外周血SEPTIN9基因甲基化檢測在結(jié)直腸癌診斷中的研究進(jìn)展*

宮媛 王衛(wèi)華 杜海濤 呂昆明 常青 萬軍

結(jié)直腸癌（CRC）的發(fā)病率位居我國乃至全球各類惡性腫瘤第三位[1]，其發(fā)病率和病死率有逐年上升趨勢，有效的早期篩查、診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測及盡早干預(yù)治療是CRC防治的關(guān)鍵。最近研究發(fā)現(xiàn)SEPTIN9基因與CRC發(fā)生密切相關(guān)，在癌組織中呈高度甲基化，是CRC發(fā)生發(fā)展過程中重要的分子特征。因此，檢測患者血漿中SEPTIN9基因甲基化（mSEPT9）水平是CRC早期篩查和診斷的理想方式。

1 SEPTIN9基因甲基化（mSEPT9）與結(jié)直腸癌的發(fā)生關(guān)系

1.1 SEPTIN9基因概述：SEPTIN9基因編碼的SEPTIN9蛋白在細(xì)胞代謝中發(fā)揮著重要的生理作用，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，防止細(xì)胞分裂過快或無控制的分裂增殖，具有相應(yīng)的抑癌作用[2]。CRC的發(fā)生、發(fā)展與基因的甲基化密切相關(guān)[3,4]，其中SEPTIN9基因甲基化（mSEPT9）在CRC發(fā)生中的作用備受關(guān)注。異常高甲基化通常發(fā)生在基因啟動子區(qū)CpG島處[5，6]，mSEPT9會抑制SEPTIN9基因正常表達(dá)，使其抑癌功能喪失，并最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂和癌變[4，7]。

1.2 mSEPT9檢測試劑盒（Epi proColon）的應(yīng)用：腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死后，其DNA被釋放入外周血，從而在外周血中可檢測到異常甲基化的SEPTIN9基因DNA[8]。2008年，表觀基因組學(xué)公司首次研究了外周血mSEPT9檢測癌癥的性能并隨之推出第一代Epi proColon試劑盒（Epi proColon1.0），并于2012年在美國使用[5，9]。多個研究表明，Epi proColon 1.0在CRC篩查方面已經(jīng)表現(xiàn)出很高的敏感性和特異性，其總體敏感性48%～73%，特異性82%～98%。第二代血漿mSEPT9檢測試劑盒（Epi proColon 2.0）在DNA提取和PCR重復(fù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面較第一代有所提高，檢測敏感性穩(wěn)定提升[10-12]。應(yīng)用Epi proColon 2.0后，檢測靈敏度從48.2%～73.3%[12-14]提高到約71.0%～95.6%[11，15-17]，特異性從80.0%～91.5%提高到84.8%～98.9%[18]。外周血mSEPT9是首個被美國FDA批準(zhǔn)的用于CRC篩查的血液DNA甲基化標(biāo)志物[10]。Epi proColon 2.0可以檢測低至7.8 pg/mL的mSEPT9[19]。目前外周血mSEPT9檢測篩查CRC的方法已在歐洲、美國大規(guī)模使用。2016年美國FDA批準(zhǔn)外周血mSEPT9檢測的方法（mSEPT9試驗(yàn)）用于50～75歲的平均風(fēng)險人群的篩查[10]。在我國，國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）已批準(zhǔn)mSEPT9用于臨床CRC的早期檢測，并被國內(nèi)指南所推薦[17]。

1.3 mSEPT9的計(jì)算方法與選擇：mSEPT9試驗(yàn)的算法規(guī)定在m次PCR重復(fù)實(shí)驗(yàn)中至少需要出現(xiàn)n次陽性（n≤m），才可以判定試驗(yàn)陽性。常用的算法有1/1、1/2、1/3和2/3四種，1/1算法為1次PCR重復(fù)實(shí)驗(yàn)中要求出現(xiàn)1次陽性，則判斷樣品為陽性；1/2算法為2次PCR重復(fù)實(shí)驗(yàn)中要求至少出現(xiàn)1次陽性，則判斷樣品為陽性；依此類推。在不同的研究中，不同的算法其敏感性和特異性不同，有研究表明1/3算法的敏感性0.80，特異性0.85。2/3和1/1算法的敏感性和特異性非常相似（敏感性：0.74 vs 0. 73，特異性：0.95 vs 0.93）[20]。1/2算法敏感性最低0.59，特異性0.91。由此看出，1/3算法特異性較低但敏感性最好；2/3算法在敏感性和特異性之間提供了最佳的平衡，盡管其敏感性降低，但特異性最高，真陰性率高，整體性能最好，這與NIAN等[11]研究結(jié)論一致。因此，算法的選擇應(yīng)該基于研究的需求，如果是篩選試驗(yàn)，提高疾病的檢測率，應(yīng)該使用敏感度最高的算法，推薦1/3算法，如果是排除陰性患者，應(yīng)該使用特異性較高的算法，推薦使用2/3算法。

