顛茄種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究

范 為， 熊維政， 董誠(chéng)明， 李 磊， 郭 立， 馮言顏

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)， 鄭州 450046； 2.河南羚銳制藥股份有限公司， 河南 信陽(yáng) 465550)

顛茄(AtropabelladonnaL.)又稱(chēng)“野山茄”“顛茄草”，是茄科(Solanaceae)顛茄屬(AtropaL.)多年生草本，原產(chǎn)于歐洲地中海地區(qū)和小亞細(xì)亞，20世紀(jì)30年代引入我國(guó)[1]。顛茄味微苦、辛，有毒，主要有效成分為托烷類(lèi)生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、活血等藥理活性[2-3]。顛茄是我國(guó)藥典規(guī)定的唯一托品烷類(lèi)生物堿藥源植物，顛茄草飲片在中醫(yī)臨床處方上使用較少,現(xiàn)常將顛茄草制備成流浸膏、浸膏、酊劑、片劑等成藥制劑供臨床使用[4]。

現(xiàn)階段顛茄為種子繁殖，一年生栽培，全草采收。中藥材種子質(zhì)量關(guān)乎最終的產(chǎn)量與質(zhì)量，顛茄草因其產(chǎn)地分布零散，標(biāo)準(zhǔn)化種植基地仍在建設(shè)中，缺乏基礎(chǔ)性的生藥研究，目前對(duì)顛茄的研究多集中在化學(xué)成分、毛狀根等方面，國(guó)內(nèi)至今未見(jiàn)關(guān)于顛茄種子質(zhì)量的報(bào)道。本研究參考農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程[5]，對(duì)顛茄種子檢驗(yàn)方法進(jìn)行研究，以期為顛茄種子標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)，為顛茄草規(guī)范化種植基地的建設(shè)積累科研資料。

1 材料和方法

顛茄種子于2019年6月28日采自河南省新縣滸灣鄉(xiāng)河南羚銳制藥中藥材種植基地，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為顛茄(AtropabelladonnaL.)的成熟干燥種子。

1.1 種子真實(shí)性鑒定[6]

隨機(jī)取顛茄種子100粒，置于體式顯微鏡下觀(guān)察種子表面性狀特征[7]，并記錄種子長(zhǎng)、寬、厚的數(shù)值(mm)，重復(fù)3次。

1.2 扦 樣

按照凈度分析試驗(yàn)不能少于2 500粒種子、送檢樣品的重量超過(guò)凈度分析量10倍的原則，用四分法分取樣品進(jìn)行試驗(yàn)[8]。

1.3 凈度分析

考慮顛茄種子混雜的細(xì)小塵屑影響凈度分析的準(zhǔn)確性與可操作性，先將待分析的種子過(guò)20目篩，再進(jìn)行凈度分析。用鑷子將雜質(zhì)揀出并分別稱(chēng)重，重復(fù)3次，計(jì)算凈度。

1.4 千粒重測(cè)定

千粒重量測(cè)定方法如下： 1) 百粒法：每組100粒種子，重復(fù)8次； 2) 五百粒法：每組500粒種子，重復(fù)6次； 3) 千粒法：每組1000粒種子，重復(fù)3次。每組種子分別稱(chēng)重(g)，結(jié)果精確到0.001 g，計(jì)算三種方法稱(chēng)量結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.5 水分測(cè)定

顛茄種子水分測(cè)定采用整粒低恒溫烘干和整粒高恒溫烘干2種方法進(jìn)行試驗(yàn)。隨機(jī)取2份凈種子，每份約2 g，分別于(105±2)℃和(130±2)℃條件下烘干，重復(fù)3次。種子含水量計(jì)算公式如下：

種子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%;

式中：M1為稱(chēng)量瓶質(zhì)量，M2為稱(chēng)量瓶及樣品烘干前質(zhì)量，M3為稱(chēng)量瓶及樣品烘干后質(zhì)量。

1.6 生活力測(cè)定

采用TTC染色法，用pH 6.5～7.0的磷酸緩沖溶液將TTC配制成0.1%、0.3%、0.5%的溶液，避光保存。前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顛茄種皮透水性較弱，整粒種子直接染色效果差，故將種子浸于常溫蒸餾水中過(guò)夜[9]，用刀片將種子縱切，暴露胚或剝?nèi)∨?，備留染色用。選取TTC濃度(A)、染色時(shí)間(B)、染色溫度(C)為考察因素，每個(gè)因素選取三個(gè)水平，避光染色，以生活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用L9(33)安排試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1[10]。每處理300粒種子，3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。

