橡膠樹熱誘導(dǎo)啟動子的篩選及初步鑒定

摘""要：基因工程技術(shù)是縮短作物育種周期、定向培育農(nóng)作物新品種的有效途徑，也是鑒定植物基因功能的重要手段。誘導(dǎo)型啟動子是基因工程研究的重要工具，其中熱誘導(dǎo)啟動子由于其載體結(jié)構(gòu)簡單，誘導(dǎo)方便，成本低，在植物分子生物學(xué)領(lǐng)域廣泛使用。目前，橡膠樹基因工程技術(shù)發(fā)展相對滯后，目的基因功能研究通常一般使用組成型啟動子，限制了相關(guān)工作的開展。本研究對橡膠樹愈傷組織進(jìn)行熱處理，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選出8個熱誘導(dǎo)前不表達(dá)或幾乎不表達(dá)，但熱誘導(dǎo)后表達(dá)量較高的基因；經(jīng)過熱誘導(dǎo)表達(dá)量變化和特異性評價，鑒定出2個特異性響應(yīng)熱處理的候選基因HbHSP17.6B和HbHSP17.6C；進(jìn)一步通過巢式PCR克隆出HbHSP17.6C起始密碼子上游1962"nt的啟動子序列，確認(rèn)其由核心轉(zhuǎn)錄區(qū)和多個順式作用元件等組成，命名為pHbHSP17.6C。分析該啟動子可用于橡膠樹及其他近源植物基因功能研究，有望為相關(guān)研究提供新的工具選擇。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；愈傷組織；熱誘導(dǎo)啟動子中圖分類號：S794.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Screening"and"Prelininary"Identification"of"a"Heat-Inducible"Promoter"of"Hevea

WANG"Wenping1，"LUO"Xiaomei1，"CAO"Jie1，2，"ZHANG"Shengmin1，2，"QI"Jiyan1，2，"ZHANG"Yi1，2*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry"（Agriculture"and"Rural"College，"Rural"Revitalization"College），"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Sanya"Institute"of"Breeding"and"Multiplication，"Hainan"University，"Sanya，"Hainan"572025，"China

Abstract："Genetic"engineering"technology"serves"as"an"effective"method"to"shorten"crop"breeding"cycles，"specifically"cultivate"new"crop"varieties，"and"identify"plant"gene"functions."Induced"promoters"are"important"tools"in"genetic"engineering"research，"among"which"thermally"inducible"promoters"being"extensively"utilized"in"plant"molecular"biology"owing"to"the"simple"vector"structure，"convenient"induction，"and"low"cost."At"present，"the"development"of"genetic"engineering"technology"in"rubber"trees"lags"behind."Functional"studies"of"target"genes"typically"usenbsp;constitutive"promoters，"which"limits"the"progress"of"related"work."In"this"study，"rubber"tree"calli"were"treated"by"heat."Through"transcriptome"sequencing"analysis，"identified"eight"genes"that"were"non-expressed"or"minimally"expressed，"but"exhibited"high"level"expression"after"heat"induction"in"calli."After"heat"induced"expression"changes"and"specificity"evaluation，"two"candidate"genes"HbHSP17.6C"and"HbHSP17.6B"that"specifically"respond"to"heat"treatment"were"identified."Further"through"nested"PCR，"we"cloned"the"1962"nt"sequence"upstream"of"the"start"codon"of"the"heat"shock"protein"gene"HbHSP17.6C."Confirm"that"it"is"composed"of"a"core"transcription"region"and"multiple"cis"acting"elements，"and"is"named"pHbHSP17.6C."It"is"inferred"that"this"promoter"could"be"used"for"gene"function"research"in"rubber"trees"and"other"closely"related"plants，"which"is"expected"to"provide"new"tool"options"for"related"research.

