一株引起高粱根腐病的病原菌鑒定

摘要：為明確一株分離得到的高粱根腐病的病原菌種類，采用蘸根接種法進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證，并基于ITS和β-tubulin基因序列分析，同時結(jié)合形態(tài)學(xué)對該菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，菌株ZY5菌落正面絨狀，規(guī)則圓形，黃褐色；菌落背面深黃褐色至黑色；厚垣孢子單生或串生，8～17 μm×10～12 μm；分生孢子長卵圓形，無隔膜，大小2.0～3.0 μm ×1.0～1.5 μm?；讦?tubulin基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，與高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）聚為一支，支持率為98%。根據(jù)形態(tài)特征與構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，將菌株ZY5鑒定為高粱附球菌。高粱附球菌可以引起高粱根腐病為國內(nèi)外首次報道。

關(guān)鍵詞：高粱；根腐??；高粱附球菌；病原鑒定

收稿日期：2024-11-27

基金項(xiàng)目：黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201910223055）。

第一作者：張歡（1998－），男，博士研究生，從事植物保護(hù)研究。E-mail： 18228901907@163.com。

通信作者：郭永霞（1970－），女，博士，教授，從事農(nóng)藥學(xué)研究。E-mail： gyxia@163.com。

高粱（Sorghum bicolor L. Moench， 1794）原產(chǎn)非洲，具抗旱、耐澇、耐鹽堿、耐貧瘠的特性，可用作糧食、飼料、燃料等，其廣泛分布在六大洲的熱帶、亞熱帶和溫帶氣候地區(qū)，每年產(chǎn)量5 000多萬t［1-3］。黑龍江省是我國高粱主產(chǎn)區(qū)，其中80%集中在松嫩平原中南部地區(qū)的安達(dá)、大慶、肇源等地［4-6］。隨著種植面積的增大，病害嚴(yán)重限制了高粱的生產(chǎn)，由于真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲和寄生植物的影響，高粱每年的作物損失達(dá)30%［7-8］。根腐病作為苗期病害，其危害程度尤為明顯，國內(nèi)外學(xué)者研究表明，高粱根腐病通常是由土壤真菌Fusarium spp.［9-11］、Pythium spp.［12］、Penicillium spp.［13］、Bipolari-ssorokiniana、Alternaria alternata、Macrophomina phaseolina、Rhizoctonia sorghi和Phoma sorghina［14-16］等復(fù)合侵染導(dǎo)致。前期在對高粱病害進(jìn)行調(diào)查期間，發(fā)現(xiàn)根腐病發(fā)生普遍，且發(fā)病率高，影響高粱幼苗的生長發(fā)育，并從高粱田間采集根腐病樣本分離真菌，根據(jù)菌落顏色、病菌形態(tài)初步確定有鐮孢菌、青霉菌、鏈格孢菌、絲核菌和一株文獻(xiàn)未報道的菌，本研究針對這一株菌進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期更好地了解引起高粱根腐病的病原種類，為病害的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試高粱品種：龍雜10號，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所提供。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

供試菌株：2019年從黑龍江省肇源科技園區(qū)采集高粱根腐病樣本，分離、純化獲得菌株，編號ZY5，保存在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 柯赫氏法則驗(yàn)證

參照《植病病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》［17］中有關(guān)方法對從高粱根腐病樣本中分離純化的菌株ZY5進(jìn)行致病性測定。選用蘸根接種法，發(fā)病后對發(fā)病組織再分離，與初分離菌株對比，確定致病菌。

高粱種子消毒：挑選大小均勻飽滿的成熟高粱種子，清水沖洗3遍后，先后用70%乙醇消毒3 min，漂白水（漂白粉1 g∶蒸餾水14 mL）消毒20 min，再用無菌水洗3遍。

濾紙保濕法催芽獲取無菌苗：取一張無菌的濾紙鋪入滅菌后的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿加5 mL無菌水，再取經(jīng)過消毒的種子，均勻地?cái)[放到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿擺放20粒，然后放入28 ℃培養(yǎng)箱中24 h，第二天挑選無菌的高粱苗放入新的培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)，48 h后接種分離菌。

蘸根接種法接種：將培養(yǎng)好的幼苗放在待測菌株ZY5的孢子懸浮液中浸根處理1 h，對照放在無菌水中浸根處理1 h。將處理好的幼苗放入帶有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿加入3 mL無菌水，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病情況并拍照。

接種物再分離：從接種發(fā)病的植株上再進(jìn)行病菌分離和純化，將培養(yǎng)物與接種的菌株進(jìn)行對比，觀察性狀是否相同。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA培養(yǎng)基25 ℃全黑暗恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌株ZY5的微觀形態(tài)特征。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［18-19］將該分離致病菌株用顯微鏡觀察，根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定。

1.2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取DNA，生物工程（上海）股份有限公司合成的引物ITS1和ITS4（靶標(biāo)ITS區(qū)域）以及Bt2a和Bt2b（靶標(biāo)β-tubulin基因），對致病菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。擴(kuò)增體系（50 μL）：Tap PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，dd H2O 19 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；

最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后將合格產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，用軟件MEGA 7進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測定

