蝦青素微囊粉的制備與質量評價及其初步藥代動力學

蝦青素（astaxanthin，Asta）化學名稱為 3，3^′ 二羥基-4， 4^′ -二酮基 -β?β^′ -胡蘿卜素，是一種在自然界中廣泛存在的天然色素，在甲殼類動物、鮭魚及某些藻類等生物體內均有分布[1]。研究表明，Asta 具有豐富多樣的生物活性，包括抗癌[2]、可猝滅多種活性氧（ROS）[3]和活性氮（RNS）[4]及其他自由基[5]、可強效抑制脂質過氧化物的積累[6]、還可抑制生物體內多種炎癥因子等[7作用。因此，Asta 可應用于食品、醫(yī)藥、美妝[8]等諸多領域中，其相關產品在調節(jié)人體機能、維護健康等方面發(fā)揮著重要功能[9]。然而，相較于其他普通類胡蘿卜素，Asta具有更強的易被氧化性，更容易受到光照、氧氣、溫度等環(huán)境因素的影響，從而影響其穩(wěn)定性和生物利用度[10]。

為提升Asta在更廣泛實際應用場景中的效能，并解決其穩(wěn)定性差、生物利用度低及水溶性差的問題，采用微膠囊運載體系對 Asta 進行包埋[11]。微膠囊[12]（microcapsules，MCs）化是指通過高分子壁材將芯材（即需包埋的物質）包埋形成微小粒子的技術。高分子壁材形成的致密囊壁可有效隔離氧氣、光線、水分等因素，防止Asta因氧化和降解導致結構受到破壞，從而提高其穩(wěn)定性，并且部分高分子壁材具有增溶和緩釋作用，可改善Asta的溶解性和釋放特性，從而提高其在體內的生物利用度。相關研究表明，MCs的包埋效果和作用主要取決于壁材的特性及制備方法[13]。為實現(xiàn)高效包埋效果，提高 Asta的包封率和穩(wěn)定性，本文采用噴霧干燥法制備了蝦青素微囊粉（Asta-MCs），并對其進行質量評價及體內藥代動力學研究。

1" 材料與方法

1.1 實驗儀器

JJ-2B型高速剪切勻漿機（上海達洛科學儀器有限公司）;SN-P4TD型超聲細胞破碎儀（深圳柏萊科技有限公司）;YC-500型實驗室噴霧干燥機（上海雅程儀器設備有限公司）;SU3800型掃描電子顯微鏡（SEM）（上海日立高新技術公司）;90 Plus PALS型粒度分析儀（美國 Brookhaven Instruments 公司）；臺式冷凍高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)公司）;DHS型電子水分測定儀（上海邦西儀器科技有限公司）;YRE-201D型旋轉蒸發(fā)器（河南省鞏義市予華儀器有限責任公司）;UV-201型紫外可見分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）；P230型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）。

1.2 實驗材料

SPF 級雄性SD大鼠（體質量為 250～300g ，購自福州吳氏試驗動物研究中心）；蝦青素標準品（純度 598% ，阿拉丁試劑上海有限公司）；雨生紅球藻油（ Hpo） （質量分數(shù)為 15% ，昆明白鷗微藻技術有限公司）；市售天然蝦青素微囊粉（純度為 2% ，山東拜昂生物技術有限公司）；辛烯基琥珀酸酯淀粉（河北鴻鵠科技有限公司，食品級）；羥丙基 ?β 環(huán)糊精（淄博千匯生物科技公司，藥用輔料）；麥芽糊精（天津市天力化學試劑有限公司）;聚甘油脂肪酸酯、單硬脂酸甘油酯（山東優(yōu)索化工科技公司）;甲醇、二氯甲烷、石油醚、丙酮、正己烷（中國醫(yī)藥集團有限公司，分析純）。

