油菜脂肪酸合成相關基因2-酮脂酰-CoA 還原酶克隆及生物信息學分析

摘要：油酸是菜籽油主要脂肪酸，有很好的營養(yǎng)保健功能，菜籽油品質改良對改善我國居民營養(yǎng)水平十分重要，因而受到油菜育種研究者的廣泛關注，但其合成的分子機理研究仍有待于進一步提高。為促進我國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展，以高油酸油菜5葉期－6葉期葉片為材料，克隆了油酸代謝相關基因2-酮酯酰-CoA還原酶，同時還構建了過表達載體，測序分析發(fā)現(xiàn)基因長度為1 212 bp，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼312個蛋白，通過Predictprotein定位于內質網(wǎng)，生物信息學分析表明，該序列與數(shù)據(jù)庫公布序列同源性為99％，CDs序列和氨基酸序列分析結果都表明，甘藍型油菜KCR與白菜型油菜KCR聚類在一起，擬南芥KCR 與亞麻薺KCR聚類在一起，甘藍型油菜KCR與白菜型油菜KCR親緣關系較近，同擬南芥KCR、亞麻薺KCR親緣關系相對較遠。

關鍵詞：油酸；油菜；脂肪酸；基因克隆

收稿日期：2024-07-09

基金項目：湖南省科技創(chuàng)新計劃（S2021NCZYCX0007）。

第一作者：陳小玲（1975-），男，學士，農藝師，從事分析檢測研究。E-mail：13787138522@163.com。

通信作者：張維（1987-），男，博士，高級農藝師，從事油菜分子育種研究。E-mail：zhangweirape@163.com。

油菜是中國第一大自產(chǎn)植物油源，據(jù)國家統(tǒng)計年鑒資料，2020年全國油菜種植面積及產(chǎn)量分別占自產(chǎn)油料作物面積和產(chǎn)量的51.52%和39.17%， 菜籽油占我國食用油總消費量的15%。隨著居民生活水平的提高，對食用油品質要求也越來越高，我國食用植物油中含量較高的脂肪酸主要有棕櫚酸（C16∶0）、油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）、亞麻酸（C18∶3）、花生烯酸（C20∶1）和芥酸（C22∶1）［1］。

不同油料作物的脂肪酸組成差異明顯。在大宗食用油中，棕櫚油的棕櫚酸含量最高，約占41.77%；大豆油的亞油酸含量最高，約占47.40%；橄欖油的油酸占72.71%，在高油酸油菜油中油酸含量可達到75%以上［2］。因此油菜脂肪酸的含量改良極其重要，Peng等［3］通過 RNAi 同時沉默F(xiàn)AE1 基因和 FAD2基因，在提高油酸含量的同時，降低了芥酸含量。Okuzaki等［4］使用 CRISPR-Cas9技術敲除油菜FAD2基因的一個拷貝，油酸含量顯著上升。各科研院校通過誘變和基因敲除FAE1和FAD2等基因創(chuàng)制了一批高油酸、低芥酸的優(yōu)良品種。研究表明高油酸菜籽油中不飽和脂肪酸易被人體吸收，可預防冠心病等心腦血管疾病，有較好的營養(yǎng)保健作用［1-3］。近年來有關高油酸油菜相關研究工作受到廣泛的關注［2］。

高油酸油菜（具有大于75%的油酸含量）壓榨出的菜籽油品質好，價格優(yōu)惠，深受廣大消費者喜愛［5-6］，是當前油菜育種研究的熱點。華中農業(yè)大學、浙江省農業(yè)科學院、湖南農業(yè)大學和西南大學等研究機構都做了大量相關研究，選育出一些高油酸油菜新品種及新材料。油菜脂肪酸合成途徑中關鍵酶基因變異會影響脂肪酸成分組成，其中包括控制油酸、芥酸的關鍵酶脂肪酸延伸酶 1（FAE1）和控制油酸去飽和化向亞油酸轉化的關鍵酶脂肪酸去飽和酶 2（FAD2）。目前對脂肪酸代謝機理研究主要集中在FAD2基因（△12脂肪酸脫氫酶基因），當前研究多認為脂肪酸遺傳特性由多基因控制［7-8］。Li等［9］使用蕓薹屬60K芯片對油菜油酸組成進行關聯(lián)分析，分別在A08和C03染色體上定位到了顯著差異位點 。其他研究者用60K芯片在油菜不同群體中均定位到了A08和C03上差異位點［9-12］。除此之外，在 A02、A05、A06、A09、C01、C02、C05、C07、C08 和 C09 染色體上也檢測到與脂肪酸組成相關的基因位點。Shi等［13］在利使用油菜60K芯片數(shù)據(jù)關聯(lián)