表1 顛茄種子TTC染色法因素水平表

1.7 發(fā)芽試驗(yàn)

1.7.1發(fā)芽床的影響試驗(yàn)

設(shè)置紙上(設(shè)1～3層)、紙間、沙上、沙間四種發(fā)芽床，30 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中發(fā)芽。各處理種子的試驗(yàn)量為100粒，3次重復(fù)。

1.7.2溫度的影響試驗(yàn)

以2層濾紙做發(fā)芽床，于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫黑暗，15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃變溫黑暗條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，各處理種子的試驗(yàn)量為100粒，3次重復(fù)。

1.7.3光照的影響試驗(yàn)

以2層濾紙做發(fā)芽床，于12 h光照/12 h黑暗和全黑暗，30 ℃恒溫條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。各處理種子的試驗(yàn)量為100粒，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 顛茄種子性狀

顛茄種子三角狀腎形、橢圓形或卵形，長(zhǎng)1.6～2.3 mm，寬1.0～1.8 mm,厚0.4～1.0 mm，灰黃色或深褐色，無(wú)光澤。表面具微凸的細(xì)網(wǎng)紋。背面寬圓，腹面近平截，種臍位于腹面微凸處，具絨毛。胚乳豐富，胚呈環(huán)狀彎曲，乳白色(見(jiàn)圖1)。

圖1 顛茄種子特征圖

2.2 扦 樣

顛茄種子凈度分析試樣量大于3 g，送檢樣品量不少于30 g。

2.3 凈度分析

顛茄種子凈度分析結(jié)果見(jiàn)表2。3次重復(fù)的結(jié)果誤差在5%以?xún)?nèi)，表明此分析方法準(zhǔn)確可行。

表2 顛茄種子凈度分析結(jié)果

2.4 千粒重測(cè)定結(jié)果

顛茄種子千粒重測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。3種方法測(cè)定值的變異系數(shù)均小于4.0%，3種方法均可行。百粒法所需種子量少，因此顛茄種子千粒重量測(cè)定采用百粒法。

表3 顛茄種子千粒重測(cè)定結(jié)果

2.5 水分測(cè)定

顛茄種子水分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。整粒低恒溫(105±2)℃烘干4 h后水分含量無(wú)顯著性變化，整粒高恒溫(130±2)℃烘干2 h后水分含量無(wú)顯著性變化，且該方法測(cè)得的種子含水量較高，宜采用整粒高恒溫(130±2)℃烘干2 h測(cè)定顛茄種子含水量。

表4 顛茄種子水分測(cè)定結(jié)果

2.6 生活力測(cè)定

顛茄種子生活力測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，由試驗(yàn)極差R得出影響因素大小為T(mén)TC濃度>染色溫度>染色時(shí)間。根據(jù)綜合評(píng)分，按單指標(biāo)方法做直觀(guān)分析，得出TTC法測(cè)定顛茄種子生活力的最佳條件為A2B3C2，即縱切或剝?nèi)》N子胚，在0.3%TTC溶液中30 ℃恒溫黑暗條件下染色3 h(見(jiàn)圖2)。

注：A～D為有生命活力的胚；E～H為無(wú)生命活力的胚。

表5 不同TTC濃度、染色時(shí)間、染色溫度對(duì)顛茄種子生活力的影響

2.7 發(fā)芽率測(cè)定

2.7.1發(fā)芽床選擇

不同發(fā)芽床對(duì)顛茄種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表6，紙上、紙間、沙上、沙間發(fā)芽床對(duì)種子發(fā)芽率影響不顯著(p>0.05)，紙上、沙上、沙間處理的發(fā)芽勢(shì)顯著高于紙間處理的發(fā)芽勢(shì)(p<0.05)。出于經(jīng)濟(jì)和便捷考慮，把紙上作為顛茄種子的發(fā)芽床。

表6 不同發(fā)芽床對(duì)顛茄種子發(fā)芽率的影響

不同紙張層數(shù)(1～3層)對(duì)顛茄種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表7，紙張層數(shù)對(duì)顛茄種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)影響不顯著(p>0.05)，綜合操作便捷性和保濕性能考慮，選用2層作為顛茄發(fā)芽的紙張層數(shù)。

