高溫白化茶樹(shù)品種曜秋的特性和轉(zhuǎn)錄組分析

摘" 要：為探究茶樹(shù)品種曜秋（YQ）高溫白化的特性及其分子調(diào)控機(jī)制，以低溫白化茶樹(shù)品種白葉1號(hào)（BY1H）為對(duì)照，對(duì)茶樹(shù)品種曜秋的春季（YQC）、夏季（YQX）、秋季白化（YQQ）和秋季綠色（YQQL）的一芽二葉新梢，以及白葉1號(hào)的春季白化（BY1HC）、夏季（BY1HX）和秋季（BY1HQ）的新梢為材料進(jìn)行生化成分檢測(cè)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析。生化分析結(jié)果表明，YQQ白化鮮葉游離氨基酸總量和茶多酚含量均低于YQC綠色鮮葉，且游離氨基酸總量差異達(dá)顯著水平；而B(niǎo)Y1HC白化鮮葉游離氨基酸總量顯著高于BY1HQ綠色鮮葉，茶多酚含量顯著低于BY1HQ綠色鮮葉。轉(zhuǎn)錄組主成分分析結(jié)果表明，YQQ白化鮮葉基因表達(dá)信息獨(dú)立于第二象限，明顯與其他樣品不同；聚類(lèi)分析結(jié)果表明，YQQ白化鮮葉基因表達(dá)信息單獨(dú)聚為一類(lèi)；YQQ和BY1HQ的差異表達(dá)基因數(shù)量最多，曜秋在夏末秋初高溫響應(yīng)下新梢葉片白化，微管、細(xì)胞、亞細(xì)胞等結(jié)構(gòu)受到影響，氨基酸、多酚等主要功能性理化成分含量均降低，差異表達(dá)基因富集顯著性最高的3個(gè)功能類(lèi)依次為微管結(jié)合、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分轉(zhuǎn)移和非膜結(jié)合細(xì)胞器，差異表達(dá)基因富集顯著性排名前3的通路依次為類(lèi)黃酮生物合成通路、淀粉和蔗糖代謝通路以及氨基糖和核苷酸糖代謝通路；基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析篩選出高表達(dá)模塊，并對(duì)總連通性K值最高的10個(gè)基因進(jìn)行分析和注釋?zhuān)渲蠺GY042732和未知基因novel.276的功能未能預(yù)測(cè)。本研究結(jié)果為了解茶樹(shù)資源高溫白化提供一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：高溫；白化；茶樹(shù)；生化成分；轉(zhuǎn)錄組；表達(dá)基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Characteristics and Transcriptome Analysis of High Temperature Albino Tea Variety Yaoqiu

HUANG Haitao， DING Yi， NIU Xiaojun， ZHAO Yun， YU Jizhong*

Tea Research Institute， Hangzhou Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou， Zhejiang 310024， China

Abstract： In order to explore the characteristics and molecular regulation mechanism of high temperature albinism of tea variety Yaoqiu （YQ） and its molecular regulation mechanism， the effects of low temperature albinism on the shoot with one bud and two leaves of tea variety YQ in spring （YQC）， summer （YQX）， autumn albinism （YQQ） and autumn green （YQQL）， and Baiye No. 1 （BY1H） in spring albinism （BY1HC）， their biochemical components， and transcriptome sequencing were carried out on the new shoots in summer （BY1HX） and autumn （BY1HQ）. The results of biochemical analysis showed that the total free amino acid content and tea polyphenols content of YQQ albino fresh leaves were lower than those of YQC green fresh leaves， and the difference of total free amino acid content was significant; while the total free amino acid content of BY1HC albino fresh leaves was significantly higher than that of BY1HQ green fresh leaves， and the tea polyphenols content was significantly lower than that of BY1HQ green fresh leaves. Cluster analysis revealed that the gene expression profiles of YQQ albino fresh leaves formed a distinct cluster. The comparison between YQQ and BY1HQ exhibited the highest number of differentially expressed genes. The new shoot leaves of YQ showed an albino phenotype induced by high-temperature stress in late summer and early autumn. This stress affected the structure of microtubules， cells， and subcellular components， leading to a reduction in the contents of amino acids and polyphenols. The three functional categories exhibiting the most significant gene enrichment were microtubule binding， movement of cellular or subcellular components， and non-membrane-bound organelles. Similarly， the top three pathways with the highest significance in gene enrichment were the flavonoid biosynthesis pathway， the starch and sucrose metabolism pathway， and the amino sugar and nucleotide sugar metabolism pathway. Through gene co-expression network analysis， modules exhibiting high expression levels were identified. Subsequently， the ten genes demonstrating the highest total connectivity （K value） were selected for further analysis and annotation. Notably， the functions of genes TGY042732 and the novel gene designated as novel.276 could not be predicted. These findings would provide a theoretical foundation for understanding the phenomenon of albinism in tea resources under conditions of elevated temperature.

