白藜蘆醇對小鼠血小板氧化應(yīng)激和衰老指標(biāo)及儲存時間的影響*

賈彥軍 趙續(xù)影 魏珍珍

血小板是一種壽命較短（7～10天）的無細(xì)胞核循環(huán)碎片，用于臨床輸血的血小板需在（22±2）℃振動儲存[1]。由于血小板含有功能完整的細(xì)胞成分，包括溶酶體、線粒體和致密顆粒，因此血小板同樣具有生物活性現(xiàn)象，如程序性細(xì)胞死亡（凋亡）、線粒體自噬和細(xì)胞衰老[2]，這些生物進(jìn)程可能是造成血小板儲存損傷（platelet storage lesion，PSL）的主要原因。PSL是導(dǎo)致血小板結(jié)構(gòu)和功能逐漸損傷的所有有害變化的總和，其具體發(fā)生機(jī)制目前仍不明確，而氧化應(yīng)激被認(rèn)為在PSL中起到重要作用[3]。目前，抑制血小板代謝及活化已成為減輕PSL并延長儲存時間的主要策略，白藜蘆醇（3,40,5-三羥基異苯乙烯）作為一種天然的多酚化合物，廣泛存在于果皮、花生及紅酒中，具有顯著抗氧化作用，且?guī)缀鯖]有毒性，已有研究[4,5]顯示其具有延長細(xì)胞壽命的作用，但對于血小板氧化應(yīng)激、衰老及儲存時間的影響尚無相關(guān)報(bào)道。

材料與方法

1 取材與處理 選取6周大小的C57 black 6品系小鼠5只，取全血并使用ACD（檸檬酸鈉85.0 mmol/L，檸檬酸71.4 mmol/L，葡萄糖111.1 mmol/L）抗凝，ACD與全血體積比例為1∶6；于25℃下200 g離心10 min得到富含血小板的血漿，將每只小鼠樣本平均分為觀察組與對照組，觀察組中加入白藜蘆醇（購自中國藥品生物制品檢定所），并使用二甲基亞砜（購于上海順強(qiáng)生物科技有限公司）標(biāo)定至50 μmol/L；對照組加入等量二甲基亞砜。

2 評價(jià)指標(biāo) 所有樣本均儲存于（22±2）℃的振蕩條件下，分別于儲存第1，2，3，4，5，6，7 d進(jìn)行取樣檢測，取樣前使用37℃臺式液進(jìn)行溫和復(fù)蘇，并于3 h內(nèi)完成測定，具體操作委托天津諾禾生物公司進(jìn)行。

2.1 血小板代謝指標(biāo)：使用血細(xì)胞分析儀（型號：COULTER-JT，美國庫爾特公司）檢測平均血小板體積（mean platelet volume，MPV）及血小板計(jì)數(shù)，使用pH分析儀（型號：TP310，北京時代新維公司）及葡萄糖檢測試劑盒（購自北京雷根生物技術(shù)有限公司）檢測兩組樣本不同時間（1，2，3，4，5，6，7 d）的pH值及葡萄糖水平。

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 兩組血小板分散情況對比 儲存第1天兩組的血小板分散和聚集水平不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），觀察組于第3天和第5天的血小板分散和聚集水平顯著高于對照組（t=3.096，3.396，P=0.015，0.007；t=2.701，3.604，P=0.037，0.004），見圖4、圖5。

2.3 衰老指標(biāo)：使用Senescence-associatedβgalactosidase（SA-β-gal）細(xì)胞染色設(shè)備及染色劑（Beyotime生物技術(shù)），用PBS洗滌樣本一遍，加入1 mL 染色固定液，固定15 min。吸去固定液，加入PBS，室溫放置3 min，重復(fù)3次。吸出PBS，加入 1 mL染色混合液（每1 mL染色混合液中含有930 μL染色液C，10 μL染色液B，10 μL染色液A，50 μL X-gal溶液），在5%CO2孵化器中37℃孵育1 h。使用流式細(xì)胞儀（BD FACSCanto Ⅱ）統(tǒng)計(jì)兩組不同時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）的SA-β-gal染色陽性細(xì)胞比例。

