石羊河流域中下游檸條錦雞兒種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

摘要：為研究石羊河流域中下游5個檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）種群的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性，利用ITS與 psbA-trnH 聯(lián)合序列對石羊河流域中下游5個檸條錦雞兒種群中樣本進行物種鑒定，再對5個檸條錦雞兒種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進行分析。結(jié)果表明，（1）5個種群中優(yōu)勢種為檸條錦雞兒；（2）檸條錦雞兒種群共存在20個單倍型，以原始單倍型Hap1為節(jié)點形成了一個大分支，以Hap9、Hap10和Hap12為節(jié)點形成了3個小分支，其中，阿拉古山種群中單倍型最為豐富，阿拉古山種群與扎子溝種群中單倍型突變方向差異最大；（3）檸條錦雞兒群體間變異為14.28%，群體內(nèi)的變異為85.72%，檸條錦雞兒群體分化指數(shù)在0.02～0.27之間。群體間存在遺傳分化，其中，八步沙種群與阿拉古山、扎子溝種群間的群體遺傳分化最大。由此可見，檸條錦雞兒阿拉古山種群、扎子溝種群、八步沙種群群體遺傳結(jié)構(gòu)存在差異，可以作為下一步檸條錦雞兒育種的種質(zhì)材料。

關(guān)鍵詞：石羊河流域中下游；檸條錦雞兒；單倍型；ITS序列；群體遺傳多樣性

收稿日期：2025-02-25

基金項目：甘肅省青年基金計劃（22JR5RH1034）；2022年甘肅省林業(yè)和草原科技項目（2022kj015）。

第一作者：華曉琴（1988-），女，碩士，高級工程師，從事林木良種選育研究。E-mail：278689104@qq.com。

通信作者：

檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）是豆科（Fabaceae）錦雞兒屬（Caragana）落葉灌木，分布于寧夏、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古等地，生于半荒漠或荒漠地區(qū)，抗逆性強，常用于防風(fēng)固沙、水土保持及沙漠化治理［1］，根系具固氮根瘤菌，對貧瘠沙地具有改良作用，枝葉蛋白質(zhì)含量高，是優(yōu)良飼料［2-3］，是“三北”地區(qū)防風(fēng)固沙、生態(tài)修復(fù)主要造林樹種之一，每年苗木需求量巨大。

目前針對檸條錦雞兒的研究重點集中在造林、生理、生態(tài)等方面［4-6］，對檸條錦雞兒遺傳多樣性研究較少。林木種質(zhì)資源是遺傳多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ)，也是林木育種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［7］，而遺傳多樣性分析在開展植物新品種選育、功能基因定位、生物多樣性保存等方面均具有重要意義［8］，是林木遺傳育種的基礎(chǔ)。遺傳多樣性表示物種內(nèi)基因的豐富程度及變異狀況，遺傳多樣性越豐富對環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強［9］。在石羊河流域中下游干旱河岸及騰格里沙漠、巴丹吉林沙漠邊緣均有較大面積的檸條錦雞兒天然群落。

這些分布點的氣候、土壤差異較大，且分布點間直線距離較大，種群間具有地理隔離，人為干擾因素少，具備種群間遺傳變異的基礎(chǔ)，種群間可能具有較大的遺傳分化。研究表明該群落中檸條錦雞兒的重要值和生態(tài)位寬度明顯高于其他物種［10］。

但檸條錦雞兒形態(tài)特征與生長環(huán)境關(guān)系密切，干旱荒漠區(qū)植物生長量小、葉片趨于退化，僅從形態(tài)特征上無法準(zhǔn)確鑒定物種并通過表型特征對遺傳多樣性進行研究。因此，本研究利用 ITS 與 psbA-trnH 聯(lián)合序列對石羊河流域中下游天然分布的檸條錦雞兒構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定該地區(qū)天然林中優(yōu)勢物種是否為檸條錦雞兒，再基于IST序列多態(tài)性及單倍型多樣性對優(yōu)勢物種遺傳多樣性進行分析，并進行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，為選育適應(yīng)該區(qū)域的檸條錦雞兒良種提供理論依據(jù)。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 樣本采集