分析之后，得出的重測序數(shù)據(jù)對候選基因FAE1進行基因的單倍型分析，其中最優(yōu)單倍型組芥酸含量為（9.11±6.16）%。Qing等［14］利用全基因組范圍上特異位點擴增片段測序技術定位到

FAE1、FAD2、LACS09、KCS17、CER4和ACBP5等多個與脂肪酸合成相關的候選基因。Kou等［15］對脂肪酸進行全基因組關聯(lián)分析，也定位到A08和C03染色體上控制油酸成分的主效基因。TAN等［16］ 對油菜種子組分進行關聯(lián)分析也得到了同樣的結果。在酵母ybr159△突變體及體外反應試驗中，從油菜中提取的 3-酮酯酰-CoA還原酶均使其超長鏈脂肪酸含量提高了。Puyaubert等［17］以甘藍型油菜種子為材料，克隆了酮脂酰CoA還原酶的兩個拷貝，并發(fā)現(xiàn)它們在種子和根中特異性表達。王慧［18］以甘藍型油菜 “蜀雜九號”為材料，克隆了3-酮酯酰-CoA還原酶2（BnKCR2），并對其進行過表達與干擾表達從而驗證了該基因可控制植物中芥酸含量。Bode等［19］以玉米及向日葵種子為材料，證明了?；o酶A脫氫酶參與高等植物線粒體中的β氧化。

本研究以甘藍型高油酸油菜5葉期－6葉期倒數(shù)第一片伸展葉為材料，提取RNA，克隆了2-酮酯酰-CoA還原酶基因（2-ketoacyl-CoA reductase，KCR），并構建過表達載體，進行信息學分析，以期為后續(xù)的基因功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

甘藍型高油酸油菜（油酸含量75.2%），種植于湖南隆平油料種業(yè)有限公司長沙縣潯龍河試驗基地。于2021年9月30日播種，施40 kg·（667 m2）-1復合肥和1 kg·（667 m2）-1硼肥，起壟栽培，采用條播方式，播種后采用溝灌，第二天打封閉除草劑，3葉期－4葉期時進行間苗、定苗，確保密度為30 cm×30 cm，其他田間管理措施同高產(chǎn)栽培田管理。開花期套袋自交，于2022年5月1日收獲。

1.1.2 試劑

載體采用Promega公司PGEM-TEasy Vector、植物總RNA提取試劑盒TransZol UP、First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、Taq TM-T DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、DNA Marker北京全式金公司；大腸桿菌DH5α、CaMV35S啟動子超表達的植物雙元表達載體pRI101、DNA膠回收試劑盒、磁珠法DNA膠回收試劑盒（10 k以上大片段回收）、質粒DNA小量提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 儀器

凝膠成像儀（Syngene GENE GENIUS，美國），PTC200PCR儀（ABI，美國）、ND2000（ABI，美國），氣相色譜儀（安捷倫7890A，美國），高速冷凍離心機（貝克曼J6-MI，德國）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

取高油酸油菜5葉期－6葉期倒數(shù)第一片伸展葉為材料，按照TransZol Up Plus RNA Kit （Trans Gene Biotech）試劑盒說明書提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

1.2.2 基因克隆

利用Premier 6.0軟件設計引物，用Oligo 7.0進行檢測，送往上海生工技術公司進行引物合成，F(xiàn)：GCGTCGACATGGAGATCTGCACTTACTTCA，R：CGGAATTCACTTTACGAGGAACCAACTG。cDNA的合成參見First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書，詳細方法參考文獻［13］。

