水稻紋枯病拮抗內生菌的分離鑒定及防控效果

摘要：水稻紋枯病嚴重危害水稻生產，為拓展水稻紋枯病的生防菌資源，從抗性品種水稻葉鞘中分離篩選獲得對水稻紋枯病菌有生防效果的內生細菌。采用平板對峙試驗、菌核萌發(fā)試驗、離體葉片試驗和盆栽試驗，研究篩選得到的內生細菌對紋枯病菌室內和室外的防治效果。結果表明，篩選獲得的12株內生菌中7株內生細菌對水稻紋枯病菌有顯著的生防效果，其中5株對菌絲生長抑制效果超過55%。黏質沙雷菌Y3對水稻紋枯病菌菌絲生長和菌核萌發(fā)均有抑制效果，其對水稻離體葉片抑制率為39.21%，盆栽抑制率為29.62%，且對水稻無害。黏質沙雷菌Y3可以作為生物防治劑應用于水稻紋枯病生物防控。

關鍵詞：內生細菌；水稻紋枯??；黏質沙雷菌；生物防控

收稿日期：2025-01-10

基金項目：重慶市自然科學基金（CSTB2023NSCQ-LMX0036）； 國家自然科學基金（32072406）。

第一作者：蔣世琦（1999-），女，碩士研究生，從事植物病害生物研究。E-mail：xiaojiangshiqi@126.com。

通信作者：陳井生（1982-），男，博士，副研究員，從事植物病害生物研究。E-mail：jingshengchen@sanxiau.edu.cn。

由立枯絲核菌（Rhzioeotnia soalni）引起的水稻紋枯?。╮ice sheath blight）通過產生RS毒素侵染植物機體導致水稻米粒不飽滿、植物倒伏、干燥缺水最終導致水稻減產［1-2］。水稻紋枯病最早在1910年初由龔齋在日本發(fā)現，1934年植物病理學家魏京超首次在中國發(fā)現該病害。有機砷、己唑醇等化學農藥都曾用于水稻紋枯病的防治，但其毒性較大且容易引起有害生物的抗藥性［3］。目前研究尚未發(fā)現對水稻紋枯病高抗性品種和主效抗性基因［4-5］，自井岡霉素研制以來，一直以高效性、持效長、毒性低、安全性高的特點廣泛用于水稻紋枯病的防治［6-7］，但長期大量使用井岡霉素是否會引起水稻紋枯病菌產生抗藥性仍是困擾農業(yè)生產的問題。

生物農藥相較傳統(tǒng)化學農藥安全性較高、對環(huán)境污染較小、開發(fā)成本較低［8］，木霉菌［9-10］、鏈霉菌［11］、芽孢桿菌［12］等均對水稻紋枯病有一定的防治效果。在以往的報道中，水稻紋枯病生防菌多分離自水稻根際土壤，相較于根際土壤細菌植物內生菌生存競爭較少，受外部環(huán)境影響較?。?3］，Sunera等［14］從水稻根、莖、葉中鑒定出4株內生芽孢桿菌在體內和體外條件下均可防病促生，Li等［15］報道接種內生菌對水稻生長產生了有益影響，Li等［16］認為水稻根系內生菌參與了水稻代謝途徑和不同的營養(yǎng)模式改善其防御系統(tǒng)。微生物農藥可以最大程度減少農藥使用過程中對人和環(huán)境的有害影響，植物內生菌可以促進植物生長、緩解生物脅迫，是很好的微生物農藥來源。

本研究從抗性水稻品種‘YSBR1’葉鞘中分離篩選出一株內生生防菌株，通過平板對峙、菌核生長、離體葉片和溫室盆栽試驗，測定其室內與室外防治效果，以期為水稻紋枯病防治的生物防控提供新資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：水稻紋枯病菌由吉林農業(yè)大學提供，接種于PDA培養(yǎng)基，4 ℃冷藏保存。

供試植物：抗性水稻品種‘YSBR1’由揚州大學提供，用于內生細菌的分離；‘藝稻0618’采集于萬州附近農田，由重慶三峽學院實驗室培育保存，用于安全性試驗、離體試驗和盆栽試驗。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基用于內生細菌培養(yǎng)和保存，馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基用于平板對峙、菌核培養(yǎng)試驗。

1.2 方法

1.2.1 內生細菌的分離

2023年6月采集重慶三峽學院病發(fā)試驗水稻田中健康植株的葉鞘進行生防細菌的分離。清水反復沖洗后，使用75%酒精對植株表面消毒1 min，無菌水漂洗5次。清洗完成的葉鞘瀝干水分后，剪碎置入無菌研缽加入10 mL無菌水充分研磨10 min，梯度稀釋為1.0×10-3的研磨液，吸取100 μL涂布于NB培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3 d挑選不同形態(tài)和顏色的菌落劃線純化后甘油超低溫保存。