于2023年6月、8月，根據(jù)檸條錦雞兒形態(tài)特征分兩次在石羊河流域中下游的騰格里沙漠和巴丹吉林沙漠邊緣的沙灘地、干旱河岸、半沙化土地及流動沙丘采集檸條錦雞兒葉片，具體地點如圖1所示。每個采樣點，隨機選擇10個單株，以株為單位采集葉片，進行物種鑒定；根據(jù)鑒定結(jié)果在5個天然林分中以株為單位采集檸條錦雞兒葉片，進行遺傳多樣性分析，每個單株分布距離≥100 m，樣品編號及數(shù)量對應(yīng)采集地點見表1，葉片采集后保存于實驗室4 ℃冰箱，用于植物基因組DNA提取。

1.2 基因組DNA提取

取上述新鮮的植物樣品0.1 g，按北京金沙生物科技有限公司生產(chǎn)的高效植物基因組DNA提取試劑盒（試劑盒貨號DE711-50）提取基因組DNA，基因組提取按說明書操作，提取到的基因組DNA用于靶標(biāo)片段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增。

1.3 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系（25 μL ）：諾唯贊生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）PCR Mix （貨號P212） 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水9.5 μL，對于難于擴增的加入牛血清與海藻糖溶液［11］。（1）ITS擴增序列所用引物（5′～3′） ITS-5F：ATGCG-ATACTTGGTGTGAAT；ITS-3R：GACG-CTTCTCCAGACTACAAT，擴增程序為94 ℃持續(xù)4 min，（94 ℃持續(xù)30 s，53 ℃持續(xù)40 s， 72 ℃持續(xù)40 s，35次循環(huán)），最后延伸72 ℃持續(xù)7 min［12-13］。（2） psbA-trnH擴增序列所用引物（5′～3′）為HpsbA-5F： GTTATGCATGAACGTAATGCTC; trnH-3R：CGCGCATGGTGGAT-TCACAAAT，擴增程序為94 ℃持續(xù)4 min， （94 ℃持續(xù)30 s， 52 ℃持續(xù)40 s， 72 ℃持續(xù)1 min，35次循環(huán)），最后延伸72 ℃持續(xù)10 min［13-14］。

擴增的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測有條帶后，PCR產(chǎn)物直接送北京擎科生物股份有限公司測序。測序結(jié)果用生物信息學(xué)軟件bioedit進行序列比對分析［15］，參考序列的下載使用TBtools序列獲取功能［16］，序列的比對使用MEGA11［17］與phylosuit軟件中MAFF功能以及序列的格式轉(zhuǎn)換以及模型分析［18］等。

1.4 數(shù)據(jù)分析

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用到的錦雞兒屬植物及外類群黃芪（Astragalus membranaceus）、山巖黃芪（Hedysarum alpinum）ITS 序列與 psbA-trnH序列的參考序列均從 NCBI 中GenBank 獲得。

使用MEGA 11 （Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件對ITS序列的長度、變異位點等特征進行統(tǒng)計分析，再用Arlequin 3.0軟件中的分子變異分析程序（AMOVA）計算群體遺傳差異指數(shù)Fst值，利用軟件Dnasp version 6.12.03與PopART version 1.7構(gòu)建檸條錦雞兒群體的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，以此進行單倍型分析。

單倍型多樣性（%）=1－（2/樣本數(shù)）×（1/單倍型數(shù)量）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITS和psbA-trnH序列的物種鑒定

對采集的50個檸條錦雞兒樣品進行擴增測序，發(fā)現(xiàn)有差異的序列25個，ITS序列長度約為

292 bp，psbA-trnH序列約為449 bp。通過ITS和psbA-trnH序列聯(lián)合構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，結(jié)果如圖2所示，表明所采集的樣品均與檸條錦雞兒（Caragana korshinskii）聚在同一分支上。由此可知，在石羊河流域中下游采集的檸條錦雞兒樣品，形態(tài)學(xué)特征與分子系統(tǒng)鑒定的結(jié)果一致。

2.2 基于ITS序列的多態(tài)性及單倍型多樣性

對5個檸條錦雞兒種群中256個單株樣本進行PCR 擴增，獲得229個有效ITS序列，對獲得的序列進行測序，用MEGA 11軟件比對分析，拼接后ITS序列均在800～801 bp之間，序列長度變化幅度小。

由表2可知，存在20個單倍型，即Hap1～Hap20，在20個單倍型中檢測到了變異位點16個，單倍體多樣性達99.9%，說明樣本中遺傳資源非常豐富。

2.3 單倍型親緣關(guān)系

由表3可知，民勤縣的阿拉古山種群（編號A）中單倍型數(shù)量最多，有11種，其次為紅敖包（編號C）和八步沙種群（編號D），有9個單倍型，扎子溝種群（編號B）具有7個單倍型。涼州區(qū)民調(diào)渠沿線種群（編號E）中單倍型最少，只有6個單倍型。阿拉古山種群與扎子溝種群共有的單倍型最少，僅為存在最廣泛的Hap1、Hap9；紅敖包種群與八步沙種群共有單倍型7個，其他種群之間共有多倍型為4～5個。