菌株ZY5回接致病性驗(yàn)證，結(jié)果表明，對照未接菌的幼苗基本未發(fā)病（圖1a），幼苗蘸根接種后，幼根均變褐，發(fā)病較重（圖1b），癥狀表現(xiàn)與田間癥狀一致（圖1c）。對接種發(fā)病的幼根經(jīng)再分離，獲得的菌落與初分離得到的菌相同，確定菌株ZY5為高粱根腐病的致病菌。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

ZY5在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，菌落直徑63～65 mm；菌絲灰白色；菌落正面絨狀，規(guī)則圓形，邊緣黃褐色，中間灰褐色（圖2A），背面深黃褐色至黑色（圖2B）。再放置室內(nèi)，室溫自然光照培養(yǎng)10 d，菌落背面逐漸變?yōu)樯罴t色，菌落中心出現(xiàn)不規(guī)則銹紅色分生孢子團(tuán)（圖2C）。挑取病菌顯微鏡觀察，病菌可產(chǎn)生厚垣孢子，單生或串生（圖2D～E），大小8～17 μm×10～12 μm；分生孢子梗具分枝（圖2F）；分生孢子長卵圓形（圖2G），無隔膜，大小2.0～3.0 μm×1.0～1.5 μm，初步鑒定為附球菌。

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用ITS基因和β-tubulin基因?qū)闦Y5的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證后送至生工公司測序，PCR產(chǎn)物的有效長度分別為500 bp和750 bp。

將ITS基因和β-tubulin基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，下載序列相似性為99%及以上，依據(jù)最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，通過自舉（bootstrap）對系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)。該菌株ITS基因序列（OK584736）與Epicoccum sorghinum（MN341233）、Epicoccum latusicollum（MH824373）、Epicoccum thailandicum（MN010545）聚為一支，不能具體確定到種。而其β-tubulin序列與高粱附球菌（Epicoccum sorghinum，MN218192）聚為一支，自展支持率為98%（圖3）。將菌株ZY5鑒定為高粱附球菌。

3 討論

已有研究表明引起高粱根腐病的病原菌有Fusarium spp.［9-11］、Pythium spp.［12］、Penicillium spp.［13］、Bipolaris sorokiniana、Alternaria alternata、Macrophomina phaseolina、Rhizoctonia sorghi和Phoma sorghina［14-16］等，高粱根腐病通常由多種土壤真菌復(fù)合侵染導(dǎo)致。本研究結(jié)合形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定出一株新的高粱根腐病致病菌高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）。國內(nèi)相關(guān)報道表明，高粱附球菌可侵染為害葫蘆科，禾本科水稻、玉米、慈竹、狗尾巴草，百合科黃花菜、吊蘭，豆科大豆、豇豆，馬齒莧科馬齒莧和莧科等植物，并引起植株葉部、莖部、根部的病害［21］。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，病原菌的鑒定不再僅僅是對其形態(tài)進(jìn)行觀察［22］，本研究提取了病原菌ZY5的ITS基因序列，并進(jìn)行BLAST比對，該菌株與Epicoccum sorghinum、Epicoccum latusicollum和Epicoccum thailandicum的同源性均為100%，不能鑒定到種。雖然大部分的致病菌可通過ITS序列鑒定［23-24］，但仍有部分種無法通過此方法鑒定［25］。相對ITS來說β-tubulin基因內(nèi)含子區(qū)域高度可變，進(jìn)化速率更快［26］，因此本研究又采用β-tubulin基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，病原菌與高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）聚為一支，自展支持率為98%，能明顯與其他種區(qū)分開來?？梢?，結(jié)合多基因序列分析是鑒定高粱附球菌較為理想的分子生物學(xué)手段。

4 結(jié)論

通過蘸根法確定ZY5為高粱根腐病的致病菌。ZY5經(jīng)PDA培養(yǎng)觀察形態(tài)特征，并基于ITS基因序列和β-tubulin基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將ZY5鑒定為高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）。研究結(jié)果可為了解引起高粱根腐病的病原種類及病害的防治奠定基礎(chǔ)。

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Identification of a Pathogen Causing Root Rot Disease in Sorghum

ZHANG Huan， CAO Shang， FAN Xinyu， ZHANG Meiqi， CHEN Xuemei， ZHAN Xin， GUO Yongxia

（College of Agriculture，Heilongjiang Bayi Agricultural University/National Coarse Cereals Engineering Research Center， Daqing 163319， China）

Abstract：In order to identify the pathogen species of a separated sorghum root rot， the dipping root inoculation method was used to verify Koch’s postulates， and the fungus was identified based on the analysis of ITS and β-tubulin gene sequences， combined with morphological characteristics. The results indicated that the colony of strain ZY5 was velvety on the front， regular and circular， with a yellow brown color." The reverse side of the colony was dark yellow brown to black. Chlamydospores were either solitary or in chains， and sized 8-17 μm×10-12 μm. Conidia were oval-shaped， aseptate， and sized 2.0-3.0 μm×1.0-1.5 μm. The phylogenetic tree constructed based on β-tubulin sequences grouped ZY5 closely with Epicoccum sorghinum， with a support rate of 98%. Based on morphological characteristics and the constructed phylogenetic tree， strain ZY5 was identified as Epicoccum sorghinum. This is the first report domestically and internationally of Epicoccum sorghinum causing sorghum root rot.

Keywords：sorghum; root rot disease; Epicoccum sorghinum; pathogen identification