表7 紙張層數(shù)對(duì)顛茄種子萌發(fā)的影響

2.7.2發(fā)芽溫度確定

不同溫度對(duì)顛茄種子萌發(fā)的影響見(jiàn)圖3，種子在10、15、20、25、30、35 ℃恒溫及15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃變溫條件下終發(fā)芽率分別為0、24.00%、42.33%、63.67%、88.00%、47.00%、51.67%、86.00%發(fā)芽勢(shì)分別為0、4.33%、35.67%、45.67%、57.67%、47.00%、29.67%、83.67%。種子在30 ℃與20 ℃/30 ℃變溫條件下的終發(fā)芽率無(wú)顯著性差異，且顯著高于其他處理(p<0.05)。綜合以上結(jié)果，顛茄種子發(fā)芽溫度以30 ℃恒溫和20 ℃/30 ℃變溫條件最好，30 ℃恒溫條件便于操作，建議在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

圖3 不同溫度培養(yǎng)條件下顛茄種子發(fā)芽率的變化

2.7.3發(fā)芽光照選擇

不同光照條件對(duì)顛茄種子萌發(fā)的影響見(jiàn)表8，顛茄種子在全黑暗條件下的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)顯著高于12 h光照/12 h黑暗的處理(p<0.05)，因此顛茄發(fā)芽宜在全黑暗條件下進(jìn)行。

表8 光照條件對(duì)顛茄種子萌發(fā)的影響

2.7.4顛茄種子發(fā)芽首次和末次計(jì)數(shù)時(shí)間

在確定的最優(yōu)條件發(fā)芽試驗(yàn)中，顛茄種子發(fā)芽起始時(shí)間為第5～6天 (圖4)，發(fā)芽終止時(shí)間為第14天。因此顛茄種子發(fā)芽試驗(yàn)首末次計(jì)數(shù)時(shí)間為5～14 d。

圖4 顛茄種子發(fā)芽形態(tài)

3 結(jié)論與討論

本研究從凈度、千粒重、含水量、生命活力、發(fā)芽率試驗(yàn)對(duì)顛茄種子質(zhì)量進(jìn)行了初步研究，適用于顛茄種子質(zhì)量檢驗(yàn)。目前，顛茄種子須由人工采收。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，少數(shù)種子籽粒瘦弱且種皮顏色較淺，這類(lèi)種子發(fā)芽率極低，或者發(fā)芽完成的時(shí)間超過(guò)正常值，考慮這類(lèi)種子成熟度不夠，種皮顏色、種子大小與種子質(zhì)量的聯(lián)系需進(jìn)一步研究[11]，顛茄植株的花序形態(tài)為二歧聚傘花序，進(jìn)入花期后頂花序上的果實(shí)便開(kāi)始成熟且生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)，成熟度高于植株頂端的果實(shí)，關(guān)于種子的采種時(shí)間與成熟度的劃分方法的研究還有待進(jìn)一步開(kāi)展。

在進(jìn)行水分測(cè)定預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于顛茄種子顆粒較小且胚乳中脂質(zhì)成分較多，粉碎后的種子互相發(fā)生粘黏，使試驗(yàn)不可控因素增多，權(quán)衡試驗(yàn)可操作性與結(jié)果準(zhǔn)確性，最終選擇整粒法進(jìn)行水分測(cè)定試驗(yàn)；此外，在顛茄種子生活力試驗(yàn)中，整粒種子直接染色效果較差，剝?nèi)》N子胚具有不可操作性，將種子縱切進(jìn)行染色效果較好；在發(fā)芽試驗(yàn)中考察了不同溫度處理，結(jié)果表明，30 ℃恒溫和20 ℃/30 ℃變溫處理的種子發(fā)芽率最高，可達(dá)到85%以上。顛茄種子發(fā)芽完成的時(shí)間較長(zhǎng)，而顛茄又存在最佳采收期的問(wèn)題，建議實(shí)際育苗時(shí)可使用一些商品育苗基質(zhì)[12]，以提高種苗質(zhì)量，同時(shí)使其出苗一致，進(jìn)而確保藥材高產(chǎn)和質(zhì)量穩(wěn)定。此外，顛茄種子種皮透水性弱且較硬實(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)芽前采用50 ℃水浸種，攪拌冷卻后再浸泡12 h作為發(fā)芽前的種子處理，種子處理方法還有待進(jìn)一步考察。

2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定顛茄草的采收期為“開(kāi)花至結(jié)果期”，全草采收，本課題組通過(guò)產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在實(shí)際生產(chǎn)中顛茄常經(jīng)醫(yī)藥公司承包給農(nóng)戶(hù)種植，出于種植面積有限和留種的考慮，農(nóng)戶(hù)常將種子單獨(dú)出售，破壞了全草的完整性，很難保證藥材質(zhì)量穩(wěn)定，應(yīng)加快推進(jìn)顛茄草留種基地的建設(shè)。