Keywords："rubber"tree;"callus;"heat-inducible"promoter

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.001

天然橡膠是戰(zhàn)略性工業(yè)原料[1]，但我國天然橡膠自給率常年低于15%。橡膠樹是天然橡膠的主要來源，為熱帶喬木，傳統(tǒng)雜交育種周期需要21～30"a[2]。近年來，隨著分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，特別是橡膠樹基因組學(xué)方面的研究，天然橡膠生物合成通路的解析已經(jīng)比較清楚[3]，但其產(chǎn)量形成機制、主要病害的致病機理、抗寒及抗風(fēng)分子機制等方面尚不明確。

啟動子是植物基因工程技術(shù)中用來驅(qū)動目標(biāo)基因表達(dá)的關(guān)鍵工具，不同類型啟動子的作用機制不同。其中，誘導(dǎo)型啟動子只能在誘導(dǎo)條件滿足時，才能誘導(dǎo)外源基因高效表達(dá)，因此在基因功能鑒定和分子育種方面具有重要意義[4]。常見的誘導(dǎo)型啟動子類型主要有：化學(xué)誘導(dǎo)型、物理誘導(dǎo)型、生物脅迫誘導(dǎo)型等[5]。橡膠樹是典型的熱帶植物，耐熱性較好，而熱誘導(dǎo)啟動子具有系統(tǒng)簡潔、載體易構(gòu)建、誘導(dǎo)條件容易滿足等優(yōu)點[6]，因此該類啟動子在橡膠樹基因工程研究中有良好的應(yīng)用前景。

目前，在橡膠樹基因工程研究中，通常使用花椰菜花葉病毒的35S啟動子和橡膠樹內(nèi)源的組織特異性啟動子來開展相關(guān)工作，未見誘導(dǎo)性啟動子的應(yīng)用報道[7-9]。因此，本研究開展熱處理條件下橡膠樹差異基因表達(dá)分析和熱誘導(dǎo)啟動子的篩選、鑒定工作，以期為相關(guān)研究提供新的工具選擇。

1""材料與方法

1.1""材料

供試植物材料為實驗室繼代培養(yǎng)的橡膠樹愈傷組織細(xì)胞系073、084、340和363，培養(yǎng)條件為27"℃暗培養(yǎng)。這4個細(xì)胞系來自于橡膠樹品種熱研7-33-97不同內(nèi)珠被的不同部位，其體胚發(fā)生效率高，是用于橡膠樹轉(zhuǎn)基因操作的優(yōu)良受體。參照LUO等[10]的方法，制備橡膠樹愈傷組織增殖培養(yǎng)基以及農(nóng)桿菌浸染相關(guān)的脫毒培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105（攜帶有pCAMBIA2300質(zhì)粒）。

RNAprep"Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Prime"STAR"HS"DNA"Polymerase購自寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司，2×ES"Taq"MatserMix（Dye）購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Hiscript"III"1st"Strand"cDNA"Synthesis"Kit（+gDNA"wiper）、實時熒光定量PCR試劑盒ChamQ"Universal"SYBR"qPCR"Master"Mix、Q711和FastPure"Gel"DNA"Extraction"Mini"Kit產(chǎn)物純化試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，pEASY-Blunt"Zero"Cloning"Kit購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2""方法

1.2.1""愈傷組織熱處理條件篩選""將繼代培養(yǎng)1"周后的橡膠樹4個細(xì)胞系的愈傷組織于42"℃進(jìn)行暗培養(yǎng)熱處理，時間設(shè)3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36"h。處理完畢進(jìn)行繼代培養(yǎng)，第3周后觀察其生長狀態(tài)是否正常。

1.2.2""橡膠樹愈傷組織中熱激活表達(dá)基因的篩選""將增殖培養(yǎng)14"d后的橡膠樹4個愈傷組織細(xì)胞系分別在42"℃條件下處理3"h，收集未處理及熱處理愈傷組織，提取RNA并測序，將未處理和熱處理后的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，篩選出未處理愈傷中不表達(dá)且熱處理后激活表達(dá)的基因作為候選基因。