2.4 血小板分散和聚集水平：儲存前，將富血小板血漿用溶媒（對照組）或10 μmol/L白藜蘆醇（觀察組）處理，并在室溫（22℃）下攪拌保存5天。①分散水平：于儲存第1、3和5 d，洗滌血小板后在纖維蛋白原包被的蓋玻片上鋪展45 min。使用顯微鏡（Olympus BX51,100X）和圖像捕獲軟件SPOT進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，手動計(jì)數(shù)5個樣本的4個視野，計(jì)算每個視野中完全散布的血小板百分比，并取其均值。②聚集水平采用血漿比濁法：將富血小板血漿置入無菌玻璃比色皿，加入ADP后，再加入表面涂硅的小磁粒，以1 200 r/min進(jìn)行攪拌，使用全血發(fā)光血小板聚集系統(tǒng)（Chrono-log）自動進(jìn)行測定、記錄、描繪，比較兩組不同時間的最大聚集率。

2.5 儲存指標(biāo)：測定血小板表面蛋白CD62P、膜聯(lián)蛋白Ⅴ及MitoSpy陽性水平，相應(yīng)試劑購自Abcam公司。不同時間（1，2，3，4，5，6，7 d）取兩組血小板重懸溶液200 μL，3 000 r/min離心15 min后棄掉上清。每個離心管加100 μL 的1% BSA溶液重懸。分別加入5 μL的CD62P、膜聯(lián)蛋白Ⅴ及MitoSpy抗體，加入10 μg/mL的抗GPIbα抗體，4℃避光孵育30 min。上下顛倒混勻后再加入1 mL PBS，3 000 r/min離心15 min，去上清，并用PBS溶液洗滌2次。按說明書加入相對應(yīng)的熒光標(biāo)記的二抗，4℃避光放置30 min，顛倒混勻。3 000 r/min離心15 min后去上清，以300 μL PBS溶液重懸后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

本文利用RUMiC2008和RUMiC2009城鎮(zhèn)居民收入調(diào)查數(shù)據(jù)，首次運(yùn)用面板數(shù)據(jù)的分位數(shù)回歸方法考察個體之間的幸福感差異及各因素對主觀幸福感的影響程度，發(fā)現(xiàn)在控制了不隨時間改變且不易觀察的個體性格或心理因素等差異后，健康、疾病、婚姻狀況、受教育年限、就業(yè)、年齡、性別及收入對主觀幸福感的影響同大多數(shù)研究文獻(xiàn)結(jié)論一致，即身體健康(主觀和客觀兩個角度)、已婚、教育、高收入均可顯著提高個體主觀幸福感，年齡對主觀幸福感的影響呈“U”形等。但主觀幸福感較高的人群受這些因素影響的程度相對較小，特別是收入，其對主觀幸福感的影響存在顯著異質(zhì)性，體現(xiàn)了分位數(shù)回歸相對于一般回歸方法的必要性。

去年11月二十國集團(tuán)峰會期間，法國總統(tǒng)薩科齊在和奧巴馬的一次私下交談中談到了以色列總理內(nèi)塔尼亞胡。薩科齊說：“我不想再見他了，他是個騙子?！眾W巴馬回應(yīng)道：“你也許對他感到反胃，但與你相比，我不得不更經(jīng)常與他打交道?！?/p>

3 兩組衰老指標(biāo)對比 儲存第1天兩組SA-β-gal活性強(qiáng)度無明顯差異，第2、3、4、5、6、7天觀察組SA-β-gal活性強(qiáng)度顯著低于對照組（t=3.237，4.004，4.909，3.875，4.392，3.359；P=0.013，0.001，0.000，0.002，0.000，0.010），見圖3。