基于PopART的檸條錦雞兒單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示，武威石羊河流域檸條錦雞兒種群中的20個單倍型中Hap1為原始單倍型，以單倍型Hap1為節(jié)點形成了一個大的分支，以Hap9、Hap10、Hap12為節(jié)點形成了3個小分支。Hap1位于整個單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的起源，而其他單倍型都是從單倍型Hap1 經(jīng)過一步或多步突變得到的。Hap1單倍型存在最為廣泛，為5個種群共有，Hap9單倍型主要來源于扎子溝和民調(diào)渠沿線種群，Hap10單倍型主要來源于除扎子溝之外的4個種群，Hap12主要來源于除阿拉古山之外的4個種群（圖3）。

由此可見，民勤縣阿拉古山種群的遺傳多樣性最高，其次為民勤縣紅敖包種群和古浪縣八步沙種群，涼州區(qū)民調(diào)渠沿岸種群遺傳多樣性最低；阿拉古山種群與扎子溝種群間遺傳分化最大，八步沙種群與紅敖包種群間遺傳分化最??；阿拉古山與扎子溝種群間的遺傳分化主要起源于Hap10、Hap12兩個單倍型。

2.4 群體遺傳分析

分子變異方差分析結(jié)果表明，群體間的變異占比為14.28%，群體內(nèi)的變異占比為85.72%（表4）。群體之間的Fst指數(shù)在0.02～0.27之間（表5），其中古浪縣八步沙種群（編號D）與民勤縣阿拉古山（編號A）、扎子溝種群（編號B）間的Fst指數(shù)分別為0.26和0.27，均大于0.25，說明八步沙種群與阿拉古山、扎子溝種群間存在很大的遺傳分化；阿拉古山與扎子溝種群、扎子溝與涼州區(qū)民調(diào)渠沿岸種群（編號E）、民勤縣紅敖包（編號C）與八步沙種群間的Fst指數(shù)分別為0.05，0.02和0.04，均小于0.05，說明這3個種群之間的遺傳分化較小，基本可以忽略；紅敖包與阿拉古山、扎子溝、民調(diào)渠沿線種群間的Fst指數(shù)分別為為0.12，0.15和0.06，介于0.05～0.15之間，說明民勤縣紅敖包與阿拉古山、扎子溝種群和民調(diào)渠沿線的遺傳分化中等；八步沙與涼州區(qū)民調(diào)渠沿岸種群間的Fst值為0.17，在0.15～0.25之間，說明這兩個種群間遺傳分化程度較大。

3 討論

ITS是植物核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，由18S與5.8S之間的ITS1和5.8S與28S之間的 ITS2組成［19］。psbA-trnH序列是位于葉綠體DNA基因組中的psbA基因和trnH基因之間的一段非編碼序列［20］，廣泛用于植物、微生物近緣種鑒定及不同種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究。Rather等［21-22］研究發(fā)現(xiàn)ITS與trn-psbA作為錦雞兒屬種的分子鑒定DNA優(yōu)于單獨ITS。本研究根據(jù)檸條錦雞兒形態(tài)特征在試驗點采集樣本后通過ITS與psbA-trnH聯(lián)合序列鑒定為檸條錦雞兒，說明系統(tǒng)發(fā)育與形態(tài)鑒定是一致的。

單倍型常用于遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)、生物地理譜系、優(yōu)異單倍型發(fā)掘等研究［23-24］，單倍型Hap1存在于每個檸條錦雞兒種群中，由此可以判斷Hap1為較古老的單倍型，其他單倍型由此進化而來。阿拉古山種群單倍型最為豐富，這可能與阿拉古山檸條錦雞兒種群包含個體數(shù)量多、面積大［25］且天然更新良好［26］，具有基因變異發(fā)生條件有關(guān)。阿拉古山種群與扎子溝種群間遺傳多樣性差異最大，這與扎子溝種群從單倍型Hap1未突變出單倍型主要分支Hap10的結(jié)果相對應(yīng)。