Keywords： high temperature; albino; tea plant; biochemical components; transcriptome; expressed genes

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.008

茶樹(shù)新梢葉色變異廣泛，有綠色、白色、黃色、紅色、紫色等。白色和黃色茶樹(shù)新梢表型統(tǒng)稱(chēng)為白化表型，其中新梢白化程度高低主要受溫度和光照影響，其中受溫度影響的類(lèi)型又可根據(jù)白化響應(yīng)溫度不同分為高溫白化型和低溫白化型[1-2]。低溫白化型茶樹(shù)品種有白葉1號(hào)、小雪芽等[3-8]，白葉1號(hào)白化的溫度閾值在20～22 ℃之間，但該溫度僅在春季越冬芽萌發(fā)的初期發(fā)揮作用，其白化現(xiàn)象主要與葉片色素含量的變化及其葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)，葉片白化期葉綠體膜結(jié)構(gòu)發(fā)育發(fā)生障礙，葉綠體退化解體，葉綠素合成受阻，質(zhì)體膜上各種色素蛋白復(fù)合體缺失，導(dǎo)致葉片白化[9-10]；LI等[4]對(duì)低溫白化茶樹(shù)品種小雪芽的表型和轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，小雪芽白化葉片（芽下第三葉）葉綠體發(fā)育異常，表現(xiàn)為體積膨脹變大，出現(xiàn)囊狀空泡，基粒片層和類(lèi)囊體膜結(jié)構(gòu)發(fā)育受阻，光合色素葉綠素類(lèi)和類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)含量顯著減少，氨基酸含量顯著增加，茶多酚、咖啡因、總兒茶素類(lèi)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）含量以及酚氨比值顯著降低，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明其白化葉片的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因以及原葉綠素酸酯還原酶基因表達(dá)受到顯著抑制，導(dǎo)致小雪芽白化葉片的葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量較低。茶樹(shù)高溫白化型是指氣溫達(dá)到25 ℃以上或持續(xù)高溫時(shí)的芽葉白化，后隨氣溫下降逐步返綠，但綜合性狀不理想，因此，高溫白化型茶樹(shù)少有相關(guān)研究[1]。高溫白化種質(zhì)在其他作物上也僅有少量研究，李軍等[11]報(bào)道的粳稻高溫白化復(fù)綠突變體tcd52在高溫（gt;24 ℃）條件下，二葉期葉色呈白色失綠，三葉期開(kāi)始復(fù)綠，四葉期后與野生型無(wú)明顯差異；而在低溫（20 ℃）條件下，tcd52突變體苗期葉色與野生型一致呈綠色，無(wú)白化現(xiàn)象。

茶樹(shù)品種曜秋因高溫白化而得名，是從浙江省杭州市余杭區(qū)瓶窯鎮(zhèn)鳩坑群體種自然實(shí)生后代中采用單株選擇的方法系統(tǒng)選育而成的特色茶樹(shù)品種，春季新梢為黃綠色、夏季新梢葉色為紫綠色，夏末至秋初新梢白化，白化葉片不返綠，凋亡脫落，秋季后期繼續(xù)生長(zhǎng)的頂梢呈綠色，長(zhǎng)勢(shì)較弱，是一種較好的高溫白化茶樹(shù)種質(zhì)資源。本研究擬以低溫白化茶樹(shù)品種白葉1號(hào)為對(duì)照品種，對(duì)曜秋不同季節(jié)芽葉的理化性狀進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析其高溫白化時(shí)的主要成分和基因表達(dá)變化。