1.2.3 載體構建

對克隆正確的菌液進行質粒提取、雙酶切與回收及連接pRI101過表達載體，步驟參見文獻［14］，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 生物信息學分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTP查找同源物種氨基酸序列，用DNAMAM 7.0對其進行聚類，分析其親緣關系。

2 結果與分析

2.1 基因克隆與分析

2.1.1 KCR基因克隆及過表達載體構建

以高油酸油菜5葉期－6葉期倒數(shù)第一片伸展葉為材料，按照1.2.1方法提取RNA，反轉錄并進行PCR擴增得到1 000 bp左右的基因片段（圖1），克隆片段大小符合預期。采用擎科膠回收試劑盒進行切膠回收，方法參考試劑盒說明書，測序后發(fā)現(xiàn)其序列為1 212 bp（圖2）。

將回收的基因與pRI101載體相連，構建過表達載體，并轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞，經(jīng)單菌落篩選和菌落PCR驗證，獲得陽性重組子后，送生物公司測序。由圖3可知，原質粒pRI101是10 480 bp的植物雙元表達載體，酶切后，質粒由環(huán)狀變成鏈狀產(chǎn)物，電泳時移動的較慢，故較實際偏大一些，本研究結果符合預期。挑取陽性克隆接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基當中，震蕩過夜，取新鮮菌液送北京擎科公司進行測序，發(fā)現(xiàn)該過表達載體為11 460 bp。

2.1.2 KCR 基因的鑒定

利用NCBI的BLASTP功能，把甘藍型油菜BnKCR的CDs序列與白菜型油菜BraKCR（NM_125455.3）全長CDs序列進行比對，比對結果顯示BnKCR的CDs序列與BraKCR的CDs序列一致性達到99%，這一結果與用Vector NTI軟件分析結果一致。MEGA6.06對白菜型油菜BnKCR（XM_009129326.2）、擬南芥BnKCR（NM_105441.3）、亞麻薺BnKCR（XM_019227679.1）和甘藍型油菜BnKCR（GSBRNA2-T00070184001）的CDs序列進行聚類分析（圖4）。聚類結果顯示，BnKCR與BraKCR聚類在一起，擬南芥KCR與亞麻薺KCR聚類在一起，BnKCR與白菜KCR（BraKCR）親緣關系較近，同擬南芥KCR、亞麻薺KCR親緣關系相對較遠。

2.3 甘藍型油菜KCR氨基酸序列分析

由圖5可知，登錄NCBI對BnKCR進行BLASTP比對，在堿基序列比對中結果中顯示，BnaKCR編碼312個蛋白，通過Predictprotein定位于內質網(wǎng)。MEGA6.06將BnKCR的氨基酸序列與白菜型油菜（Brassica rapa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、亞麻薺（Camelina sativa）的氨基酸序列進行 UPGMUM 聚類分析，結果表明BnKCR與白菜型油菜（XM_009129326.2）的同源性最高，同源性為99%；BnaKCR與擬南芥（NM_105441.3）和亞麻薺（XM_019227679.1）的同源性最低，同源性均為87%（圖6）。由親緣關系的遠近表明，亞麻薺和擬南芥為一類。其中BnKCR同 BraKCR的親緣關系較近，和亞麻薺和擬南芥親緣關系最遠。