1.3 Asta-MCs的制備

選取辛烯基琥珀酸酯淀粉（OSA）、羥丙基 -β^- 環(huán)糊精（H-β-CD）及麥芽糊精（MD）作為高分子壁材，三者質量比為 6：3：2 ，固形物質量分數(shù)為 24% 。以 Hpo 作為芯材，壁材與芯材的質量比為 3.5：1.0 。按比例稱取OSA、 H-β CD和MD置于燒杯中，加人一定量蒸餾水后，于 50^°C 水浴中放置 10min ，期間持續(xù)攪拌，使壁材完全溶解。取出壁材溶液，待其充分冷卻后，加入質量分數(shù)為 2% 的乳化劑（聚甘油脂肪酸酯和單硬脂酸甘油酯的質量比為 ，使用高速剪切勻漿機 5000r?min^-1 剪切 3min ，緩慢均勻向其中加入芯材，剪切 5min ，得到初乳化液。再將初乳化液放置到超聲細胞破碎儀內，于500W的功率條件下，超聲 15min 進行細化，制備得到Asta乳化液。設定噴霧干燥機的進風溫度為 140^°C ，進料速度為 10r?min^-1 ，待實驗完成后，收取噴霧干燥機收料罐內的Asta-MCs。

1.4 Asta-MCs的質量評價

1.4.1 Asta-MCs 形貌 將制成的Asta-MCs用毛細管點在錫箔紙上，室溫條件下，在樣品上噴金鍍膜，置于掃描電子顯微鏡下，在 15kV 條件下觀察拍照。

1.4.2Asta標準曲線的建立稱取 10mg 蝦青素標準品，加入體積比為 3：1 的甲醇-二氯甲烷溶液溶解并定容至 100mL ，配制得到 100μg?mL^-1 的Asta標準品溶液。取一定量上述標準品溶液，分別配制成質量濃度為 的Asta標準品溶液。采用紫外可見分光光度計在波長 480nm 處測量其吸光度值。將不同質量濃度的Asta標準品溶液與其對應的吸光度值進行擬合，繪制標準曲線。

1.4.3粒徑測定將 0.1mg 的Asta-MCs與 5mL 蒸餾水充分混勻稀釋，采用納米粒度儀在室溫下測定（粒徑人射角 165^° ）Asta-MCs的粒徑分布。

1.4.4Asta質量分數(shù)的測定取一定量的Asta-MCs與 20mL 純水混勻，超聲輔助溶解，用體積比為1：1 的石油醚-丙酮溶液進行少量多次萃取，待分層后取上層液，多次萃取直至下層液無色，將上層液合并使用旋轉蒸發(fā)儀烘干，用甲醇-二氯甲烷溶液復溶，在 480nm 波長下檢測吸光度值并記錄，根據(jù)稀釋比例和標準曲線方程計算得到Asta質量分數(shù)。

1.4.5含水量測定取一定量的Asta-MCs，置于水分測定儀中， 105^°C 下烘至恒質量，測定其含水量。1.4.6溶解度測定取質量為 m₀ 的 Asta-MCs，加人 10mL 蒸餾水，渦旋振蕩 5min 后，置于高速離心機中，轉速 5000r?min^-1 離心 5min ，取上清。重新加入 10mL 蒸餾水，重復上述離心操作。將兩次離心得到的上清液合并后，放入 90^°C 的恒溫干燥箱中，直至達到恒質量。此時，稱量上清殘余物，質量記為 m₁ 。溶解度計算公式為

1.4.7包封率和載藥量測定取質量為 m 的Asta-MCs加人 20mL 正己烷渦旋 1min 后抽濾、旋蒸烘干，用體積比為 3：1 的甲醇-二氯甲烷溶液復溶，在波長 480nm 下測其吸光度，并根據(jù)稀釋比和標準曲線方程計算得到Asta-MCs表面的Asta質量 。取等量Asta-MCs與 20mL 純水混勻，用體積比為 1：1 的石油醚-丙酮萃取至上清無色，合并烘干后用甲醇-二氯甲烷復溶，在波長 480nm 下測其吸光度，并根據(jù)稀釋比和標準曲線方程計算得到Asta總質量 （m_∴） 。Asta-MCs包封率 （R_E）^[15] 計算公式為