2 mSEPT9在CRC的臨床應(yīng)用價值

2.1 mSEPT9檢測CRC具有高敏感性和特異性：目前，國內(nèi)外不同研究小組發(fā)表了一系列通過檢測mSEPT9篩查早期CRC的臨床研究，其敏感度（67.0%～79.3%）和特異度（86%～99%）[8，9，14，16，18，20]。多項(xiàng)meta分析[11，18，21-23]亦表明，mSEPT9檢測CRC具有高敏感性和高特異性，NIAN[11]的針對25項(xiàng)研究的meta分析指出應(yīng)用Epi proColon 1.0試驗(yàn)的總體敏感性為71%，總體特異性為92%，Epi proColon 2.0試驗(yàn)的總體敏感性為76%，總體特異性為94%。WANG[18]的meta分析后指出，應(yīng)用Epi proColon 2.0檢測mSEPT9的敏感度為71.0%～95.6%，特異性為84.8%～98.9%。LI[19]針對39個研究的meta分析表明mSEPT9的總體敏感性是62%，特異性是91%。SUN[20]的29項(xiàng)研究的meta分析指出mSEPT9的敏感性為69%（2/3算法）～74%（1/3算法），特異性為84%（1/3算法）～96%（2/3算法）。上述研究均為隊(duì)列研究和病例對照研究。針對中國人mSEPT9試驗(yàn)機(jī)會性篩查（有癥狀高危人群）的RESEPT研究指出mSEPT9試驗(yàn)的敏感性為76.6%，特異性為95.9%[16]，且在Ⅰ期和Ⅱ期CRC患者敏感性64.9%和72.7%。SONG等[24]一項(xiàng)機(jī)會性篩選研究中，mSEPT9試驗(yàn)的敏感性為75.1%，特異性為95.1%。尤其是第二代檢測試劑盒Epi proColon 2.0應(yīng)用以來，其敏感性進(jìn)一步提高至79.3%（2/3算法）～ 95.6%（1/3算法），特異性達(dá)到84.8%（1/3算法）～98.9% （2/3算法）[14]。而一項(xiàng)納入來自美國和德國32個醫(yī)療機(jī)構(gòu)的7 941例50歲及以上無癥狀人群的大樣本CRC篩查研究（PRESEPT研究）[10]顯示，mSEPT9試驗(yàn)檢測CRC的總體敏感性為48.2%，總體特異性為91.5%。PRESEPT研究結(jié)果的敏感性明顯低于上文中多項(xiàng)回顧性驗(yàn)證研究，其原因可歸因于與該研究的篩查對象為無癥狀人群和1/2算法。無癥狀人群的敏感性肯定低于普通風(fēng)險或高危風(fēng)險的有癥狀人群的敏感性。如果1/2算法換為1/3算法，其敏感性為68.2%，特異性為80%[25]。由此可見，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、人群的選擇、試劑盒的選擇和算法的選擇都會影響結(jié)果的敏感性和特異性。外周血mSEPT9水平具有較高敏感性、特異性，且其依從性較高及侵入性較低，適合在易感人群中進(jìn)行CRC篩查（表1）。

表1 mSEPT9的不同算法和試劑盒檢測CRC的敏感性和特異性比較

表2 mSEPT9的不同算法和試劑盒檢測不同分期CRC的敏感性比較

2.2 mSEPT9檢測CRC的敏感性與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系：mSEPT9試驗(yàn)敏感性主要取決于外周血mSEPT9水平，而外周血mSEPT9主要來源于腫瘤細(xì)胞的釋放。不同分期的腫瘤，其腫瘤大小，浸潤程度，分化程度均各不相同，因此其外周血mSEPT9水平也有顯著差異[26]。多項(xiàng)研究[8，11，12，15，24，27，28]表明，外周血mSEPT9陽性率與CRC臨床分期有關(guān)，臨床分期越晚，mSEPT9陽性率越高。組織分級越高，分化程度越低，mSEPT9陽性率越高[27]。且外周血mSEPT9水平與腫瘤最大直徑呈線性關(guān)系[14，29，30]，而與腫瘤部位無關(guān)[27]?？梢妋SEPT9水平與CRC惡性程度呈正相關(guān)，可用來指導(dǎo)CRC臨床分期（表2）。

2.3 mSEPT9具有評估CRC手術(shù)療效和預(yù)測預(yù)后的價值：有研究[14，30]表明mSEPT9水平對CRC手術(shù)療效有評價作用。外周血mSEPT9水平與CRC呈負(fù)相關(guān)性，術(shù)前mSEPT9陽性的CRC患者，術(shù)后mSEPT9水平降低，甚至轉(zhuǎn)為陰性。術(shù)后高水平mSEPT9則預(yù)示CRC患者復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險高，因此，術(shù)后mSEPT9狀態(tài)能直接提示CRC患者是否存在隱匿性腫瘤細(xì)胞，監(jiān)測mSEPT9水平可預(yù)測CRC手術(shù)預(yù)后和監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)，可作為檢測腫瘤進(jìn)展和治療效果的標(biāo)記物[30-32]。

