冰砂糖壽組培快繁研究

牟豪杰， 王 燕， 呂永平， 汪一婷， 李海營(yíng)

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310021)

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冰砂糖壽組培快繁研究

牟豪杰， 王 燕， 呂永平， 汪一婷， 李海營(yíng)*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310021)

[目的] 探討冰砂糖壽組培快繁的最佳條件。[方法]以冰砂糖壽幼嫩花序?yàn)橥庵搀w，研究冰砂糖壽組培快繁技術(shù)。[結(jié)果] 于MS + 5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7g/L瓊脂 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)出愈傷組織，在分化培養(yǎng)基MS+0.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂上繼代培養(yǎng)可分化成不定芽，將不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基MS + 0.3 mg/L 6-BA + 0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂上增殖速度較快，增殖系數(shù)達(dá)3.79。將其移栽至營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)(混合泥炭∶粗砂=1∶1)中，移栽成活率可達(dá)95%。[結(jié)論]建立了冰砂糖壽花序再生及快繁體系，為其規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

冰砂糖壽；愈傷組織；不定芽

冰砂糖壽(Haworthiakegazato)為百合科(Liliaceae)瓦葦屬(Haworthia)植物，該屬植物根據(jù)植株葉的形態(tài)，分為硬葉和軟葉2類(lèi)。硬葉類(lèi)植物葉面常被白色斑點(diǎn)，或結(jié)節(jié)成條狀，具有極高的觀賞價(jià)值。冰砂糖壽屬于硬葉類(lèi)植株，其葉片小巧，表面布滿白色小刺如冰晶狀，是極其珍貴的多肉植物品種之一。但由于其繁殖率很低，傳統(tǒng)的繁殖大多采用分株、葉插和種子繁殖，不易成活且生長(zhǎng)緩慢，同時(shí)，冰沙糖壽是雜合體，其有性雜交與母本差異較大，而植物組織培養(yǎng)繁殖速度快、繁殖系數(shù)大，繁殖后代整齊一致,能保持原有品種的優(yōu)良性狀。 21 世紀(jì)初，與冰砂糖壽同屬的康平壽[1]、截形十二卷[2]、克里克特壽[3]、西山壽[4]、Haworthiamirabilis[5]和美吉壽[6]等多肉植物均有組織培養(yǎng)成功的報(bào)道，但未見(jiàn)其應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。筆者以冰砂糖壽幼嫩花序?yàn)橥庵搀w，研究其組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)，以期為其規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料為冰砂糖壽(Haworthiakegazato)幼嫩花序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒。選取冰砂糖壽幼嫩花序?yàn)橥庵搀w，去除閉合花蕾的外苞片，再將花蕾連同花柄逐個(gè)切下。外植體先用濃洗衣粉溶液浸泡1 h后再用自來(lái)水沖洗干凈，然后在70%乙醇溶液和有效氯濃度1% 的次氯酸鈉溶液中分別浸泡40 s和6 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5遍，每遍2 min。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖。將消毒后的花蕾在無(wú)菌條件下先用解剖刀將其基部切傷后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS + 5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂)中，并使傷口接觸到培養(yǎng)基。于(23±2)℃暗培養(yǎng)42 d后轉(zhuǎn)于光照條件(光照時(shí)間16 h/d, 光照強(qiáng)度約為60 μmol/(m2·s)下培養(yǎng)。

1.2.3 愈傷組織的分化。將誘導(dǎo)出致密、球狀、淡黃色的愈傷組織暗培養(yǎng)14 d后，挑取生長(zhǎng)量較大、色澤鮮亮、質(zhì)地較硬的愈傷組織，接種在附加不同濃度分裂素及配比的培養(yǎng)基中，6-BA濃度分別為 0.1、 0. 3、 0.5 mg/L，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在光照時(shí)間16 h/d、光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)、溫度(23±2)℃ 條件下培養(yǎng)。28 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化情況，每次試驗(yàn)接種至少20 塊愈傷組織，重復(fù)3 次。