1" 材料與方法

1.1" 材料

本研究于2022年度在杭州市余杭區(qū)瓶窯鎮(zhèn)杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院茶葉研究所資源圃（30°23?E，119°53?N）選取2個(gè)茶樹(shù)品種，試驗(yàn)組為高溫白化茶樹(shù)品種曜秋（YQ），分別取其春季（YQC）一芽二葉、夏季（YQX）一芽二葉、秋季白化（YQQ）一芽二葉和秋初返綠（YQQL）一芽二葉作為研究材料；對(duì)照組為低溫白化茶樹(shù)品種白葉1號(hào)（BY1H），分別取其春季白化（BY1HC）一芽二葉、夏季（BY1HX）一芽二葉和秋季（BY1HQ）一芽二葉，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，用錫紙包裹后迅速投入液氮中速凍，–80 ℃低溫保存?zhèn)溆茫糜诤罄m(xù)生理生化指標(biāo)測(cè)定和總RNA提取。

1.2" 方法

1.2.1" 水浸出物含量測(cè)定" 采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《茶水浸出物測(cè)定》GB/T 8305—2013的方法檢測(cè)樣品水浸出物含量。

1.2.2" 茶多酚含量檢測(cè)" 采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》GB/T 8313—2018檢測(cè)樣品茶多酚含量。

1.2.3" 兒茶素、咖啡堿和沒(méi)食子酸檢測(cè)" 采用HPLC法檢測(cè)，兒茶素類(lèi)包括沒(méi)食子兒茶素（GC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG）和兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG），儀器為Agilent 1100，色譜柱為Hypsial ODS的C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相A為2%乙酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL，0～12 min內(nèi)流動(dòng)相A由93.5%變?yōu)?2.0%，12～ 16 min時(shí)流動(dòng)相A由92.0%變?yōu)?5.0%，16～20 min時(shí)流動(dòng)相A由85.0%變?yōu)?5.0%，20～30 min回到初始狀態(tài)即流動(dòng)相A為93.5%，平衡5 min[12]。

1.2.4" 氨基酸組成檢測(cè)" 采用領(lǐng)苯二酚（OPA）柱前衍生結(jié)合高效液相色譜（HPLC）熒光檢測(cè)法對(duì)氨基酸組分進(jìn)行檢測(cè)，包括天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、絲氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、組氨酸（His）、蘇氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、γ-氨基丁酸（Gaba）、茶氨酸（Thea）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）。柱前衍生方法：先配制OPA溶液，方法為9 mL硼酸緩沖液（0.4 mol/L，pH 10.2）+0.01 g OPA+ 1 mL乙腈+100 μL巰基丙酸，混勻后過(guò)0.22 μm膜。將配制完成的OPA溶液50 μL與0.4 mol/L硼酸緩沖液（pH 10.2）500 μL、450 μL超純水以及5 μL待測(cè)茶樣溶液，混勻后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件為Zorbax EclipseAAA色譜柱（3.5 μm， 4.6 mm×150 mm），柱溫箱40 ℃，發(fā)射波長(zhǎng)340 nm，接收波長(zhǎng)450 nm，進(jìn)樣體積10 μL，流速1.5 mL/min，流動(dòng)相A為40 mmol/L Na2HPO4緩沖液（pH 7.8），流動(dòng)相B為乙腈∶甲醇∶超純水=45∶45∶10（V/V/V）。洗脫梯度為0～18 min，流動(dòng)相B由5%（V）線性增加至60%（V），18～32 min流動(dòng)相B由60%（V）線性增加至100%（V），32～37 min流動(dòng)相B降至5%（V），并保持7 min[13]。