2.4 mSEPT9檢測結(jié)直腸腺瘤和息肉的敏感性及影響因素：目前大部分研究發(fā)現(xiàn)，mSEPT9對腺瘤和息肉的陽性檢出率低于15%[11，22，30]，這可能與從腺瘤發(fā)展為CRC的過程中，甲基化是慢慢擴(kuò)展的，結(jié)直腸腺瘤中基因甲基化水平低于CRC有關(guān)。但也有研究證明，mSEPT9對重度不典型增生的息肉和直徑＞1 cm腺瘤的檢測價值遠(yuǎn)優(yōu)于直徑＜1 cm腺瘤和息肉[15，31]。SONG[24]等的臨床研究同樣證明mSEPT9對進(jìn)展期腺瘤，尤其是含有絨毛成分和異型增生的腺瘤的檢出率高。相較于上述研究[8，10，11，30]，該研究中mSEPT9高檢出率或許與選用Epi proColon 2.0試劑盒，應(yīng)用敏感性高的1/3算法，及區(qū)分不同性質(zhì)腺瘤，尤其是針對含有絨毛和異型增生腺瘤的人群和高風(fēng)險人群的原因有關(guān)。該研究證實(shí)了外周血mSEPT9水平的檢測不僅可用于CRC的篩查，亦可作為CRC癌前病變的篩查（表3）。

表3 mSEPT9的不同算法和試劑盒檢測結(jié)腸腺瘤或息肉的敏感性比較

2.5 聯(lián)合mSEPT9和糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)（FIT）檢測CRC有助于提高敏感性：盡管mSEPT9對結(jié)直腸腺瘤檢出率的效力存有爭議，但mSEPT9的優(yōu)勢在于檢測CRC的敏感性和特異性較高，單獨(dú)應(yīng)用mSEPT9的敏感性優(yōu)于FIT和癌胚抗原CEA[77%vs（66.4%&41.3%）][20]。外周血mSEPT9試驗(yàn)和FIT均為無創(chuàng)試驗(yàn)，當(dāng)前的研究多側(cè)重于比較兩者的診斷效力[16，32]。 然而這兩種試驗(yàn)具有不同的原理和機(jī)制，mSEPT9和FIT篩查CRC有一定的互補(bǔ)性，聯(lián)合檢測mSEPT9和FIT有助于進(jìn)一步提高敏感性[16，20，32]，其敏感性從單獨(dú)應(yīng)用mSEPT9的76%提高至94%。同時，聯(lián)合檢測對CRC的陰性預(yù)測值高達(dá)99.3%，陰性似然比僅為0.04，說明若兩項(xiàng)試驗(yàn)均為陰性，則有助于排除CRC。

3 mSEPT9檢測的影響因素 外周血mSEPT9的影響因素眾多，年齡是影響mSEPT9篩查效果的因素之一，高齡可能降低其敏感性和特異性[10]，這可能是由于年齡的增長和全基因組DNA甲基化水平的提高，也可能是由于老年人慢性疾病的患病率較年輕受試者高，各種慢性疾病影響了DNA甲基化[33]，導(dǎo)致老年人血清標(biāo)志物的水平受到其他因素的干擾風(fēng)險增大，從而引起篩查敏感度的下降。我們還發(fā)現(xiàn)其他疾病如關(guān)節(jié)炎，動脈硬化和糖尿病對檢測有影響[12]。同時，外周血mSEPT9在CRC患者中存在微弱的晝夜節(jié)律性[34]。最高mSEPT9濃度發(fā)生在午夜，平均（31.99±31.33）ng /mL；最低濃度時為下午6 時，平均（27.05±16.97）ng /mL；且mSEPT9濃度較低的情況下，日間活動可影響mSEPT9檢測結(jié)果；因此樣本采集的時間會影響檢測結(jié)果，通過早晨收集樣本可提高篩選靈敏度。然而TóTH[34]研究的樣本數(shù)量過少，這種節(jié)律性的存在與否需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)。近期有研究證明種族與DNA甲基化狀態(tài)之間有相應(yīng)關(guān)系[35]。種族分層分析的研究顯示，mSEPT9對亞洲人CRC的敏感性（0.75）好于對美洲人（0.71）和歐洲人（0.70）。然而，另一項(xiàng)研究顯示了mSEPT9的低敏感性（0.363），不過該研究的差異可能來源于種族不同和試劑盒偏差[11，36，37]。

4 結(jié)語 綜上所述，mSEPT9在CRC的篩查和早期診斷上具有較高敏感性和特異性，適合于易感人群的篩查；對CRC的分期、分級評價、治療效果、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后預(yù)測方面潛能巨大；但研究人群、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、計(jì)算方法、試劑盒選擇、年齡、其他疾病和種族差異均可影響mSEPT9檢測結(jié)果；對無癥狀人群和腺瘤、息肉的篩查方面，mSEPT9的效力有待于進(jìn)一步提高。在權(quán)衡敏感性和特異性基礎(chǔ)上，mSEPT9聯(lián)合其他標(biāo)記物檢測可提高診斷率，具有良好的應(yīng)用前景。

利益沖突本文所有作者均聲明不存在利益沖突。