1.2.3""候選基因表達(dá)特異性分析""將增殖培養(yǎng)14"d后的橡膠樹4個愈傷組織細(xì)胞系，分別在42"℃條件下處理2"h，37"℃條件下處理2"h；將預(yù)培養(yǎng)（無Ag+）14"d后的橡膠樹4個愈傷組織細(xì)胞系進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染處理，浸染方法參照LECLERCQ等[11]的報道；侵染后在20"℃條件下共培養(yǎng)3"d，然后進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，21"d后進(jìn)行篩選培養(yǎng)。分別收集以上不同處理階段的橡膠樹愈傷組織，液氮速凍后于–80"℃暫存，用于RNA提取，通過實時熒光定量PCR檢測候選基因的表達(dá)特性。

1.2.4""愈傷組織RNA的提取及測序""取1～2"g不同處理的橡膠樹愈傷組織，液氮研磨后，參照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，使用Infinite"200"pro檢測RNA的濃度和純度。將其中未處理及42"℃處理3"h后的4個細(xì)胞系的RNA樣品送北京格致博雅生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測序。

1.2.5""實時熒光定量PCR""將1.2.2中得到的候選基因的氨基酸序列，在公共數(shù)據(jù)庫Tair（https：//www.arabidopsis.org/）中進(jìn)行BLASTP檢索，參考結(jié)果中排名第一位的擬南芥基因的名稱，對這些熱激活表達(dá)的基因命名。根據(jù)熱研7-33-97基因組注釋信息，檢索出這些候選基因的cDNA序列，設(shè)計實時熒光定量PCR引物（表1）。分別取1"μg不同樣品的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA稀釋50倍，使用實時熒光定量PCR試劑盒對熱激活表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)豐度檢測。實時熒光定量PCR程序采用諾唯贊標(biāo)準(zhǔn)程序[10]，反應(yīng)結(jié)束后，采用2?ΔΔCt值法計算各個不同處理階段樣品的相對表達(dá)量。

1.2.6""熱誘導(dǎo)啟動子克隆""根據(jù)熒光定量PCR驗證結(jié)果，篩選出特異性好、熱處理誘導(dǎo)下表達(dá)量高的目標(biāo)基因。以這些基因的cDNA序列對橡膠樹熱研7-33-97基因組進(jìn)行本地BLASTN比對，提取其起始密碼子上游2000"nt序列作為其啟動子序列。根據(jù)該序列設(shè)計巢式PCR引物（表1），以基因組DNA為模板，進(jìn)行啟動子的PCR擴增。擴增得到的第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測后送至廣州生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.7""熱誘導(dǎo)啟動子序列驗證及分析""以特異性應(yīng)答熱處理表達(dá)基因的cDNA序列，設(shè)計引物（表1）擴增出熱激活特異性表達(dá)基因的cDNA全長。使用2×ES"Taq"Matser"Mix（Dye），以42"℃"3"h熱處理過后084細(xì)胞系的cDNA作為模板，擴增得到PCR產(chǎn)物的檢測、純化、測序同1.2.5。根據(jù)熱激活特異性表達(dá)基因的gDNA序列設(shè)計跨啟動子和外顯子克隆基因全長的引物（表1）。使用100"ng熱研7-33-97的gDNA作為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物的檢測、純化、測序同1.2.5。使用PlantCare（https：//www.plantcare.co.uk/）在線分析工具對啟動子序列進(jìn)行順式作用元件檢索分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""熱處理激活表達(dá)基因的篩選

研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹愈傷組織在42"℃進(jìn)行不同時間處理后，發(fā)現(xiàn)熱處理36"h以內(nèi)，愈傷組織生長情況無明顯差異，因此選擇3"h作為后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序的熱處理時間。將4個愈傷組織細(xì)胞

系42"℃處理3"h的所有基因的FPKM值進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，未處理不表達(dá)或幾乎不表達(dá)而熱處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因并不多。HbHSP17.6C、HbHSP17.6B、EVM0006300、EVM0006899、EVM0017927、EVM0020623、EVM0012326和EVM0003506是排名靠前的8個基因，4個愈傷組織中的結(jié)果基本一致。其中，HbHSP17.6C和HbHSP17.6B基因未處理和熱處理過后表達(dá)量變化最大，其他6個基因熱處理后的表達(dá)量并不高（圖1）。

