等（2010）研制的ZEN酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，其最低檢出濃度為0.007 ng/mL，線性范圍為0.01～50.00 ng/mL。萬宇平等（2013）研制的ZEN檢測(cè)ELISA試劑盒，線性檢測(cè)范圍為50～405 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.99，最低檢測(cè)限為93.5 μg/kg，飼料樣品的回收率為74.5%～109.9%。

ELISA法用于檢測(cè)飼料或食品中的ZEN時(shí)，靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、安全可靠、可進(jìn)行批量檢測(cè)。

2.4.2 免疫膠體金診斷技術(shù)Anna等（2007）采用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析技術(shù)檢測(cè)小麥中的ZEN，最低檢測(cè)限為100 μg/kg。李翹等（2013）研制出檢測(cè)玉米等谷物中ZEN殘留的免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板，最低檢測(cè)限為100 μg/kg，檢測(cè)過程僅需15 min。駱敏兒等（2013）建立了ZEN的膠體金免疫層析檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間為5 min，最低檢測(cè)限為100 ng/mL。Urusov等（2015）利用抗體共軛納米金建立了一種免疫層析系統(tǒng)進(jìn)行ZEN的檢測(cè)，該法抗原檢測(cè)限是0.1 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間15 min。膠體金免疫層析（GICA）技術(shù)具有單樣本檢測(cè)、無需輔助試劑和儀器、可肉眼觀察結(jié)果等特點(diǎn)，適用于大量樣本的篩檢，并易于普及推廣。Chen等（2016）通過系統(tǒng)地優(yōu)化抗體-金納米粒子偶聯(lián)物的制備、金納米顆粒的大小和捕獲抗原位置，研制出多重側(cè)流免疫分析技術(shù)（LFA），ZEN的可視檢測(cè)限為50 μg/kg，定量分析檢測(cè)限為0.42～0.46 μg/kg，遠(yuǎn)低于歐盟規(guī)定的監(jiān)管范圍。Sun等（2014）使用特定的抗ZEN單克隆抗體制備GICA試紙條應(yīng)用于篩選玉米樣品中的殘留ZEN，測(cè)試在5～10 min完成，可視檢測(cè)限為20 μg/kg，IC50為3.4 ng/mL，與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和HPLC法檢測(cè)結(jié)果一致性很高。

2.4.3 新型電化學(xué)生物傳感器法Afzali等（2015）采用多壁碳納米管修飾的碳糊電極來富集和測(cè)定ZEN，校準(zhǔn)曲線線性范圍為2～50 ng/mL，檢測(cè)限為0.58 ng/mL。Liu等（2014）組裝的無標(biāo)記安培免疫傳感器檢測(cè)ZEN，檢測(cè)限為1.7 pg/mL，線性范圍為0.005～15 ng/mL，并具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和選擇性。Ji等（2016）制備了一種新的基于通路毒性的重組細(xì)胞熒光生物傳感器來快速和簡(jiǎn)便評(píng)價(jià)ZEN，檢出限為3.2 ng/mL，ZEN的半最大效應(yīng)濃度為76.63 ng/mL。此方法是一個(gè)早期預(yù)警檢測(cè)方法，不適用于ZEN的快速檢測(cè)。Sweccha（2016）將光子成像學(xué)與多重表面等離子體共振結(jié)合制備的新型傳感器對(duì)ZEN的檢測(cè)限為6 μg/kg，與LC-MS/MS方法進(jìn)行比較并無明顯差異，可作為飼料中潛在霉菌毒素的半定量篩選方法。電化學(xué)生物傳感器靈敏度高、選擇性好，同時(shí)某些傳感器具有便攜可自動(dòng)化等特點(diǎn)，該方法目前多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，常規(guī)檢測(cè)的應(yīng)用并不廣泛（張思思等，2016）。

3 新型檢測(cè)技術(shù)

ZEN的傳統(tǒng)檢測(cè)方法各有優(yōu)劣，探索高效、快速、靈敏的ZEN檢測(cè)方法是長期而艱巨的任務(wù)。

3.1 核酸適配體近幾年，適配體研究成為科學(xué)家們的討論焦點(diǎn)。其利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX），從單鏈寡核苷酸文庫中篩選出能與靶物質(zhì)高親和力和特異性結(jié)合的寡核苷酸序列。適配體通過鏈內(nèi)堿基間的氫鍵作用折疊形成穩(wěn)定的發(fā)卡、莖環(huán)、假結(jié)、口袋、凸環(huán)和G-四鏈體等二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)并能與靶標(biāo)空間結(jié)構(gòu)匹配的核糖核酸（RNA）或單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）（Ellington，1990；Tuerk，1990）。適配體一般由幾十個(gè)核苷酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量較小、易穿透細(xì)胞膜、性質(zhì)穩(wěn)定、容易制備和修飾（王勇等，2016），可以體外大量合成、便于運(yùn)輸、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)限可達(dá)ng/L或pg/L、不受免疫原性和免疫條件以及動(dòng)物耐受性的限制（王文鳳，2012）。