Asta-MCs 載藥量 （Q）^[16] 計算公式為

1.4.8休止角測定通過測定休止角表征Asta-MCs的流動性。精確稱量 2g Asta-MCs，將漏斗固定在特定高度位置，向漏斗中緩慢加入稱取的Asta-MCs，使其能夠垂直流到漏斗下方，Asta-MCs粉末在下方堆積形成一個錐體。測量該錐體，得到錐體高度為 h ，錐體半徑為 r ，休止角 （θ）^[17] 計算公式為

1.5 Asta-MCs的體內分析方法

1.5.1 色譜條件 用依利特 SinoChrom ODS-BP 型色譜柱 （4.6mm×250.0mm，5μm） ;流動相為甲醇-水（體積比為 95：5） ；檢測波長為 480nm ；流速為 1.0mL?min^-1 ;進樣量為 10μL 。

1.5.2溶液配制稱取 10mg 蝦青素標準品，加入體積比為 3：1 的甲醇-二氯甲烷溶液溶解并定容至（204號 100mL ，配制得到 100μg?mL^-1 的 Asta 標準品溶液。取一定量Hpo 溶于玉米油中，配置得到 Hpo 組灌胃制劑。取一定量自制Asta-MCs，加入蒸餾水中溶解并定容至 100mL ，配置得到自制Asta-MCs組灌胃制劑；同樣方法配置得到市售Asta-MCs組灌胃制劑。

1.5.3血漿樣品制備取 0.5mL 大鼠眼眶靜脈叢血置于含有肝素鈉的 1.5mL EP管中，置于高速冷凍離心機，在 的條件下離心 10min 。離心結束后，吸取上清液（即為經過初步處理的大鼠血漿），存放于一 20° 冰箱中備用。精確移取 200μL 上述大鼠血漿，加入5倍體積的甲醇-二氯甲烷溶液，充分混勻后于 條件下離心 5min ，收集下層液體，重復萃取3次，合并萃取液，再用氮氣將合并萃取液吹干。用 1mL 甲醇-二氯甲烷溶液復溶，再用 0.22μm 有機濾膜過濾后，將其置于棕色液相進樣瓶中，從而得到待測血漿樣品[18]

1.5.4專屬性實驗分別取空白血漿、給藥后大鼠體內血漿、含藥血漿（取空白血漿加入一定量的Asta 標準品儲備液）3種血漿樣品，處理待檢測樣品后，按照上述色譜條件進樣分析。

1.5.5體內標準曲線的繪制分別取一定量 100μg?mL^-1 的Asta標準品溶液，用甲醇-二氯甲烷溶液稀釋，配制成質量濃度分別為 0.4，0.8，1.6，3.2，4.8，6.4μg?mL^-1 的Asta 標準品溶液。準確移取各個質量濃度的Asta標準品溶液 50μL 并加入 150μL 空白血漿，充分混勻，得到質量濃度為0.1、0.2，0.4，0.8，1.2，1.6μg?mL^-1 的含藥血漿，提取并按上述色譜條件進樣分析，建立標準曲線。

1.5.6精密度實驗分別移取 50μL 低、中、高3種質量濃度 的Asta標準品溶液，并加人 150μL 空白血漿，充分混勻，得到質量濃度分別為 0.1，0.8，1.6μg?mL^-1 的含藥血漿。提取后進樣分析，每個樣品重復測定6次。

1.5.7穩(wěn)定性實驗取一定量 3.2μg?mL^-1 的Asta標準品溶液與空白血漿以體積比 1：3 混合，渦旋混勻，得到質量濃度為 1.6μg?mL^-1 的含藥血漿，于 4^°C 環(huán)境中保存，分別于 0.24，48，72h 取用，提取后進樣分析，每個樣品重復測定3次。

1.5.8回收率實驗分別取 的 Asta 標準品溶液 50μL ，每個樣品重復測定：次，代人標準曲線計算Asta實際質量濃度，結合Asta理論質量濃度，計算回收率 Ξ（Λ_η） 。