1.2.5" 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析" 基于Illumina技術(shù)測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序（paired-end）的方法，分別對(duì)曜秋春季（YQC）與白葉1號(hào)春季白化（BY1HC）的一芽二葉新梢，曜秋夏季（YQX）與白葉1號(hào)夏季（BY1HX）的一芽二葉新梢，曜秋秋季白化（YQQ）與白葉1號(hào)秋季（BY1HQ）的一芽二葉新梢，曜秋秋季（YQQ）白化與曜秋秋季綠色（YQQL）的一芽二葉新梢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，原始測(cè)定數(shù)據(jù)（raw reads）進(jìn)行過(guò)濾處理后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads），使用HISAT2將clean reads與茶樹(shù)[14]的參考基因組進(jìn)行比對(duì)。使用StringTie軟件進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本組裝，采用DESeq2[15-16]根據(jù)|log2（fold change）|≥1且padj≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，差異基因的表達(dá)豐度用FPKM值（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）表示，采用clusterProfiler軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO（gene ontology）功能富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，采用軟閾值為6進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，使用相異度對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行層次聚類(lèi)，并利用基因總連通性K值進(jìn)行核心基因篩選。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

使用JMP 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括方差分析（ANOVA）和主成分分析（PCA）。測(cè)量的理化成分含量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，采用t檢驗(yàn)確定不同樣品之間在5%的顯著性水平，P≤0.05且|log2（fold change）|≥1視為顯著差異表達(dá)的指標(biāo)。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 曜秋和白葉1號(hào)茶樹(shù)品種特征特性比較

曜秋原始編號(hào)為J1615，來(lái)自浙江余杭，灌木型，半開(kāi)張，生長(zhǎng)勢(shì)中等，萌發(fā)中等，茸毛少，春季新梢葉色為黃綠色，夏季初期新梢為紫綠，夏季中后期至秋初新梢白化（圖1），秋季后期新梢呈綠色，成熟葉片為中等橢圓、葉長(zhǎng)7.8 cm、葉寬3.2 cm、淺綠、上表皮隆起、葉緣波狀、葉身平、葉齒密淺銳、葉尖漸尖、葉基楔形（表1）。按照規(guī)范2～3 d觀測(cè)1次，以觀測(cè)到變化的日期為其起始和轉(zhuǎn)綠日期；最高氣溫高于35 ℃和低于30 ℃的日期來(lái)自杭州市氣象局資料。根據(jù)2020—2023年的觀測(cè)（表2），曜秋在夏季氣溫上升至33～35 ℃出現(xiàn)明顯的白化現(xiàn)象，且白化程度隨著溫度的升高而增加，莖、葉、脈及腋芽均呈白化狀，秋初溫度降至30 ℃以下，新生長(zhǎng)的新梢芽葉顏色轉(zhuǎn)為正常綠色（圖2B），原白化葉片逐漸成熟、凋亡和脫落（圖2C）。

白葉1號(hào)又名安吉白茶，原產(chǎn)浙江安吉，灌木型，半開(kāi)張，生長(zhǎng)勢(shì)中等，茸毛少，春季新梢葉色呈玉白色（圖1），葉脈淡綠色，夏秋季新梢均為綠色，成熟葉片為長(zhǎng)橢圓、葉長(zhǎng)8.8 cm、葉寬3.4 cm、綠色、上表皮平、葉緣平、葉身平、葉齒稀淺鈍、葉尖漸尖、葉基楔形。白葉1號(hào)茶樹(shù)新梢在春季氣溫上升至20～22 ℃階段性出現(xiàn)白化現(xiàn)象，至春末，白化葉片逐漸成熟并轉(zhuǎn)綠，早期白化度較高的葉片逐漸脫落，后期白化度低的葉片形成綠白斑駁狀（圖2A），夏季和秋季新生長(zhǎng)新梢的顏色均為正常的綠色。