克隆熱誘導(dǎo)啟動子的最終目的是應(yīng)用其作為橡膠樹基因工程技術(shù)中控制目的基因表達(dá)的分子開關(guān)。理想的熱啟動子在愈傷組織中應(yīng)該特異性響應(yīng)熱激活，愈傷組織繼代培養(yǎng)過程（有/無Ag+），以及轉(zhuǎn)基因過程中的各種環(huán)境變化都不應(yīng)該激活該啟動子。本研究對愈傷組織進(jìn)行了多種條件的處理，包括溫度變化、不同類型的培養(yǎng)基、農(nóng)桿菌浸染、脫毒培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)等。對上述8個熱激活表達(dá)的候選基因進(jìn)行RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，只有HbHSP17.6C（圖2）和HbHSP17.6B在愈傷中的表達(dá)特異性響應(yīng)熱激活，其他6個候選基因，愈傷組織在其他處理條件下也有低豐度的表達(dá)，說明其特異性不強。

2.2""熱誘導(dǎo)基因啟動子的克隆

以橡膠樹熱研7-33-97的基因組中檢索到的HbHSP17.6C和HbHSP17.6B啟動子序列設(shè)計2對PCR引物，通過巢式PCR擴增HbHSP17.6C基因的啟動子序列片段，成功克隆得到了HbHSP17.6C基因的啟動子片段，但未能獲得HbHSP17.6B的啟動子片段。PCR產(chǎn)物純化、克隆后，序列分析發(fā)現(xiàn)克隆出HbHSP17.6C基因起始密碼子上游的1962"nt的序列。

2.3""HbHSP17.6C基因的cDNA和啟動子序列的驗證

橡膠樹基因組比對結(jié)果顯示，HbHSP17.6C基因只有1個外顯子，沒有內(nèi)含子。以橡膠樹愈傷組織熱處理后的cDNA作為模板，PCR擴增獲得HbHSP17.6C基因的cDNA全長。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，成功克隆得到了428"nt的目標(biāo)片段。測序結(jié)果顯示，該序列包含HbHSP17.6C基因的411"nt的編碼序列全長，在擬南芥數(shù)據(jù)庫（Tair）中進(jìn)行檢索分析，HbHSP17.6C是擬南芥AtHSP17.6C（AT1G53540.1）的同源基因，氨基酸序列一致性為59%。以橡膠樹熱研7-33-97基因組DNA為模板，使用引物20582F2和20582R2-2進(jìn)行PCR擴增，成功克隆得到了包含HbHSP17.6C基因的啟動子區(qū)和編碼區(qū)序列的2360"nt的片段。測序分析顯示，克隆的1962"nt啟動子序列位于HbHSP17.6C基因編碼序列的起始密碼子的相鄰上游，HbHSP17.6C基因只有1個外顯子。

2.4""橡膠樹pHbHSP17.6C熱誘導(dǎo)啟動子序列的順式作用元件分析

通過啟動子在線分析工具（Plantcare）檢索發(fā)現(xiàn)，pHbHSP17.6C啟動子序列的順式作用元件根據(jù)分布密度可分為高、中、低3個明顯的區(qū)域，分別是–1962～–1696"nt、–1695～–994"nt和–993～"–1"nt，越靠近起始密碼子密度越高（圖3）。順式作用元件分析顯示，除了含有啟動子的核心轉(zhuǎn)錄區(qū)TATA-box和啟動子、增強子區(qū)域中常見的順式作用元件CAAT-box外，還有參與脫落酸反應(yīng)的ABRE順式作用元件，參與光反應(yīng)的順式調(diào)控元件G-box、AE-box、Box"4、GATA-motif、GT1-"motif、I-box、TCCC-motif順式作用元件，厭氧誘導(dǎo)所必需的順式調(diào)控元件ARE，與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件CAT-box，赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif，參與低溫響應(yīng)的順式作用元件LTR，MYB結(jié)合位點參與干旱誘導(dǎo)MBS順式作用元件，參與種子特異性調(diào)控的順式調(diào)控元件RY-element，水楊酸反應(yīng)性中的順式作用元件TCA-element，60K蛋白結(jié)合位點的順式作用元件Unnamed__1等類型，不含有已知的熱反應(yīng)順式作用元件。