1.6 大鼠體內藥動學研究

將24只SPF級雄性SD大鼠，隨機分成4組（空白對照組、 Hpo 組、市售Asta-MCs組、自制AstaMCs組），每組6只。正式實驗灌胃前，禁食 ^12h ，不禁水。按照 50mg?kg^-1 的劑量對大鼠進行單次灌胃。灌胃給藥后，于0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、16.0、24.0、48.0h對大鼠進行眼眶取血0.5mL，處理血漿制備樣品。按上述色譜條件對樣品進行分析，將樣品的峰面積數(shù)據(jù)代人標準曲線方程中計算得知血藥質量濃度[19]，以時間為橫坐標，血藥質量濃度為縱坐標繪圖。對Asta-MCs進行大鼠的體內評價研究，通過實施單次口服的藥代動力學實驗，收集大鼠喂藥后的血液樣本，檢測得到Asta在不同時間點的血藥質量濃度，采用非房室模型對結果進行處理分析，并與Hpo及市售Asta-MCs進行對比。數(shù)據(jù)分析采用DAS2.0軟件，相對生物利用度 （F） 計算公式為

式（5）中： AUC_{T，0～∞} 表示受試制劑的血藥質量濃度-時間曲線下面積; AUC_{R，0～∞} 表示參比制劑的血藥質量濃度-時間曲線下面積； D_R 表示參比制劑的給藥劑量； 表示受試制劑的給藥劑量。

2 實驗結果與分析

2.1 Asta-MCs的質量評價

2.1.1Asta-MCs形貌Asta-MCs的掃描電鏡圖和外觀圖，如圖1所示。由圖1（a）、（b）可知：Asta-MCs顆粒呈類球形，多數(shù)顆粒均勻且結構完整，少數(shù)存在裂縫和凹陷現(xiàn)象，原因可能是噴霧干燥過程中，部分 MCs 遇冷皺縮，或是在噴霧過程中受機械應力的影響導致。在結構完好的MCs中，壁材能將芯材緊密包裹其中，從而隔絕外界不良環(huán)境因素的影響，使蝦青素的穩(wěn)定性顯著提高。

由圖1（c）可知：自制Asta-MCs為橙紅色粉末，無不良氣味，顆粒細致均勻，無結塊現(xiàn)象，表明噴霧干燥法能夠制備出干燥的Asta-MCs，相較于 Hpo ，其穩(wěn)定性更高、便攜性更佳。

2.1.2Asta的標準曲線采用紫外可見分光光度法測定不同質量濃度的Asta標準品溶液，線性回歸得到Asta標準曲線方程 Y=0.20091X+0.0116 ，相關系數(shù) R²=0.9998 。表明Asta在 ·mL^-1 范圍內呈現(xiàn)出顯著的線性關系。

2.1.3Asta-MCs基本理化性能 經測定，Asta-MCs 的各項基本理化性能如下：粒徑為 （478.000± 22.724） nm ，顆粒分布較為均勻；Asta質量分數(shù)為 （2.031±0.535）% ；含水量為 （3.26±0.51）% ，含水量較低，產品不易結塊和變質，有利于保存；Asta-MCs溶解度為 （95.05±1.85）% ，相比 Hpo 的溶解度（1.27±0.65）% ，Asta-MCs在水中的溶解性更好，Asta-MCs的復水溶液在避光條件下靜置 24h 未出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象，進一步證明了其良好的穩(wěn)定性;Asta-MCs的包封率為 （79.07±0.72）% ; Asta-MCs的載藥量為 （1.013±0.241）% ;Asta-MCs的休止角為 （30.87±1.54）^° ，表明該Asta-MCs流動性良好。

綜上所述，所制備的Asta-MCs在各項基本評價指標上表現(xiàn)良好，具有廣闊的應用前景。

2.2 Asta-MCs的體內分析結果

2.2.1專屬性采用高效液相色譜（HPLC）法測定3種血漿樣品，其色譜圖如圖2所示。圖2中： A 為光吸收強度； ?_t 為時間。由圖2可知：Asta在此色譜條件下 10min 出峰，系統(tǒng)適應性良好，且空白血漿對 Asta的測定不產生干擾，該體內分析方法專屬性良好，且符合體內樣品的基本分析要求。