1.2.2 生防細菌的篩選

參考魏松紅等［17］的方法，采用平板對峙法篩選水稻紋枯病生防細菌。打取直徑4 mm的水稻紋枯病菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，挑取1.2.1分離的內生菌單菌落在距離菌餅25 mm處呈“十”字向外作延長線，以只接種水稻紋枯病菌為對照。28 ℃，恒溫培養(yǎng)，分別在接種后24，30，36和48 h觀測菌落生長情況，記錄菌落直徑并計算抑制率。

抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/ （對照菌落直徑-菌餅直徑）×100

1.2.3 生防細菌對菌核萌發(fā)抑制效果測定

參考Yang等［18］的方法，將水稻紋枯病菌在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)10 d，收集菌核。將菌核浸泡在經過直徑0.22 μm細胞過濾器過濾獲得的無菌發(fā)酵液中30 min，自然晾干后將菌核接種到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。在顯微鏡低倍鏡下觀察并記錄菌核邊緣2 mm外的萌發(fā)菌絲數，計算菌核萌發(fā)率。

菌核萌發(fā)率（%）=∑（各級級值×該級菌落數）/（調查總菌落數×5）×100

1.2.4 生防細菌的鑒定

形態(tài)學鑒定：觀察培養(yǎng)皿內生防細菌菌落的形態(tài)、大小、顏色等性狀特征。采用革蘭氏染色法制備顯微鏡觀察樣本，在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

生理生化特性分析：參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對測定生防細菌進行生理生化特征分析。

分子生物學鑒定：（1）生防細菌基因組DNA的提取。使用天根生化科技有限公司的細菌DNA基因組提取試劑盒提取生防細菌基因組DNA。

（2）利用16S rDNA的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3′）對篩選出的生防細菌的基因組DNA進行PCR擴增。PCR擴增體系采用25 μL體系［19］。

（3）測序及系統(tǒng)發(fā)育分析。少量PCR產物用于凝膠瓊脂糖實驗驗證后，將剩余PCR產物送至生物工程科技公司進行測序。使用BLAST軟件與GenBank數據庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）記錄的16S rDNA序列進行同源性比較。采用鄰接法測定拮抗細菌與其他近親的系統(tǒng)發(fā)育親緣關系，利用MEGA 11軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 生防細菌的安全性測定

生防細菌對種子發(fā)芽率的影響：用75%酒精浸泡種子1 min后，用3%H2O2對種子表面消毒10 min，無菌水沖洗3次，再用無菌水浸泡24 h后將種子浸泡在1.0×108 CFU·mL-1生防細菌發(fā)酵液中30 min，以無菌水為空白對照，自然風干后用無菌培養(yǎng)皿和濕潤濾紙催芽3 d調查種子發(fā)芽率。

發(fā)芽率（%）=發(fā)芽種子數/供試種子總數×100

生防細菌對水稻幼苗的影響：酒精和3%過氧化氫消毒后，清水浸種24 h，分別用生防細菌和無菌水浸泡種子24 h，催芽后播種到穴盤，待稻苗插秧期調查生長指標，包括稻苗株高、葉齡、根長和根數。

1.2.6 生防細菌的防治效果測定

離體防治效果測定：取分蘗期等位且生長一致的健康水稻葉片，用2.5%次氯酸鈉消毒30 s，無菌水清洗3次，分別于濃度為1.0×108 CFU·mL-1的生防細菌發(fā)酵液和無菌水中浸泡20 min，取出葉片剪去兩端，分別置于鋪有無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿放置3片葉片，取培養(yǎng)2 d的直徑為4 mm的紋枯病菌菌餅，接種到水稻葉片中間，室溫培養(yǎng)7 d，觀察葉片發(fā)病情況，計算各處理相對病斑長度，各處理3次重復。

相對病斑長度（%）=病斑總長度/葉片總長度

防治效果（%）=（對照相對病情指數-處理相對病斑長度）/對照相對病斑指數×100

盆栽防治效果測定：選擇健康飽滿的水稻種子催芽，利用裝有無菌土的450 mm×335 mm×210 mm物流箱進行播種，置于室溫環(huán)境中培養(yǎng)。采用牙簽法在分蘗期水稻葉鞘中接種水搭配紋枯病菌。設置2個對照組：1.0×108 CFU·mL-1的生防細菌發(fā)酵液和無菌水，每個對照組1盆，每盆12株，3次重復。接種病菌24 h后分別噴施發(fā)酵液或無菌水，噴施到葉片向下滴水為止。調查并記錄噴施20 d后水稻植株的發(fā)病情況，計算病情指數和相對防治效果。