2.2" 曜秋和白葉1號(hào)茶樹(shù)品種的生化組成比較

茶多酚、氨基酸、咖啡堿、兒茶素與茶葉風(fēng)味品質(zhì)緊密相關(guān)，是茶葉風(fēng)味化學(xué)成分的主體。2個(gè)品種不同季節(jié)的一芽二葉的水浸出物、茶多酚、氨基酸、咖啡堿和兒茶素含量見(jiàn)表3。2個(gè)品種的水浸出物含量、茶多酚含量均在夏季最高，春秋較低；氨基酸總量均為春季較高，夏秋季較低；咖啡堿含量春季、夏季較高，而秋季較低；曜秋品種的水浸出物含量在不同季節(jié)均低于白葉1號(hào)；曜秋品種春季的茶多酚含量高于白葉1號(hào)，秋季茶多酚含量則低于白葉1號(hào)；曜秋品種春季的氨基酸含量低于白葉1號(hào)，夏季和秋季的氨基酸含量均高于白葉1號(hào)；曜秋品種春季和夏季的咖啡堿含量均低于白葉1號(hào)；曜秋品種春季、秋季的GC、EGC、C和EC等簡(jiǎn)單兒茶素含量均低于同期的白葉1號(hào)，復(fù)雜兒茶素?zé)o明顯規(guī)律。曜秋品種秋季白化鮮葉較春季綠色鮮葉的水浸出物、咖啡堿、EGC、EGCG、GCG、CG等含量，以及游離氨基酸總量等均顯著降低，而ECG含量顯著升高。白葉1號(hào)品種春季白化鮮葉較秋季綠色鮮葉茶多酚、EGCG含量顯著降低，而水浸出物、咖啡堿、GC、EGC、C、EC、CG等含量，以及游離氨基酸總量均顯著增升高。游離氨基酸總量顯著增加和茶多酚含量顯著降低是白葉1號(hào)低溫白化產(chǎn)生的一個(gè)重要代謝特性，而曜秋高溫白化鮮葉的游離氨基酸總量并未顯著增加，這可能與2個(gè)茶樹(shù)品種不同的白化機(jī)制相關(guān)。

氨基酸組成對(duì)于茶湯鮮爽度、滋味品質(zhì)也具有重要影響。2個(gè)品種春季和秋季鮮葉的游離氨基酸含量見(jiàn)表4，不同樣品間天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、茶氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸和精氨酸含量差異達(dá)到顯著水平。曜秋春季鮮葉的天冬氨酸、谷氨酸、茶氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸含量顯著低于白葉1號(hào)品種，曜秋秋季鮮葉的茶氨酸、γ-氨基丁酸含量顯著低于白葉1號(hào)，而天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸含量顯著高于白葉1號(hào)。曜秋秋季白化鮮葉樣品相較于其春季綠色鮮葉樣品，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺含量顯著升高，絲氨酸和茶氨酸含量顯著降低。白葉1號(hào)春季白化鮮葉樣品相較于其秋季綠色鮮葉樣品，天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、茶氨酸、丙氨酸和精氨酸含量顯著升高，而γ-氨基丁酸含量顯著降低。綜上，天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺3種氨基酸在品種白化過(guò)程中的變化趨勢(shì)一致，而絲氨酸和茶氨酸2種氨基酸在品種白化過(guò)程中的變化趨勢(shì)相反，這可能與2個(gè)茶樹(shù)品種不同的白化機(jī)制相關(guān)。

2.3" 曜秋和白葉1號(hào)茶樹(shù)品種轉(zhuǎn)錄組比較

2.3.1" 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）質(zhì)量分析" 曜秋和白葉1號(hào)各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共構(gòu)建21個(gè)cDNA文庫(kù)，基于Illumina Hiseq TM4000測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表5。經(jīng)過(guò)濾篩選后共獲得144.85 Gb的clean data，每個(gè)樣品獲得6.9 Gb左右的clean data，占比均超過(guò)98%，Q30（一個(gè)堿基的識(shí)別可靠性等于99.9%）的占比超過(guò)91.00%，GC含量（鳥(niǎo)嘌呤和胞密啶的摩爾百分比）均在43.00%以上。說(shuō)明試驗(yàn)取樣合理，樣品RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