理論上任何靶標(biāo)都可以篩選到對(duì)應(yīng)的核酸適配體，包括小分子物質(zhì)（Klussmann，2006）。目前廣泛應(yīng)用于檢測(cè)食品和飼料中化學(xué)殘留物、生物毒素、重金屬、病原微生物以及非法添加物。桂海孌（2015）利用核酸適配體及Pico Green染料的特點(diǎn)，建立了一種基于核酸適配體快速檢測(cè)赭曲霉毒素A和伏馬毒素B1的方法。Sun等（2014）建立了一種基于硅晶體微球與核酸適配體檢測(cè)伏馬毒素B1的方法，檢測(cè)范圍為0.001～1 ng/mL。Lamont等（2011）篩選出可與蓖麻毒素B鏈結(jié)合的適配體，其對(duì)液體基質(zhì)食品中蓖麻毒素B鏈的檢出限為30 ng/mL。Shim等（2014）應(yīng)用化學(xué)發(fā)光競(jìng)爭(zhēng)性適配體檢驗(yàn)玉米樣品中的黃曲霉毒素B1，檢測(cè)線性范圍為0.1～10 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.1 ng/mL。

目前，Chen等（2013）已經(jīng)篩選出能夠與ZEN結(jié)合的適配體5Z28、8Z31和11Z1，構(gòu)建了以8Z31為基礎(chǔ)的檢測(cè)ZEN的特異捕獲-熒光分析法，ZEN熒光強(qiáng)度值與其濃度在3.14 nmol～31.4 μmol/L時(shí)線性關(guān)系良好，檢出限為785 pmol/L。現(xiàn)今還沒有出現(xiàn)商品化的用于檢測(cè)霉菌毒素的核酸適配體，但核酸適配體的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)使其勢(shì)必成為霉菌毒素快速檢測(cè)領(lǐng)域的首選之策。

3.2 其他新型檢測(cè)技術(shù)采用時(shí)間分辨熒光技術(shù)進(jìn)行ZEN檢測(cè)，檢測(cè)限為0.101 ng/L，平均回收率達(dá)到94.14%（張羽，2015）。何慶華等（2009）建立了基于ZEN全抗原的固相膜免疫檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限為50 μg/kg。Duan等（2015）采用微乳液法通過封裝在CdSe/ZnSQDs合成量子點(diǎn)（QD）熒光微球（QBS），作為敏感和定量檢測(cè)谷物中ZEN免疫分析（ICA）的新熒光探針，線性動(dòng)態(tài)范圍為0.125～10 ng/mL，半數(shù)抑制濃度0.92～1.10 ng/ mL。ZEN的標(biāo)準(zhǔn)溶液和玉米樣品的檢測(cè)限分別為0.0625 ng/mL和3.6 μg/kg。Natalia等（2016）首次開發(fā)了二氧化硅殼包裝膠體量子點(diǎn)（QD@SiO2）的微量滴定板。用QD@SiO2標(biāo)記ZEN的結(jié)合物，在玉米和小麥中測(cè)定ZEN，檢測(cè)限分別為5.4、4.1 μg/kg。Li等（2016）將抗體/功能單體生物綴合物與交聯(lián)劑共聚合形成毒素免疫親和單片陣列，其具有很好的線性響應(yīng)，檢出限低至0.029 μg/L，具有良好的均勻性（批內(nèi)和批間CV均小于8%）。

4 小結(jié)與展望

真菌毒素污染嚴(yán)重，且廣泛存在于食品鏈中，對(duì)人類及畜禽的健康造成了不同程度的危害。由于許多真菌毒素結(jié)構(gòu)相似且含量較低，需要采用高選擇性、準(zhǔn)確、快速、便捷的定性定量方法。對(duì)ZEN的檢測(cè)已從最初的TLC法、HPLC法，到快速發(fā)展的ELISA法，再到適配體法。目前隨著適配體技術(shù)的不斷進(jìn)步，其將逐步應(yīng)用于單類真菌毒素和多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)，而這也逐漸成為今后真菌毒素檢測(cè)發(fā)展的普遍趨勢(shì)。參考文獻(xiàn)

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Zearalenone（ZEN）is a estrogenic mycotoxin produced by Fusarium graminearum.The research progress of detection methods of ZEN were reviewed in this paper，which provided a reference for the exploration of the detection of mycotoxins such as ZEN.

zearalenone；detection methods；research progress

S816.17

A

1004-3314（2017）16-0035-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171609

國家自然科學(xué)基金（31601974）

*通訊作者