將誘導(dǎo)出的不定芽叢分成小叢接種在附加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的不同濃度及配比的培養(yǎng)基中，6-BA濃度分別為 0.1、0.3、0.5 mg/L，NAA濃度分別為 0、0. 1、0.3 mg/L，進(jìn)行雙因素試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)不定芽的分化情況。

1.2.4 壯苗與移栽。將增殖培養(yǎng)基上具有典型母本形態(tài)的叢生芽在無(wú)菌條件下切割成單株后轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基(1/2MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L瓊脂)中，待植株達(dá)1.5～2.0 cm且出現(xiàn)明顯成株形態(tài)時(shí)即可切除其根部并清洗，然后置于通風(fēng)避光處3～10 d晾至微皺縮后, 種于裝有基質(zhì)6 cm×6 cm 營(yíng)養(yǎng)缽基質(zhì)(混合泥炭：粗沙=1∶1)中。種植完成后移入溫室內(nèi)的小塑料拱蓬中保濕，同時(shí)用 0.5 g/L多菌靈處理。14 d后適當(dāng)通風(fēng)，注意及時(shí)噴水，保持基質(zhì)濕潤(rùn)；21 d后逐漸增大通風(fēng)量。 夏季移栽時(shí)，移栽后前28 d應(yīng)適當(dāng)遮陰[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-BA對(duì)愈傷組織分化的影響 幼嫩花蕾培養(yǎng)28～35 d后子房基部顯著膨大且組織逐漸玻璃化；培養(yǎng)42～49 d后先形成淡黃色愈傷組織(圖1 A)。將暗培養(yǎng)14 d后致密、球狀、淡黃色的冰砂糖壽愈傷組織置于添加不同濃度6-BA 的MS培養(yǎng)基中，約 21 d后出現(xiàn)深綠色小突起(圖1 B)，而后開(kāi)始不定芽的分化(圖1 C)，接種35～42 d后分化出叢生芽(圖1 D)。隨著 6-BA 濃度的升高成芽率逐漸升高，當(dāng)6—BA濃度達(dá)0.5 mg/L時(shí)，雖然不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到最高(78.7%±15.9%)，但產(chǎn)生的叢生芽過(guò)于稠密，葉片小，植株生長(zhǎng)不明顯且愈傷組織褐化嚴(yán)重，不適合進(jìn)一步增殖；而當(dāng)6-BA濃度達(dá)0.3 mg/L時(shí)，產(chǎn)生的叢生芽葉片較大，生長(zhǎng)健壯(圖1E)。因此， MS+0.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂培養(yǎng)基最有利于芽的分化(表 1)。

圖1 冰砂糖壽的組培再生體系Fig.1 tissue culture regeneration system of Haworthia kegazato

Table 1 Effects of different 6 - BA concentration on callus differentiation

處理Treatment6-BA濃度6-BAconcent-ration∥mg/L愈傷組織接種數(shù)Numberofcallusvacci-nation∥個(gè)不定芽數(shù)Numberofadventitiousbud∥個(gè)誘導(dǎo)率Inductionrate∥%①0.1653046.9±9.1②0.3614574.1±14.5③0.5635078.7±15.9

2.2 不同濃度激素對(duì)不定芽增殖的影響 由表 2 可知，隨著 6-BA 濃度的升高增殖系數(shù)呈上升趨勢(shì)，而當(dāng) 6-BA濃度達(dá) 0.5 mg/L 時(shí)，苗纖細(xì)過(guò)密，葉片小而薄，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。從種苗產(chǎn)業(yè)化角度考慮，最適合冰砂糖壽不定芽增殖的培養(yǎng)基是MS + 0.3 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，其增殖系數(shù)可達(dá)3.79。

