酵母單雜與亞細胞定位技術在水稻抗病基因啟動子互作蛋白篩選中的應用進展

中圖分類號：S-03 文獻標志碼：A 文章編號：1673-6737（2025）03-0031-05

Abstract：Asanimportantglobalfoodcrop，diseasemanagementofriceisof greatsignificance forensuringfoodsecurity. Theresearchaims toreview theapplication progressofyeastone hybridandsubcelularlocalization techniquesin screningpromoterinteractingproteinsofricediseaseresistancegenes，andexplorethepotentialofthesetechniquesin improvingricediseaseresistance.Byanalyzing theapplicationcasesof these technologies，guidancewillbe provided for futureresearchdirections，andnewstrategiesandmethodswillbeprovidedforricediseaseresistancebreding.The resultsindicatethatyeastonehybridtechnologyhashighsensivityandsimpleoperationinidentifyingspecificbinding proteinsof specificDNA sequences，whilesubcelular localizationtechnologyprovidesan important perspectivefor understanding protein function and its role in signal transduction pathways.

KeyWords：Rice;Disease-resistant genes；Golden iron lock；Yeast singlecompound;Subcelularlocalization

在現代農業(yè)生產中，水稻作為全球重要的糧食作物之一，其病害管理尤為關鍵。隨著分子生物學技術的發(fā)展，對水稻抗病基因的研究已經從傳統(tǒng)的遺傳學方法轉向了分子層面的深入探索。其中，酵母單雜交系統(tǒng)和亞細胞定位技術的應用，為水稻抗病基因啟動子互作蛋白的篩選提供了強有力的工具。酵母單雜交系統(tǒng)是一種在酵母細胞內分析與鑒定轉錄因子與DNA順式作用元件相互結合的有效方法[1-2]。該系統(tǒng)基于真核生物轉錄激活因子的DNA結合結構域和激活結構域的功能獨立性，通過構建含有特定順式作用元件的誘餌DNA和轉錄因子融合的獵物蛋白，來鑒定和驗證轉錄因子-基因調控序列的相互作用關系[3。這一技術的應用，不僅能夠識別與特定DNA序列特異性結合的蛋白質，還能篩選和鑒定蛋白質間的相互作用關系，從而構建蛋白質相互作用網絡。亞細胞定位技術則能夠確定蛋白質在細胞內的具體位置，這對于理解蛋白質的功能和它們在信號傳導途徑中的作用至關重要。

特別是在水稻抗病基因的研究中，通過亞細胞定位技術可以揭示抗病相關蛋白在細胞內的功能區(qū)域，進而推斷其在抗病過程中的作用機制。酵母單雜交系統(tǒng)因其操作簡單、靈敏度高、能夠直接從基因文庫中找到編碼蛋白的DNA序列等優(yōu)點，在植物基因工程研究中的應用日益廣泛。酵母單雜交與亞細胞定位技術在水稻抗病基因啟動子互作蛋白篩選中的應用，不僅加深了對水稻抗病機制的理解，也為抗病基因的克隆和利用提供了新的策略和方法。研究將綜述這些技術在水稻抗病基因研究中的應用進展，探討它們在提高水稻抗病性方面的應用進展。

1水稻抗病基因研究進展

水稻稻瘟病是影響水稻產量最主要的病害之一，稻瘟病在水稻的各個生育期都可發(fā)生，根據發(fā)生時期和部位不同，可以分為苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟和谷粒瘟等。病斑具有明顯的褐色邊緣，中央灰白色，在潮濕條件下，病部會產生灰綠色的霉狀物。侯金祥等人對早燦稻稻瘟病抗性基因進行了鑒定，在104份早稻稻瘟病抗性基因鑒定中發(fā)現Pigm基因分布最廣，攜帶Pigm的品系最多，但感病頻率存在。Pi2、Pikh和Pita基因的品系均表現抗病，具有育種應用潛力。李小曼成功克隆了杜仲EuCHIT73.88基因，并在煙草和水稻中驗證了其抗病性。該基因在煙草和水稻保護性酶活性提高，病程相關蛋白基因表達量上調，表現出增強的抗病性，創(chuàng)制出了新的抗病水稻種質。水稻張世璽的研究團隊通過雜交和回交方法，成功聚合了抗稻瘟病基因Pia和抗白葉枯病基因 Xa23 ，創(chuàng)制了70份穩(wěn)定的水稻恢復系。這些恢復系及其雜交組合在田間表現中抗性均達到中抗及以上水平，有效提升了水稻對兩種主要病害的抗性。于雅潔等人發(fā)現抗性基因Pib在江蘇太湖地區(qū)粳稻中分布頻率最高，Pita次之，Pi2最低。Pita、Pib及Pi2的熒光掃描結果如圖1所示[]。圖1中，多數材料攜帶2個抗性基因，尤其是 Pita+Pib 組合較為常見。田間抗病性鑒定表明，材料中存在復合基因型時，中抗級別以上材料占比顯著高于單一基因型，表明抗性基因共存可增強對稻瘟病的抗性。