2.2.2Asta體內標準曲線采用HPLC法測定不同質量濃度 （ρ） 的含藥血漿，線性回歸得到Asta體內標準曲線，如圖3所示。由圖3可知：大鼠血漿的標準曲線方程為 Y=68. 499X- 7.910，相關系數(shù) ，表明Asta在質量濃度 0.1～1.6 μg?mL^-1 范圍內的線性關系顯著。

2.2.3精密度Asta精密度實驗結果，如表1所示。表1中：ρ_a 為Asta質量濃度實測值；RSD_ρ"分別為Asta質量濃度的標準差和相對標準偏差。由表1可知：在低、中、高3種質量濃度的含藥血漿中，Asta質量濃度的相對標準偏差分別為3.52%.2.26%.1.20% ，均小于 5% ，表明該方法精密度良好。

2.2.4穩(wěn)定性測得 0.24，48，72h 的含藥血漿中Asta質量濃度分別為 （1.591±0.015） 、 （1.644± 0.067）、 （1.564±0.007） 、 （1.604±0.012） ） μg?mL^-1，σ_ρ 為 （1.601±0.042） ） μg?mL^-1 ， RSD_ρ 為2.63% ，小于 5% ，表明該血漿樣品在 0～72h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.5回收率Asta 回收率實驗結果，如表2所示。表2中： σ_η?RSD_η 分別為Asta 回收率的標準差和相對標準偏差。由表2可知：低、中、高3種質量濃度的Asta血漿樣品溶液回收率分別為 97.25%～ 104.75% . RSD_η 分別為 3.91%.1.67%.1.07% ，均小于 5% ，表明該方法回收率良好。

2.2.6大鼠體內藥動學研究大鼠單次口服給藥后，血藥質量濃度 Π（ρ_p） -時間曲線，如圖4所示。

由圖4可知：大鼠口服Hpo后，血藥質量濃度在 達到峰值，為 （0，937±0，050） 三 μg?mL^-1 ;而口服市售Asta-MCs和自制Asta-MCs的兩組大鼠的血藥質量濃度則在 8h 時達到峰值，分別為 （1.139±0.063） ！ （1.191±0.060 ） μg?mL^-1 。實驗結果表明：Asta-MCs可以延長血藥質量濃度達到峰值的時間。大鼠在口服自制Asta-MCs后，血藥質量濃度峰值高于市售Asta-MCs組，且為 Hp₀ 組血藥質量濃度峰值的1.619倍，表明經過工藝優(yōu)化后的Asta-MCs生物利用度良好，且延長了Asta在大鼠體內的作用時間。

使用Data Analysis System軟件通過非房室模型計算藥代動力學參數(shù)，結果如表3所示。表3中：t_1/2 為半衰期; t_M，0～∞?t_M，0～t 分別表示時間 0～∞ 和 0～t 的平均滯留時間; ρ_max 為達峰質量濃度; t_max 為達峰時間； AUC_0～∞ ： AUC_°～ι 分別表示時間 0～∞ 和 0～t 的血藥質量濃度-時間曲線下面積；與Hpo相比，表示 Plt;0.05 ，**表示 Plt;0.01 ，***表示 Plt;0.001 。