2.3 移栽成活率 不定芽在壯苗培養(yǎng)基(1/2MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂)上培養(yǎng)至植株達(dá)1.5～2.0 cm且出現(xiàn)明顯成株形態(tài)時(shí)，在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)(混合泥炭∶粗沙=1∶1)中移栽，其移栽成活率可達(dá)95%。

表2 不同濃度激素對(duì)不定芽增殖的影響

注：+.苗纖細(xì)，葉片小而薄； ++.苗纖細(xì)，葉片較?。?+++.苗粗壯，葉片較厚； ++++.苗粗壯，葉片肥厚。

Note:+ stands for stender,smal and thin leaf;++ stands for slender plants and small leaf;+++ stands for granular plants and thick leaf;++++ stands for granular plants and thicker leaf.

3 結(jié)論

該試驗(yàn)中，冰砂糖壽花序接種于MS + 5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上42～49 d成功誘導(dǎo)出愈傷組織；暗培養(yǎng)14 d后的致密、球狀、淡黃色的愈傷組織在分化培養(yǎng)基( MS+0.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂)上35～42 d繼代可分化成不定芽叢，分化芽在MS + 0.3 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂培養(yǎng)基上增殖速度最快，叢生芽生長(zhǎng)健壯，增殖系數(shù)達(dá)3.79。將其移栽在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)(混合泥炭∶粗沙=1∶1)中，其移栽成活率可達(dá)95%。

[1] 孫濤，金蕊，李德森. 康平壽的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2003, 39(3):232.

[2] 孫濤，李德森. 截形十二卷的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2002, 38(6):586.

[3] 左志宇，李建希，安曉云，等. 克里克特壽的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2007,43(2):311-312.

[4] 宋曉濤，沈萌，左志宇，等. 十二卷屬植物西山壽的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2007,43(5):883-884.

[5] PANDEY K N,SABHARWAL P S,CALKINS.Effects of ionizing radiation (60Co gamma rays) on growth and morphogenesis ofHaworthiamirabilis,haw. Callus tissue[J]. In vitro, 1979, 15(4):246-251.[6] 王泉，左志宇，宋曉濤，等. 百合科多肉植物美吉壽的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2008, 44(1):123-124.

[7] 牟豪杰，徐剛，汪一婷，等. 多漿植物組培苗移栽技術(shù)初探[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005(6):450-451.

[8] 杜澤湘. 石榴新品種“九州紅”組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013,41(9):3770-3771.

Tissue Culture and Rapid Propagation ofHaworthiakegazato

MOU Hao-jie, WANG Yan，LV Yong-ping, LI Hai-ying*

(Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Institute of Virology and Biotechnology, Hangzhou, Zhejiang 310021)

[Objective]The aim was to study tissue culture and rapid propagation ofHaworthiakegazato.[Method]With young inflorescence ofHaworthiakegazatoas explant, tissue culture and rapid propagation ofHaworthiakegazatowas studied. [Result] Embryogenic callus was initiated fromHaworthiacomptoniana×H.correctacv.'Aboukyuuinflorescencecultured on MS medium supplemented with 5 mg/L 6-BA, 0.5 mg/L IBA, 30g/L sucrose, and 7g/L agar. Subculture of these embryogenic calli on the MS + 0.3 mg/L 6-BA+ 30 g/L sucrose+7 g/L agar medium resulted in shoots and micropropagation of shoots on the MS + 0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA +30 g/L sucrose7 g/L agar medium with muitiplication coefficient of 3.79.The transplanting survival rate was 95% in nutritional substrates.[Conclusion] A subsequent plant regeneration from inflorescence callus ofHaworthiakegazatowere established, to provide theoretical basis for large-scale production.

Haworthiakegazato;Callus;Shoots

牟豪杰(1977- )男，浙江杭州人，助理研究員，從事花卉組培產(chǎn)業(yè)化研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事生物技術(shù)方面的研究。

2016-09-14

S 682.33

A

0517-6611(2016)32-0140-02