2.3.2" 樣品主成分分析" 為了進(jìn)一步了解2個(gè)茶樹(shù)品種白化現(xiàn)象的區(qū)別，對(duì)樣品進(jìn)行了主成分分析（圖3）。結(jié)果表明，曜秋品種春季、夏季、秋季鮮葉基因表達(dá)信息集中在第三象限，曜秋秋季白化鮮葉基因表達(dá)信息獨(dú)立在第二象限；而白葉1號(hào)品種春季、夏季、秋季鮮葉基因表達(dá)信息主要集中在第一、四象限。曜秋和白葉1號(hào)2個(gè)品種不同季節(jié)的鮮葉基因表達(dá)信息差異較大，曜秋秋季白化的鮮葉與其春季、夏季和秋初返綠的鮮葉基因表達(dá)信息之間差異明顯，而白葉1號(hào)春季白化、夏季和秋季的鮮葉信息之間差異較小。

2.3.3" 基因表達(dá)分析" 通過(guò)差異基因表達(dá)量分析（圖4），曜秋春季鮮葉和白葉1號(hào)春季鮮葉之間以|log2（fold change）|≥1且padj≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出7288個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），包含3732個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和3556個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；曜秋夏季鮮葉和白葉1號(hào)夏季鮮葉之間篩選出7793個(gè)差異表達(dá)基因，包含4137個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和3656個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；曜秋秋季鮮葉和白葉1號(hào)秋季鮮葉之間篩選出14 982個(gè)差異表達(dá)基因，包含7025個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和7957個(gè)下調(diào)表達(dá)基因；曜秋秋季高溫白化鮮葉和曜秋秋季新生綠色鮮葉樣品之間篩選出7797個(gè)差異表達(dá)基因，包含2865個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和4932個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。其中曜秋茶樹(shù)秋季白化新梢和白葉1號(hào)秋季新梢的差異表達(dá)基因最多，遠(yuǎn)超其他時(shí)期的差異表達(dá)基因。

2.3.4" 差異基因聚類(lèi)分析" 通過(guò)差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析（圖5），曜秋秋季白化新梢表達(dá)基因與白葉1號(hào)春季白化新梢相比區(qū)別較大，與其他季節(jié)的新梢表達(dá)基因也具有較大的差異。

2.3.5" 功能和代謝通路富集分析" 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集，曜秋春季鮮葉和白葉1號(hào)春季鮮葉之間，富集顯著性最高的3個(gè)功能類(lèi)依次為類(lèi)囊體、RNA-DNA雜交核糖核酸酶活性和光合作用，而富集差異基因數(shù)最多的功能類(lèi)則為RNA催化活性類(lèi)（78個(gè)）（圖6A）。曜秋夏季鮮葉和白葉1號(hào)夏季鮮葉之間，富集顯著性最高的3個(gè)功能類(lèi)依次為RNA-DNA雜交核糖核酸酶活性、過(guò)氧化物酶體膜和過(guò)氧化物酶體組織類(lèi)，而富集差異基因數(shù)最多的功能類(lèi)則為蛋白質(zhì)二聚化活性類(lèi)（107個(gè)）（圖6B）。曜秋秋季鮮葉和白葉1號(hào)秋季鮮葉之間，富集顯著性最高的3個(gè)功能類(lèi)依次為微管結(jié)合、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分轉(zhuǎn)移和非膜結(jié)合細(xì)胞器，而富集差異基因數(shù)最多的功能類(lèi)則為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（219個(gè)）（圖6C）。曜秋秋季白化鮮葉和曜秋秋季白化后新生綠葉之間，富集顯著性最高的3個(gè)功能類(lèi)依次為轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移?；?、細(xì)胞或亞細(xì)胞組分轉(zhuǎn)移和染色體部分，而富集差異基因數(shù)最多的功能類(lèi)則為轉(zhuǎn)移己糖基轉(zhuǎn)移酶活性類(lèi)（167個(gè)）（圖6D）。