病情指數（%）=∑（各級病株數×該病級值）/（調查總株數×最高級值）×100

防治效果（%）=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100

1.3 數據分析

運用Minitab 21與Origin 2021程序開展統(tǒng)計解析，數據以均值和標準偏差呈現，采用單因素方差檢驗，不同組之間采用Fisher配對比較，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離

從健康水稻植株葉鞘樣本中共分離獲得12株內生細菌，分別命名為：F1～4、Y1～5、YW1、YW2和YW3。

2.2 生防細菌的篩選

以水稻紋枯病菌為指示菌，采用平板對峙法

對獲得的12株內生細菌進行初篩。由表1可知， 共有7株內生細菌對水稻紋枯病菌有抑制作用。菌株Y5、YW1、YW2、Y4、Y3對水稻紋枯病菌具有較強的抑制作用，抑制率超過55%，且抑制效果持續(xù)時間較長，48 h后仍可觀察到明顯的抑菌圈（圖1）。其余生防細菌雖然對水稻紋枯病菌有一定的抑制效果，但抑制效果持續(xù)時間較短，待病菌菌絲長至生防菌分布范圍以外仍可正常生長。

2.3 生防細菌對菌核萌發(fā)的抑制效果

由表2可知，Y4、Y5菌株發(fā)酵液可以有效抑制紋枯病菌菌核的萌發(fā)，菌核萌發(fā)率≤10%；Y3菌株發(fā)酵液對紋枯病菌菌核的萌發(fā)有一定的抑制效果，其菌核萌發(fā)率低于50%。其余菌株發(fā)酵液對菌核萌發(fā)幾乎沒有抑制效果。生防細菌Y3不但可以抑制菌絲生長，也可以影響菌核萌發(fā)，因此選用該菌株進行后續(xù)研究。

2.4 生防細菌的鑒定

2.4.1 形態(tài)學鑒定

菌株Y3在NB培養(yǎng)基上生長良好，菌落較小呈邊緣完整、表面光滑、不透明的乳白色圓形（圖2A）。經革蘭氏染色，菌株為革蘭氏陰性菌，菌體呈近球形短桿狀（圖2B）。

2.4.2 生理生化分析

菌株Y3接觸酶反應、淀粉水解、甲基紅試驗、V-P反應和氧化酶均為陽性，吲哚反應為陰性。在糖醇發(fā)酵試驗中，菌株Y3與甘露醇、葡萄糖反應均產酸不產氣。

2.4.3 分子生物學鑒定

通過BLAST比對構建進化樹，結合形態(tài)學和生理生化特征，判斷菌株Y3為黏質沙雷菌（Serratia marcescens）。

2.5 生防細菌的安全性測定

2.5.1 生防細菌對種子發(fā)芽率的影響

菌株Y3發(fā)酵液處理后的種子發(fā)芽率相較于空白對照組有一定的變化，但通過方差檢驗可知效果并不顯著，這表明Y3發(fā)酵液對水稻種子發(fā)芽并無顯著影響。

2.5.2 生防細菌對水稻幼苗的影響

菌株Y3發(fā)酵液處理后的水稻幼苗相較無菌水和NB發(fā)酵液有一定的變化，但變化并不顯著，說明Y3對水稻幼苗無顯著影響（表4）。

2.6 生防細菌的防治效果

2.6.1 離體防治效果

經Y3發(fā)酵液和無菌水處理后，水稻葉片相對病斑長度分別為16.71%和27.49%，Y3發(fā)酵液相較無菌水拮抗水稻紋枯病菌效果顯著，Y3發(fā)酵液對水稻紋枯病的離體抑制率為39.21%。

2.6.2 盆栽防治效果

在接種病原菌20 d后進行觀察對比，結果顯示，施用Y3發(fā)酵液處理的水稻植株相較于施用NB液體培養(yǎng)基處理的植株，發(fā)病程度顯著減輕（圖4），Y3發(fā)酵液對水稻紋枯病的盆栽防治效果為29.62%。

3 討論

內生菌與植物互利共生，它們從宿主植物獲得營養(yǎng)和保護的同時增強宿主對各種外界脅迫的抗性，利用內生菌防控植物病害是可持續(xù)農業(yè)發(fā)展的趨勢［20］。前人研究表明內生菌在植物病害防控中具有顯著效果，如張翠芳等［21］研究發(fā)現內生菌QNF1對褐腐病菌抑制率高達88.17%；劉建春等［22］從煙葉中分離的17株內生細菌對煙草常見病原真菌均有不同程度的抑制效果；張苗苗等［23］ 從無核白葡萄葉片中分離獲得的貝萊斯芽孢桿菌TLF對曲霉腐爛病菌的抑制率達68.26%；Wang等［24］從吉祥草莖中分離得到的內生貝萊斯芽孢桿菌YN-2-6S對白絹病和根腐病的防治效果分別為91.00%和85.71%；Khan等［25］研究發(fā)現