3""討論

本研究以橡膠樹熱研7-33-97的胚性愈傷組織為材料，熱處理后通過轉(zhuǎn)錄組比較分析以及實時熒光定量表達(dá)分析篩選并鑒定到2個熱激活特異性表達(dá)基因HbHSP17.6B和HbHSP17.6C，成功克隆出這2個基因的cDNA全長；通過巢式PCR方法，僅克隆出1個熱激活啟動子pHbHSP17.6C，對HbHSP17.6C基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)序列片段進(jìn)行整體克隆，證實了pHbHSP17.6C序列位于HbHSP17.6C基因起始密碼子的上游，而HbHSP17.6C基因只有1個外顯子。HbHSP17.6C屬于小熱休克蛋白，植物小熱休克蛋白通常作為分子伴侶參與植物抗逆反應(yīng)[12]。在擬南芥的根和莖中，HbHSP17.6C的同源基因AtHSP17.6C應(yīng)對熱、冷、滲透脅迫、鹽、干旱、遺傳毒性、紫外線、氧化應(yīng)激、傷害和病原體感染等脅迫時，都會有大量的激活表達(dá)[13]。

20世紀(jì)很多物種還沒有參考基因組，通過gDNA片段的質(zhì)粒文庫雜交及測序，在果蠅中克隆到熱休克蛋白基因hsp70及其啟動子序列[14]。在煙草中應(yīng)用該啟動子驅(qū)動不同目的基因的表達(dá)，實現(xiàn)了通過調(diào)節(jié)溫度來人為控制目的基因在植物中的表達(dá)，并產(chǎn)生不同表型[15-16]。利用果蠅hsp70的啟動子驅(qū)動Cre重組酶基因的表達(dá)，通過熱激活Cre/loxp系統(tǒng)的重組反應(yīng)，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中刪除了篩選標(biāo)記基因，但效率僅為4%[17]；分別利用大豆和擬南芥的熱休克蛋白基因的啟動子pGmHSP17.6-L和pHSP18.2驅(qū)動Cre基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因香蕉中刪除標(biāo)記基因的效率分別達(dá)到了60%和40%[18]；在水稻中應(yīng)用GmHSP17.5E基因的啟動子驅(qū)動Cre基因的表達(dá)，刪除標(biāo)簽基因的效率最高可達(dá)94%[19]；在楊樹中應(yīng)用GmHSP17.5E基因的啟動子分別驅(qū)動Cre/loxp和FLP/FRT系統(tǒng)，基因刪除效率分別為63%和65%[20]；使用玉米自身的熱休克蛋白HSP70的啟動子驅(qū)動Cre/loxp系統(tǒng)，基因刪除效率最高可達(dá)100%[21]。以上研究說明，雖然熱休克蛋白基因的啟動子功能具有一定的保守性，但是同一個啟動子在不同物種中的通用性并不是特別高，應(yīng)用物種自身的熱休克蛋白基因的啟動子可以增加基因工程技術(shù)的工作效率。

HbHSP17.6C基因具有熱休克蛋白基因的典型特征：在熱處理前不表達(dá)，只有熱處理后才迅速啟動表達(dá)。在橡膠樹愈傷組織中，經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染處理、各種培養(yǎng)條件變化，HbHSP17.6C基因均不激活表達(dá)，表明該基因的啟動子在橡膠樹愈傷組織中能夠特異性響應(yīng)熱激活處理，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過程不敏感，有望作為人為控制的分子開關(guān)在橡膠樹及近源作物基因工程研究中發(fā)揮作用。

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