KEGG通路富集分析顯示，曜秋春季鮮葉和白葉1號(hào)春季鮮葉之間，富集顯著性排名前3的通路依次為光合作用-天線蛋白，光合作用和光合生物的碳固定，分別富集到21、30、62個(gè)DEGs（圖7A）。曜秋夏季鮮葉和白葉1號(hào)夏季鮮葉之間，富集顯著性排名前3的通路依次為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、泛酸和CoA生物合成和2-氧代羧酸代謝通路，分別富集到21、22、35個(gè)DEGs（圖7B）。曜秋秋季鮮葉和白葉1號(hào)秋季鮮葉之間，富集顯著性排名前3的通路依次為類(lèi)黃酮生物合成、淀粉和蔗糖代謝以及氨基糖和核苷酸糖代謝，分別富集到47、121、109個(gè)DEGs（圖7C）。曜秋秋季白化鮮葉和曜秋秋初新生綠色鮮葉之間，富集顯著性排名前3的通路依次為類(lèi)黃酮生物合成、苯丙素類(lèi)生物合成和脂肪酸延伸，分別富集到35、76、23個(gè)DEGs（圖7D）。

2.3.6" 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析" 軟閾值設(shè)定為6，篩選基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并建立基因表達(dá)模塊層次聚類(lèi)樹(shù)以及模塊基因聚類(lèi)熱圖（圖8），本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠松石色模塊基因高表達(dá)。

對(duì)綠松石色模塊中總連通性K值最高的10個(gè)基因進(jìn)行分析和注釋?zhuān)ū?），其中TGY042732和未知基因novel.276的功能未能預(yù)測(cè)，其余基因功能多數(shù)與葉綠體相關(guān)，這些在基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置的新基因?yàn)榻窈筮M(jìn)一步探索茶樹(shù)高溫白化機(jī)理提供重要參考。

3" 討論

3.1" 植物溫敏白化的表型和生理生化特征差異

劉鈺龍等[17]報(bào)道一株水稻溫敏型白化突變體tsa1在低溫20～24 ℃下明顯白化，葉綠素a和類(lèi)胡蘿卜素的含量顯著降低，突變體白化組織中葉綠體發(fā)育停滯，出現(xiàn)了大量小型異常葉綠體結(jié)構(gòu)，而高溫28～32 ℃下突變體外觀及光合色素含量趨于正常。白葉1號(hào)為低溫白化茶樹(shù)品種，其越冬芽萌發(fā)初始葉片為綠色，溫度升至20～22 ℃白化啟動(dòng)，白化葉片的葉面為白色，葉脈為綠色，早期白化度較高的葉片后期會(huì)脫落，而白化度較低的葉片在春季末期形成白-綠斑駁形態(tài)，部分葉片的此種形態(tài)可持續(xù)全年，夏季和秋季新生的新梢葉片均為正常綠色。成浩等[18]研究發(fā)現(xiàn)白葉1號(hào)全白期間葉片中不存在P700葉綠素a蛋白復(fù)合體與捕光葉綠素a/b蛋白質(zhì)復(fù)合體，但含有很少量的捕光葉綠素a/b蛋白質(zhì)復(fù)合體的脫輔基蛋白和少量的游離色素，認(rèn)為捕光葉綠素a/b蛋白質(zhì)復(fù)合體的缺失影響到葉綠體基粒結(jié)構(gòu)的形成是白葉1號(hào)白化重要原因之一。以上研究均表明葉綠體發(fā)育受阻和結(jié)構(gòu)異常是植物低溫白化表型的重要原因。