內生芽孢桿菌可以有效防治番茄斑萎病病毒并能增強植物生長參數。本研究表明，水稻葉鞘內生菌可以顯著防治水稻紋枯病菌，分離獲得的12株內生細菌中有7株內生細菌對水稻紋枯病菌有顯著的抑制作用，其中5株細菌的抑制率超過55%，這一結果與上述研究中的高效菌株抑制率相當，表明本研究所篩選的菌株具有良好的生防潛力。馬召等［26］將丹參根部分離出的3株內生菌對丹參進行灌根處理后發(fā)現3株內生菌均可顯著促進丹參生長。Castillo-Texta等［27］從鱗葉牽牛中獲得的內生菌可以顯著促進擬南芥植物生長。本研究中，內生菌黏質沙雷菌Y3可以影響水稻發(fā)芽和幼苗生長，但效果并不顯著。這證明分離獲得的內生菌黏質沙雷菌可作為一種對植物無害的、綠色、生態(tài)農藥投入未來水稻紋枯病生物防控的進程中。

沙雷菌是一種昆蟲共生菌，對植物病原真菌、線蟲以及農業(yè)害蟲均有一定的防治效果［28-29］。在過去的研究中，黏質沙雷菌被發(fā)現對桔梗根腐病的防效為44.44%，并具有潛在促生作用［30］，對P.digitatum 在內的 7 種植物病原真菌的抑制率高達74.68%［31］，可以顯著增強高粱對高粱根腐病的抗性并能促進其生長［32］，對南方根結線蟲致死率超過68%［33］，并可致白蟻頭部發(fā)紅并死亡［34］。Abiodun等［35］ 通過噴施菌懸液的方法發(fā)現黏質沙雷菌對水稻紋枯病有較強的防治效果，且能與多種植物共生，是一種很有潛力的生防細菌，但有關沙雷菌防治水稻紋枯病菌的研究較少。本研究發(fā)現，黏質沙雷菌Y3對水稻紋枯病菌菌絲生長抑制率達59.78%，離體抑制率為39.21%，盆栽抑制率為29.62%，黏質沙雷菌對水稻紋枯病菌有顯著的生防效果。本研究中的空白對照組的病情指數不高這是造成盆栽試驗防效較低的主要原因，這也從側面證明了合理排水、精心養(yǎng)護的農業(yè)防治手段可以一定情況下抑制水稻紋枯病的發(fā)生。實際農業(yè)生產中植物生長環(huán)境相較盆栽試驗更為復雜，本研究不能完全模仿實際情況還需后續(xù)進行田間試驗以進一步驗證防治效果。

4 結論

本研究自抗性品種水稻葉鞘中分離獲得的12株內生菌中有7株內生細菌對水稻紋枯病菌有顯著的生防效果，其中5株對菌絲生長抑制效果超過55%。內生細菌黏質沙雷菌Y3對水稻紋枯病菌的菌絲生長和菌核萌發(fā)均有顯著的抑制效果，對水稻離體葉片抑制率為39.21%，盆栽抑制率為29.62%，且對水稻植株生長沒有顯著影響，是一種安全、無害、綠色的生物防控資源。

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Isolation and Identification of Antagonistic Endophytic Bacteria and Its Effect on Rice Sheath Blight

JIANG Shiqi1， LUO Xin1， CHEN Liu1， XIE Dongchen1， SUN Miao1， CHEN Jingsheng1， XIAO Guosheng1， XUAN Yuanhu2

（1.College of Biology and Food Engineering， Chongqing Three Gorges University， Chongqing 404020， China; 2.State Key Laboratory of Elemento-Organic Chemistry， Nankai University， Tianjin 300071， China）

Abstract：Rice sheath blight seriously jeopardizes rice production. In order to expand the resources of biocontrol bacteria against rice sheath blight， antagonistic endophytic bacteria were isolated and screened from leaf sheaths of resistant rice varieties. The control effects of antagonistic endophytic bacteria on rice sheath blight by in vitro leaf test， sterile seedling test， pot experiment， and field experiment. The results showed that seven of the 12 endophytic bacterial strains obtained from screening had significant biocontrol effects on rice blast fungus， and five of them inhibited mycelial growth by more than 55%. Serratia marcescens Y3 inhibited both mycelial growth and mycorrhizal germination of rice blight. Its inhibition rate was 39.21% in isolated leaves and 29.62% in potted rice plants， and it was harmless to rice. Serratia marcescens Y3 can be applied as a biocontrol agent for the biological control of rice blight.

Keywords：endophytic bacteria; rice sheath blight; Serratia marcescens; biological control