水稻作為主要糧食產物，其抗病性研究關乎世界人民的“飯碗”。迄今為止，已鑒定出100多個稻瘟病主效抗性基因和30多個部分抗性基因。其中28個主效抗性基因如Pi2、Pita、Pib等已被成功克隆，為抗病育種提供了分子標記輔助選擇。抗病基因在不同水稻品種中分布不均，如Pi2、Pita、Pib等基因在某些地區(qū)可能存在較高的分布頻率[1-12]抗病基因的聚合可以提高水稻對稻瘟病的抗性，如Pi2、Pita、Pib的聚合可以增強水稻對稻瘟病的抗性?？共』虻淖饔脵C制涉及模式識別受體和抗性蛋白?？共』蛲ㄟ^編碼NBS-LRR類蛋白，增強水稻的抗病性。通過雜交和分子標記輔助選擇，提高水稻的抗病性[13-14。利用基因聚合技術，提高水稻對多種病害的抗性。未來的研究更加注重水稻抗病基因的分子機制。

2酵母單雜及亞細胞定位技術在啟動子互作蛋白篩選中的應用

2.1亞細胞定位技術在基因表達分析中的應用亞細胞定位技術是一系列用于確定蛋白質或

RNA在細胞內特定位置的方法。這些技術包括免疫熒光顯微鏡、電子顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細胞術等。它們通過標記目標分子，利用熒光染料、抗體或生物素等探針，結合顯微成像技術，揭示生物大分子在細胞中的分布[5。蘇浩天等人成功克隆草地早熟禾PpMYB2基因，并發(fā)現其在根中表達量最高，響應GA和ABA激素，以及干旱和高鹽脅迫。亞細胞定位分析顯示 PpMYB2 定位于細胞核，表明其作為轉錄因子的活性。溫海洋的研究團隊克隆了煙草NtWRKY11基因，發(fā)現其編碼332個氨基酸，與苧麻BnWRKY11相似性達54.23% 。亞細胞定位技術揭示NtWRKY11蛋白定位于細胞核，表明其作為轉錄因子的功能。亞細胞定位技術的原理主要依賴于熒光蛋白的特性。通過將目標蛋白與熒光蛋白融合，可以在激光共聚焦顯微鏡的作用下觀察到自標蛋白在細胞內的定位情況，如圖2所示。

亞細胞定位技術在植物啟動子及轉錄因子的分析中較為常見。江舟等人研究了金鐵鎖中WRKY轉錄因子基因PtWRKY1和PtWRKY2的克隆及分析。通過生物信息學方法，發(fā)現這兩個轉錄因子編碼的蛋白質為分泌蛋白，且亞細胞定位于細胞核。它們都含有WRKYGQK保守結構域，與藜麥WRKY轉錄因子具有較高的同源性[8。山草梅的研究團隊克隆并分析了水稻抗?jié)摳€蟲基因OsRAI1。生物信息學分析顯示，OsRAI1編碼一個bHLH轉錄因子，具有親水性，無跨膜結構域，非跨膜蛋白。亞細胞定位結果表明，OsRAI1蛋白在細胞核中表達，與轉錄因子的核定位信號一致，暗示其在細胞核內發(fā)揮作用[]。Kwak等人對水稻OsS1Fa1的跨膜結構域進行了亞細胞定位分析。

結果顯示，OsS1Fa1定位于細胞核膜和細胞質膜，如圖3所示。圖3中，突變和細胞組分分析表明，膜定位結構域決定了OsS1Fa1的亞細胞定位。水稻同源物OsS1Fa2和擬南芥直系同源物AtS1Fa1、AtS1Fa2和AtS1Fa3也表現出 與OsS1Fa1相似的定位模式2%]。

圖3中可以看到，利用亞細胞定位技術，可直接確定目標基因相關表達物質在相關細胞中的位置，從而分析相關蛋白的表達及作用機制。亞細胞定位技術還可以根據基因功能，分析不同基因的表達路徑與作用機制。Wang等人通過亞細胞定位技術揭示了水稻中蔗糖運輸的關鍵調控因子。發(fā)現SEM1蛋白在質膜中定位，對蔗糖從源葉到韌皮部的運輸至關重要。SEM1的功能喪失導致蔗糖運輸受阻，影響光合作用和淀粉積累。Rattanawong等人利用亞細胞定位技術探究了水稻中活性氧的動態(tài)變化、谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)以及谷胱甘肽過氧化物酶的表達和定位，發(fā)現受精后水稻卵細胞內ROS水平高，隨后逐漸下降，GPX1和3的表達上調22。亞細胞定位技術能夠幫助科研人員確定特定基因編碼蛋白在細胞內的精確位置，還可以與基因表達分析相結合，以研究特定基因在不同組織、發(fā)育時期、環(huán)境脅迫下的表達模式。除此之外，還可以用于分析特定基因啟動子的誘導響應性，這對于開發(fā)新型化學誘導啟動子具有重要意義[23]。