綠體結(jié)構(gòu)。該研究表明葉綠體結(jié)構(gòu)降解是植物高溫白化表型的主要原因。

本研究中的材料曜秋為高溫白化茶樹(shù)品種，其春季、夏季初期葉片為正常綠色或紫綠色，溫度為33～35 ℃啟動(dòng)白化，白化葉片的葉面、葉脈、腋芽均呈現(xiàn)黃色，隨著溫度升高白化程度可增加至乳白色，溫度降低至30 ℃以下時(shí)，白化葉片逐漸凋亡，此后新梢繼續(xù)生長(zhǎng)的葉片為正常綠色。曜秋高溫白化生物過(guò)程與tcd52類(lèi)似，結(jié)合曜秋轉(zhuǎn)錄組基因注釋?zhuān)茰y(cè)曜秋高溫白化也是與葉綠體結(jié)構(gòu)降解有關(guān)。

3.2" 曜秋秋季白化新梢基因表達(dá)機(jī)制

王新超等[9]對(duì)白葉1號(hào)正常葉片和白化葉片差異表達(dá)的基因進(jìn)行了比較和功能推測(cè)，發(fā)現(xiàn)參與葉綠體/葉綠素合成的調(diào)控基因（A18-4、C3），參與信號(hào)物質(zhì)合成有關(guān)基因（G11-2、C3）等與白葉1號(hào)階段性白化有關(guān)。本研究表明曜秋秋季白化新梢表達(dá)基因與白葉1號(hào)春季白化新梢相比

區(qū)別較大，與曜秋其他季節(jié)的新梢表達(dá)基因也具有較大的差異，其中曜秋秋季高溫白化鮮葉與曜秋秋季新生綠色鮮葉相比下調(diào)表達(dá)基因較多，與白葉1號(hào)秋季綠色新梢相比也是下調(diào)表達(dá)基因較多，且差異表達(dá)基因數(shù)量最多，高達(dá)14 982個(gè)差異表達(dá)基因，表明曜秋秋季白化具有較為復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制。

LI等[19]對(duì)白葉1號(hào)不同階段的代謝和轉(zhuǎn)錄研究表明，白葉1號(hào)在WII階段（白化后期）的差異代謝產(chǎn)物主要參與光合生物的碳固定、苯丙素類(lèi)化合物的生物合成、半乳糖代謝、類(lèi)黃酮的生物合成以及精氨酸和脯氨酸的代謝。而在本研究中，曜秋秋季白化鮮葉和曜秋秋初新生綠色鮮葉之間，富集顯著性排名前3的通路依次為類(lèi)黃酮生物合成，苯丙素類(lèi)生物合成和脂肪酸延伸，主要與類(lèi)黃酮生物合成，苯丙素類(lèi)生物合成和脂肪酸延伸等途徑有關(guān)。推測(cè)曜秋高溫白化途徑與白葉1號(hào)低溫白化后期代謝途徑具有一定的共性。

同時(shí)，通過(guò)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析篩選的處于核心位置的新基因?yàn)榻窈筮M(jìn)一步開(kāi)展茶樹(shù)高溫白化機(jī)理研究提供重要參考。

4" 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)曜秋春季綠色、夏季綠色、秋季白化和秋季綠色，白葉1號(hào)春季白化、夏季綠色、秋季綠色等的鮮葉為材料通過(guò)表型、理化組成和轉(zhuǎn)錄組等聯(lián)合分析解析了高溫白化茶樹(shù)曜秋的白化機(jī)制。曜秋在夏末秋初高溫（33～35 ℃）響應(yīng)下新梢葉片白化，溫度降低至30 ℃左右時(shí)，白化葉片啟動(dòng)凋亡，而繼續(xù)生長(zhǎng)的新梢為正常綠色，與白葉1號(hào)低溫白化新梢氨基酸含量顯著增加不同，曜秋高溫白化新梢游離氨基酸總量反而較春季綠色新梢顯著降低。曜秋秋季白化新梢基因表達(dá)信息在主成分分析與聚類(lèi)分析中均表現(xiàn)出獨(dú)特性，通過(guò)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析篩選出10個(gè)核心基因，包括TGY042732、TGY109858、TGY046880、TGY107449、TGY014623、TGY096457、novel.276、TGY123290、TGY050175和TGY088252。研究結(jié)果為今后進(jìn)一步開(kāi)展茶樹(shù)資源的高溫白化研究奠定基礎(chǔ)。

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