由表3可知：相比市售Asta-MCs和Hpo，自制Asta-MCs在多個藥代動力學參數(shù)均顯著提升。自制Asta-MCs的 t_1/2 顯著高于 Hpo 和市售Asta-MCs，且是 Hpo 的1.45倍，表明其在體內的代謝過程相對緩慢；自制Asta-MCs的 t_M，0～t 顯著高于另外兩組，表明自制Asta-MCs在體內停留時間更長、緩釋性能更好；自制Asta-MCs的最大質量濃度為 （1.191±0.060） ） μg?mL^-1 ，相較于Hpo 的 （0.736±0.058） （2（204 μg?mL^-1 有顯著提高，且是 Hpo 的1.62倍；自制Asta-MCs的達峰時間為 8h ，與市售 Asta-MCs相同，但長于Hpo 的 ，表明Asta-MCs 制劑（包括市售和自制）相較于Hpo，能夠延遲Asta 在體內達到峰值質量濃度的時間，這可能是由于微囊化結構對Asta的釋放起到了調控作用；自制Asta-MCs的AUC_0～t 明顯大于Hpo和市售Asta-MCs，且是Hpo的1.92倍，表明自制Asta-MCs在體內吸收程度更好，藥物在體內的暴露量更大；自制Asta-MCs的相對生物利用度為 182.32% ，明顯高于市售Asta-MCs的 156.56% ，表明自制Asta-MCs對提升Asta在體內生物利用度方面效果顯著。

相較于Hpo 和市售Asta-MCs，自制Asta-MCs具有更高的血藥質量濃度和相對生物利用度，可能有以下3點原因。1）自制Asta-MCs采用噴霧干燥法制備，噴霧干燥過程中快速干燥，可以減少熱敏成分Asta 的降解，保持其生物活性。2）自制Asta-MCs選擇優(yōu)質Asta 原料，合適的壁材和工藝參數(shù)可有效提高Asta 的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度。3）口服給藥后，Asta-MCs可能通過微囊化保護Asta免受消化過程中的降解，以及調控其在腸道中的釋放提高口服生物利用度。

3 結論

已有研究指出，部分運載體系如脂質體、乳液和納米顆粒等可提高Asta的穩(wěn)定性和生物利用度。Pan 等[20使用大豆磷脂酰膽堿通過膜分散-超聲技術將Asta包封在納米脂質體中，與游離Asta 相比，大大增強了Asta的水分散性，還降低了其釋放速率。 Xu 等[21]開發(fā)了以玉米醇溶蛋白和海藻酸鈉為穩(wěn)定劑的Asta負載Pickering乳液，在不同 pH 值 （3.0～11.0） 和金屬離子條件下表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，且在加熱過程中能夠有效保持 Asta 的抗氧化活性。Hoang 等[22]利用聚乳酸和聚乙二醇組成的共聚物包裹Asta，成功制備出含有 5% 蝦青素的納米顆粒，粒徑約為 90nm ，大大提升了其溶解度和生物利用度，實現(xiàn)更好的遞送效果。然而，這些方法存在一定的局限性。脂質體和乳液雖然能夠提高Asta 的生物利用度，但貯藏穩(wěn)定性差，容易在儲存和使用過程中發(fā)生藥物泄露，影響療效。納米顆粒雖然穩(wěn)定性較好，但制備過程中使用的聚合物往往價格昂貴，且制備工藝復雜，限制了其在工業(yè)生產中的應用。

采用辛烯基琥珀酸酯淀粉、羥丙基 ?β 環(huán)糊精及麥芽糊精作為高分子壁材，并以Hpo為芯材，按照特定的比例和嚴格的工藝流程，運用噴霧干燥法成功制備了Asta-MCs，并對其進行質量評價及體內研究。結果顯示，自制Asta-MCs呈現(xiàn)出良好的粒徑、適宜的含水量、高溶解度、較高的包封率和載藥量，以及良好的流動性，這為其在食品、醫(yī)藥和化妝品等領域的應用提供了基礎。此外，通過大鼠單次口服給藥的藥代動力學實驗發(fā)現(xiàn)，自制Asta-MCs在藥代動力學參數(shù)上相較于Hpo和市售 Asta-MCs均表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，自制Asta-MCs的相對生物利用度高達 182.32% ，這表明自制Asta-MCs能顯著提高Asta 的口服生物利用度。未來的研究將進一步優(yōu)化微囊化工藝、探索不同壁材對蝦青素穩(wěn)定性和生物利用度的影響，研究微囊粉在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性。

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（責任編輯：黃曉楠 英文審校：劉源崗）