3 討論

目前市面上常規(guī)食用雙低菜籽油中油酸含量通常在60%左右，當前的高油酸油菜多來自于FAD2基因突變，多個FAD2基因同時突變的高油酸油菜在田間種植條件下長勢變劣，含油量下降，影響其大面積推廣應用。高油酸油菜品種的選育需要對其主效基因進一步加強研究，因此，鑒定新的高油酸基因資源對高產(chǎn)高油酸油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展非常重要。肖鋼等［20］以甘藍型油菜湘油15為材料，發(fā)現(xiàn)6個新的FAD2拷貝，在釀酒酵母中進行體內表達試驗，發(fā)現(xiàn)這6個FAD2拷貝為假基因。劉睿洋等［21］克隆了甘藍型油菜A5、C5、A1連鎖群上3個BnFAD2基因的全長cDNA序列，發(fā)現(xiàn)BnFAD2-A5和BnFAD2-C5是影響油菜種子油酸積累的主效基因。Peng等［3］將FAD2和FAE1兩個干擾片段融合后構入干擾載體中，發(fā)現(xiàn)油酸組成上升至85％，多不飽和脂肪酸下降至10％。劉少鋒［22］通過Napin啟動子誘導對油菜植株中BnFAD2、BnFAD3、BnFATB基因進行RNAi共干擾抑制，發(fā)現(xiàn)種子中油酸含量由66.76%提升至82.98%。Zhang等［23］發(fā)現(xiàn)在甘藍型油菜中過表達BnZFP1基因可使油菜籽中油酸含量增加了18.8％。本研究通過對高油酸油菜油酸關鍵酶FAD2基因分析研究，克隆了高油酸合成相關的關鍵基因BnKCR，構建了過表達載體，并對其結構和功能進行了生物信息學分析，為高油酸油菜油酸合成分子機理研究和分子育種研究提供了前期基礎?？捎糜谛碌?、性狀優(yōu)異的高油酸油菜育種材料篩選。

當前高油酸油菜新品種與普通雙低油菜品種相比，含油量較高，農藝性狀相當。高油酸菜油主要面向中高端消費群體，市場售價在80元·kg-1以上，加工企業(yè)效益較好，因而在菜籽收購環(huán)節(jié)，較普通菜籽高2元·kg-1，種植戶可增收300元·（667 m2）-1左右，種植積極性較高，有利于農民增收，新農村建設也有十分重要的促進作用；同時還有助于提高我國油菜種植面積和菜籽油產(chǎn)量，有效緩解當前我國食用油自給率嚴重不足的局面，確保食用油安全。同時，也可提高我國菜籽油的國際競爭力，改變我國菜籽油乃至大宗食用油嚴重依賴境外的不利局面。

4 結論

本研究以高油酸油菜5葉期－6葉期葉片為材料，提取RNA，克隆了油酸合成相關的2-酮酯酰-CoA還原酶基因，構建了過表達載體，測序分析發(fā)現(xiàn)長度為1 212 bp，符合預期結果；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼312個蛋白，通過Predictprotein定位于內質網(wǎng)，該序列與數(shù)據(jù)庫公布序列同源性為99％。本研究可為高油酸油菜油酸合成分子機理研究及分子育種研究提供前期基礎，進而促進我國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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Gene Clone and Bioinformatics Analysis of 2-Ketoacyl-CoA Reductase Gene Which Related to Fatty Acid Synthesis of Brassica napus

CHEN Xiaoling1， LIU Yingxia2， ZHANG Wei2

（1.Qidong County Agricultural and Rural Bureau， Hengyang 421600， China; 2.Hunan Longping Oil Seed Industry Co.， Ltd.， Changsha 410128， China）

Abstract：Rapeseed is the largest self-produced source of vegetable oil in China， accounting for 15% of the total consumption of edible oil in China. Improving the quality of rapeseed oil is very important for improving the nutritional level of Chinese residents， and has received widespread attention from rapeseed breeding researchers. Oleic acid is the main fatty acid in rapeseed oil and has good nutritional and health functions， but the molecular mechanism of its synthesis still needs further improvement. This study used high oleic acid rapeseed leaves at the 5-6 leaf stage as materials to clone the oleic acid metabolism related gene 3-ketoacyl CoA reductase.

At the same time， an overexpression vector was also constructed， and sequencing analysis revealed a gene length of 1 212 bp. Bioinformatics analysis revealed that the gene encodes 312 proteins， which are located in the endoplasmic reticulum through Predictprotein. The sequence has a 99% homology with the publicly available sequence in the database. The analysis of CDs and amino acid sequences showed that the KCR of Brassica napus and Brassica napus were clustered together， while the KCR of Arabidopsis thaliana was clustered together with the KCR of Shepherd’s purse. The KCR of Brassica napus was closely related to the KCR of Brassica napus， but relatively distant from the KCR of Arabidopsis thaliana and Shepherd’s purse.

Keywords：oleic acid; rapeseed; fatty acid; gene clone