分子變異方差分析結(jié)果表明檸條錦雞兒群體間的變異占比為14.28%，群體內(nèi)的變異占比為85.72%，說明檸條錦雞兒的變異主要來自種群內(nèi)部，這與王贊等［27］對檸條錦雞兒表型特征遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)居群內(nèi)平均表型變異占80%的結(jié)果一致。這可能與不同采樣點間地理隔離且人為干擾較少，種群基因交流受限，導(dǎo)致群體間變異較少；而檸條錦雞兒為異花授粉植物［28］，異花授粉加劇種群內(nèi)遺傳分化有關(guān)。

Fst常用來表示群體間的遺傳分化程度，用于篩選單倍型，在0～l的范圍內(nèi)，F(xiàn)st指數(shù)越大，群體間的分化程度越高［29］。檸條錦雞兒群體分化指數(shù)在0.02～0.27之間，進一步證實種群間存在遺傳分化，其中八步沙種群與阿拉古山、扎子溝種群間的群體分化指數(shù)較高，八步沙處于綠洲-沙漠過渡帶，土壤水分、降水量較阿拉古山、扎子溝高，這與研究發(fā)現(xiàn)種群遺傳多樣性與降水、生長季節(jié)相對濕度有關(guān)的結(jié)論相對應(yīng)［30］；在單倍型分析中遺傳多樣性最大的阿拉古山和扎子溝種群間的Fst指數(shù)較低，顯示遺傳分化程度低，這可能是由于這兩個種群中擁有Hap1單倍型的個體較多引起的，但具體原因需后續(xù)進一步研究。

在今后研究中可以結(jié)合不同種群生長、抗逆表現(xiàn)，可將阿拉古山種群、扎子溝種群、八步沙種群作為下一步檸條錦雞兒育種的種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究采用ITS與psbA-trnH聯(lián)合序列對石羊河流域中下游不同種群樣本進行鑒定，結(jié)果表明根據(jù)檸條錦雞兒表型特征所采樣本均為檸條錦雞兒。檸條錦雞兒存在20個單倍型，其中Hap1為原始單倍型，以單倍型Hap1為節(jié)點形成了一個大分支，以Hap9、Hap10、Hap12為節(jié)點形成了3個小分支。其中，阿拉古山種群單倍型最為豐富，阿拉古山種群與扎子溝種群中單倍型突變方向差異最大。檸條錦雞兒群體間變異占14.28%，群體內(nèi)的變異占85.72%，檸條錦雞兒群體分化指數(shù)在0.02～0.27之間，群體間存在遺傳分化，其中，八步沙種群與阿拉古山、扎子溝種群間的群體遺傳分化最大。

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Genetic Structure Analysis of Caragana korshinskii Population in Middle and Lower Reaches of Shiyang River Basin

HUA Xiaoqin1，2， MA Hongwen1，2， YU Tianquan1，2， YAN Haiwang3，LI Hao4

（1.Wuwei National Poplar and Camphor Pine Breeding Base， Wuwei 733000，China;" 2.Wuwei Forestry Comprehensive Service Center， Wuwei 733000，China; 3.Gulang County Forestry Technology Service Center， Wuwei 733100，China; 4.College of Forestry，Beijng Forestry University， Beijing 100083，China）

Abstract：In order to reveal the population genetic structure and diversity of five Caragana korshinskii populations in the middle and lower reaches of the Shiyang River Basin， ITS and psbA-trnH sequences were used to identify samples and analyzed population genetic structure and population genetic diversity from five populations of C. korshinskii in the middle and lower reaches of the Shiyang River Basin. The results showed that， （1） The dominant species in the five populations was C. korshinskii. （2） A total of 20 haplotypes existed in the C. korshinskii population， with the original haplotype Hap1 as the node to form a large branch， and Hap9， Hap10， and Hap12 as the nodes to form three sub-branches， among which the Alagu Mountain population haplotypes was the most abundant， and the difference in the direction of the haplotype mutation was the greatest between the Alagu" Mountain population and the Zhazigou population. （3） The inter-population variation of C. korshinskii was 14.28% and intra-population variation accounted for 85.72%. The Fst of C. korshinskii population ranged from 0.02 to 0.27， and genetic differentiation existed among populations， with the greatest population genetic differentiation between the Babusha population and the Alagu Mountain and Zhazigou populations.

In conclusion， it can be seen that， there are differences in the genetic structure of the populations of C. korshinskii from Alagu" Mountain， Zhazigou， and Babusha， which can be used as germplasm materials for the next breeding of C. korshinskii.

Keywords：middle and lower reaches of the Shiyang River Basin; Caragana korshinskii; haplotype; ITS sequence; population genetic diversity