2.2酵母單雜交系統(tǒng)在啟動子互作蛋白篩選中的應用

酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)基于真核生物轉錄因子的結構和功能特點，尤其是轉錄因子GAL4的兩個互不干擾的結構域：DNA結合域和轉錄激活域。圖4為酵母單雜交系統(tǒng)，其中，用特異的DNA序列取代了DNA-Gal4結合位點，省略了酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質雜交體。將已知的特定順式作用元件構建到最基本啟動子（minimal promoter， Pmin ）上游，把報告基因連接到 Pmin 下游。編碼待測轉錄因子cDNA與已知酵母轉錄激活結構域融合表達載體被轉化進酵母細胞，如轉錄因子能夠和順式作用元件結合，就能激活 Pmin 啟動子，使報告基因得到表達。

酵母單雜交系統(tǒng)已被廣泛應用于驗證DNA與蛋白質的相互作用，尋找與目的DNA片段相互作用的蛋白質分子，由此找到了許多新的轉錄因子。胡國豪等人通過酵母單雜交系統(tǒng)篩選與CcCas5啟動子結合的轉錄因子，構建了含有CcCas5基因 2600bp 啟動子序列的酵母單雜交啟動子誘餌載體，并確定了3-氨基 ^{-1，2，4-} 三唑的最佳抑制濃度。為進一步篩選與CcCas5啟動子結合的轉錄因子和研究轉錄因子對CcCas5表達的調控作用奠定了基礎[24]。陳一恒等人克隆了葡萄VvCCD1b基因及其啟動子序列，利用酵母單雜交技術，篩選出與VvCCD1b啟動子互作的轉錄因子，包括VvRAP2-4和VvWRKY4，為揭示葡萄類胡蘿卜素代謝調控網絡提供理論依據，其互作蛋白的篩選結果如圖5所示[25]。

圖5中可以看到， VvCCD16 啟動子的初步篩選結果較好，可直接確定與 VvCCD16 啟動子相關的互作蛋白。利用酵母單雜交系統(tǒng)進行啟動子互作蛋白的篩選時，需要建立cDNA文庫。梁浩掩人跟構建了人參根系酵母單雜交和雙雜交cDNA文庫，利用Gateway技術和DSN均一化技術。通過酵母單雜交篩選與人參 PgD14 基因啟動子結合的轉錄因子，以及酵母雙雜交篩選與 Pgpht2-1 蛋白互作的蛋白2。馬曉玲研究了乙烯對油茶種仁中 α- 亞麻酸（ALA）積累的影響，重點探討了關鍵基因CoFAD7的表達調控機制。通過克隆CoFAD7啟動子并構建乙烯誘導的油茶酵母單雜交cDNA文庫，利用酵母單雜交技術篩選與CoFAD7啟動子結合的上游調控因子，其cDNA文庫的構建過程如圖6所示27。

圖6中可以看到，在構建酵母單雜交cDNA文庫時，需要先對目標基因進行篩選鑒定，隨后將其導入酵母中進行培養(yǎng)。當外源蛋白與誘餌DNA成功結合時，會激活報告基因的表達，從而通過表型變化來識別互作蛋白。

3 討論與結論

酵母單雜交和亞細胞定位技術在基因啟動子互作蛋白篩選中的應用，已顯著推進了對水稻抗病基因功能和調控網絡的理解。通過這些技術，研究者能夠精確鑒定與特定啟動子序列相互作用的轉錄因子，進而揭示水稻抗病基因的調控機制。酵母單雜交技術的應用進展顯示，該技術在鑒定特定DNA序列結合蛋白方面具有高靈敏度和操作簡單的特點。通過構建含有特定順式作用元件的誘餌DNA和轉錄因子融合的獵物蛋白，研究者能夠識別與特定DNA序列特異性結合的蛋白質，并篩選和鑒定蛋白質間的相互作用關系。這不僅有助于構建蛋白質相互作用網絡，也為抗病基因的克隆和利用提供了新的策略和方法。亞細胞定位技術的應用則為理解蛋白質功能和信號傳導途徑中的作用提供了重要視角。通過確定蛋白質在細胞內的具體位置，可分析相關蛋白表達及其轉移通路，以此可進一步分析相關抗病基因的抗病作用機制。此外，亞細胞定位技術還能通過定位相關蛋白表達位置，揭示抗病相關蛋白在細胞內的功能區(qū)域。未來，可進一步優(yōu)化酵母單雜交和亞細胞定位技術，提高篩選的準確性和效率。同時，探索將這兩種技術與其他分子生物學技術整合的可能性，以實現更全面的基因功能分析。利用互作蛋白篩選結果，構建更為全面的水稻抗病基因調控網絡，揭示不同抗病基因間的協同作用和調控機制。

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